Isolement des astrocytes : une méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes corticaux de souris

La culture in vitro d’astrocytes permet d’étudier le rôle biologique des astrocytes - les cellules cérébrales les plus abondantes.

Commençons par un cerveau de souris nouveau-née placé sous un microscope à dissection.

Retirez les bulbes olfactifs et le cervelet.

Effectuez une incision médiane entre les deux hémisphères pour séparer le cortex.

Retirez les méninges pour éviter la contamination de la culture d’astrocytes par les fibroblastes et les cellules méningées.

Transférez les hémisphères du cortex dans un milieu glacé et hachez-les en petits morceaux.

Recueillez les morceaux corticaux dans un tube contenant de la trypsine. La trypsine, une enzyme protéase, digère les protéines d’adhésion cellulaire, facilitant ainsi la séparation cellulaire.

Centrifugeuse pour granuler le tissu digéré.

Retirez le surnageant et ajoutez un milieu astrocytaire à la cuillère. Pipetez vigoureusement pour libérer une population cellulaire mixte d’astrocytes, de cellules microgliales et de cellules précurseurs d’oligodendrocytes ou OPC.

Ensemencez cette suspension cellulaire dans un flacon de culture tissulaire enrobé de polylysine et incubez.

Les cellules chargées négativement se fixent à la polylysine chargée positivement et se développent sur toute la surface pour former une couche confluente.

Agitez le ballon pour détacher la microglie et les OPC faiblement liés. Retirez le surnageant contenant les cellules détachées.

Ajoutez de la trypsine à la couche d’astrocytes. Récupérez les cellules et centrifugez.

Remettez la pastille en suspension et divisez les astrocytes en plusieurs flacons.

Enfin, évaluer la pureté de la culture d’astrocytes en immunomarquant des marqueurs spécifiques aux cellules.

Transférez la parabole contenant les cerveaux dans un stéréomicroscope. Ensuite, pour isoler les cortex, saisissez l’extrémité postérieure de chaque cerveau à l’aide d’une pince fine et effectuez une incision médiane entre les hémisphères.

Ensuite, insérez une deuxième paire de pinces dans le sillon créé et décollez la structure en forme de plaque du cortex du reste du cerveau.

Une fois que tous les cortex ont été isolés, décollez soigneusement les méninges du cortex en tirant avec la pince fine. Cette étape permet d’éviter la contamination de la culture finale d’astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes.

Transférez les hémisphères corticaux préparés dans un deuxième plat rempli de HBSS réfrigéré et placez-les sur de la glace. Continuez en conséquence avec les quatre cortex. Enfin, coupez chaque hémisphère en quatre à huit petits morceaux à l’aide de lames tranchantes.

Dans des conditions stériles, transférez les morceaux de cortex dans un tube Falcon de 50 millilitres et ajoutez HBSS à un volume final de 22,5 millilitres. Ensuite, ajoutez 2,5 millilitres de trypsine à 2,5 %.

Remettez le bouchon, mélangez et incubez le mouchoir dans le bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Mélanger en secouant toutes les 10 minutes. Ensuite, après une centrifugation de 5 minutes à 300 x g pour granuler les morceaux de tissu du cortex, décantez soigneusement le surnageant.

Ajoutez 10 millilitres de milieu de placage d’astrocytes à la pastille et utilisez une pipette de 10 millilitres pour pipeter vigoureusement le milieu contenant le tissu de haut en bas 20 à 30 fois jusqu’à ce qu’une suspension de cellule unique soit obtenue.

Ensuite, ajoutez un milieu de placage d’astrocytes à un volume final de 20 millilitres et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé selon les procédures standard.

Une préparation de quatre cortex de petits de souris devrait donner 10 à 15 fois 10 à la sixième cellule unique dissociée. Enfin, aspirez la poly-D-lysine d’un flacon préalablement préparé et transférez la suspension cellulaire dissociée dans le ballon.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 2 jours, puis changer de milieu. Le support doit ensuite être changé tous les 3 jours par la suite.

L’astrocyte doit apparaître confluent avec une couche sus-jacente de microglie après 7 à 8 jours de culture. À ce stade, placez le ballon T75 sur un agitateur orbital réglé à 180 rotations par minute pendant 30 minutes pour éliminer la microglie.

Jetez le surnageant contenant la microglie ou faites-le tourner et plaquez-le pour la culture. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de milieu de culture d’astrocytes frais et continuez en agitant le ballon à 240 tr/min pendant 6 heures pour éliminer les cellules précurseurs des oligodendrocytes.

Étant donné que certains OPC ne se détachent pas complètement de la couche d’astrocytes, continuez à agiter vigoureusement à la main pendant 1 minute afin d’éviter la contamination des OPC. Encore une fois, jetez le surnageant ou faites-le tourner sur une assiette pour cultiver des OPC.

Rincez deux fois la couche d’astrocytes confluents restante avec du PBS. Aspirez le PBS et ajoutez 5 millilitres de trypsine-EDTA. Incuber dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.

Vérifiez le détachement des astrocytes toutes les 5 minutes et appliquez le détachement des astrocytes en frappant la fiole contre la paume de votre main deux à trois fois.

Une fois que les astrocytes se sont détachés de la fiole, ajoutez 5 millilitres de milieu de culture d’astrocytes. Faites tourner les cellules à 180 x g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant et ajoutez 40 millilitres de milieu de placage d’astrocytes frais.

Une fiole T75 de cellules corticales mixtes devrait donner environ 1 fois 10 aux sixièmes cellules enrichies en astrocytes après le premier passage.