Détection du signal RNA CISH : une technique pour détecter les signaux chromogènes lors de l’hybridation in situ de l’ARN dans des échantillons de tissus intacts

Pour détecter les signaux chromogènes lors de l’hybridation de l’ARN, commencez par prélever une coupe de tissu sur une lame de verre. Cette section contient de l’ARN cible, pré-hybridé avec une sonde d’ARN marquée à la peroxydase de raifort.

Versez quelques gouttes de diaminobenzidine ou DAB, un substrat de détection, sur la section de tissu et incuber.

Le DAB pénètre dans la cellule et l’enzyme peroxydase du raifort l’oxyde pour former un précipité brun. Cette réaction donne une couleur brune à des séquences d’ARN spécifiques dans la cellule. Les cellules qui ne contiennent pas d’ARN cible n’auront pas d’activité peroxydase et resteront non colorées.

Ensuite, contre-colorez la section de tissu avec de l’hématoxyline. L’hématoxyline se lie à l’ADN et confère une tache violette à la section du tissu.

Traitez la section de tissu avec de l’eau ammoniacale - une solution bleuissante. Il réduit l’intensité de la coloration violette, rendant les cellules bleues. Cette étape est essentielle pour une visualisation claire des taches brunes à l’intérieur des cellules.

Maintenant, immergez la section de tissu dans des concentrations croissantes d’éthanol et traitez-la ensuite avec du xylène - un solvant organique. Ces étapes déshydratent la section de tissu pour obtenir de meilleures images.

Enfin, scellez la lame à l’aide d’une solution de montage et d’une lamelle et visualisez-la au microscope optique. Les cellules présentent des points bruns ponctués indiquant la présence d’ARN cible.

Distribuez le même nombre de gouttes de chaque solution DAB-A et DAB-B dans un tube de taille appropriée pour produire environ 120 microlitres de substrat DAB par section et vortex. Prenez chaque diapositive, une à la fois, du support à glissières et tapotez et effleurez pour retirer l’excès de liquide, puis remettez-la dans le support à glissières. Pipetez environ 120 microlitres de mélange DAB sur chaque section de tissu, en vous assurant que les sections sont couvertes. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante et procéder à la contre-coloration.

Placez une goutte de support de montage par lame de verre, puis placez la lame sur les lames et laissez-les sécher à l’air. Après quelques heures, procédez à l’évaluation à l’aide d’un microscope optique tel que décrit dans le manuscrit.

• Chromogenic In Situ Hybridization (CISH) - Technique for detecting RNA or DNA sequences.
• Diaminobenzidine (DAB) - Detection substrate used in CISH testing.
• Horseradish Peroxidase - Enzyme that oxidizes DAB during RNA hybridization.
• Hematoxylin - Stain that binds to DNA during CISH technique.
• Chromogenic Materials - Substances that produce a colour when exposed to radiation.

• Introduce CISH - It's a molecular technique for detecting specific sequences of DNA or RNA (e.g., CISH testing).
• Key Concepts - Horseradish peroxidase oxidizes DAB to create a signal (e.g., CISH technique).
• Underlying Mechanisms - Staining and de-staining processes reveal target RNA (e.g., CISH staining).
• Connect to Experiment - Signals seen under microscope confirm presence of target RNA.

• What is CISH and how does it enable RNA and DNA detection?
• How does the oxidation of DAB works in the CISH technique?
• Why is the staining and de-staining process critical for the CISH procedure?

• Practical Applications - CISH testing aids in disease diagnostics (e.g., biomedical research).
• Industry Impact - Developments in diagnostic techniques (e.g., healthcare).
• Societal Importance - Improves disease detection rates (e.g., public health).
• Link to Scientific Advancements - Continued innovation in chromogenic materials and techniques.