Établissement d’un modèle de co-culture tridimensionnelle de ganglions de la racine dorsale murine et de cellules cancéreuses : un modèle in vitro pour étudier l’invasion des cellules cancéreuses périneurales

L’invasion périneurale ou PNI fait référence à la migration des cellules cancéreuses le long des nerfs et à leur invasion ultérieure dans le périneurium - un microenvironnement approprié pour la croissance du cancer et les métastases.

Pour imiter l’INP in vitro, commencez par ajouter une goutte de matrice extracellulaire ou de suspension ECM sur une boîte de culture de manière à ce qu’elle prenne la forme d’un hémisphère. Maintenant, incubez la boîte de culture pour renforcer les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de l’échafaudage 3D.

Ensuite, placez soigneusement un ganglion de la racine dorsale pré-récolté ou DRG, un groupe de neurones sensoriels, au centre de la gouttelette ECM semi-solide. Incuber pour intégrer le DRG dans la gouttelette ECM.

Par la suite, ajoutez un milieu de culture adapté et incubez. L’ECM supplémenté en nutriments favorise la germination de DRG en petites projections nerveuses appelées neurites qui poussent radialement vers la circonférence de la gouttelette.

Retirez le milieu usé pour préparer la gouttelette ECM pour le dosage ultérieur. Ensemencez des cellules cancéreuses adhérentes colorées par fluorescence sur la gouttelette. En raison de la forme hémisphérique, les cellules cancéreuses se retournent et s’installent le long de la périphérie des gouttelettes.

Incuber la boîte de culture pour permettre l’interaction cellule-neurite cancéreuse. Lorsqu’elles sont observées au microscope à fluorescence, les cellules cancéreuses peuvent être observées en suivant les neurites et en migrant vers le DRG, confirmant ainsi l’invasion périneurale.

Pour préparer les gouttelettes de matrice semi-solides, transférez une plaque de verre à fond de puits de glace sur un bloc de glace sous le microscope opératoire. Placez l’extrémité d’une pipette de 10 microlitres maximum directement sur le verre à un angle de 45 degrés et versez soigneusement une gouttelette de matrice de 1,5 microlitre sur le verre. Éloignez lentement la pointe de la pipette du verre à mesure que la matrice s’engage avec la plaque.

Déposez une gouttelette de matrice sur chacun des quatre coins de la plaque et transférez la plaque sur une surface à température ambiante pendant environ 1 minute. Lorsque la matrice s’est légèrement raidie, remettez la plaque dans le bloc de glace et utilisez une pince microscopique fermée pour ramasser doucement le DRG avec la main gauche.

À l’aide de la main droite, transférez soigneusement le tissu nerveux à la pointe d’une aiguille 21G et utilisez l’aiguille pour insérer doucement le DRG au milieu de la gouttelette matricielle. Le DRG doit se libérer facilement dans la matrice pour un positionnement central avec l’aiguille.

Après avoir inséré un morceau de DRG dans chacune des quatre gouttelettes, placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 3 minutes. Lorsque tous les DRG ont été intégrés, tenez les plaques une par une légèrement inclinées et ajoutez lentement 4 millilitres de DMEM complétés par 10 % de FBS aux plaques de sorte que le milieu n’entre en contact que progressivement avec les unités matrice-DRG.

Remettez les plaques dans l’incubateur pendant 48 à 72 heures supplémentaires. Lorsque les neurites atteignent au moins 75 % du chemin jusqu’au bord de la matrice, aspirez le milieu des puits sans retirer les unités matrice-DRG. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 200 microlitres avec une gâchette lisse, placez deux gouttes de 3 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre de milieu sur chaque test DRG matriciel et remettez les plaques dans l’incubateur. Après une heure, ajoutez doucement 4 millilitres de DMEM avec 10 % de FBS le long de la paroi latérale de la plaque à fond de verre et remettez les plaques dans l’incubateur jusqu’à leur prochaine évaluation microscopique.