Isolement de cellules cérébrales à partir de larves de poisson-zèbre : une technique pour obtenir des neurones, des macrophages et des microglies intacts à partir de tissu cérébral de poisson-zèbre

Le cerveau du poisson-zèbre est constitué de neurones - des cellules nerveuses qui jouent un rôle important dans le traitement de l’information. De plus, il comprend une population de cellules immunitaires de soutien, y compris des macrophages et des microglies, qui habitent l’espace interneuronal.

Pour isoler tous ces types de cellules cérébrales d’un poisson-zèbre, il faut d’abord prendre des larves de poisson-zèbre anesthésiées dans une boîte de Pétri contenant un milieu approprié.

Visualisez le poisson-zèbre au microscope stéréoscopique et transectez les têtes larvaires au-dessus du sac vitellin pour garder le cerveau intact.

Transférez les têtes excisées dans un homogénéisateur rempli de milieux pré-refroidis, placé sur de la glace. Les basses températures aident à prévenir la dégradation des cellules cérébrales.

À l’aide d’un pilon, homogénéisez le tissu cérébral du poisson-zèbre. L’homogénéisation désintègre la matrice extracellulaire et initie la dissociation des neurones, des macrophages et de la microglie du tissu cérébral.

Cette étape sépare également la myéline - une couche isolante riche en lipides - des neurones.

Passez l’homogénat dans une passoire pour piéger les gros amas de cellules.

Centrifuger le filtrat pour granuler les cellules et les fragments de gaine de myéline. Jetez le surnageant contenant des débris.

Remettez le granulé en suspension dans un milieu à gradient de densité approprié et recouvrez-le d’un tampon.

Faites pivoter le tube à basse vitesse. Les fragments de myéline plus légers forment une bande distincte à l’interface du milieu tampon et du milieu à gradient de densité, tandis que les cellules plus denses se déposent au fond.

Aspirez les couches supérieures et remettez en suspension les cellules cérébrales dans un milieu frais pour une utilisation ultérieure.

Ajouter 1,5 millilitre de tricaïne de 15 millimolaires pour 50 millilitres de tricaïne moyenne à 50 larves pour préparer l’anesthésie. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de 3 millilitres, transférez 10 larves à la fois dans une boîte de Pétri de 55 millimètres remplie d’un milieu E3 glacé avec de la tricaïne pour les anesthésier en phase terminale.

À l’aide d’un stéréomicroscope, alignez 10 larves au centre de la boîte de Pétri. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, transectez les têtes larvaires au-dessus du sac vitellin.

À l’aide d’une pipette Pasteur de 3 millilitres, prélever toutes les têtes, et avec le moins de liquide possible, les transférer dans un homogénéisateur en verre sur de la glace contenant 1 millilitre de Média A glacé.

Remplacez chaque petite boîte de Pétri contenant de l’E3 plus Tricaïne glacé par une nouvelle toutes les 30 minutes pour vous assurer que la transsection est effectuée dans un milieu E3 plus Tricaïne froid.

Remplacez le média A glacé dans l’homogénéisateur en verre lorsque la couleur commence à s’estomper. Une fois que tout le groupe de têtes a été collecté, retirez tout le média A de l’homogénéisateur en verre et remplacez-le par 1 millilitre de média A frais et glacé.

Avec l’homogénéisateur toujours sur la glace, utilisez un pilon bien ajusté pour perturber le tissu cérébral en effectuant 40 séries d’écrasement et de retournement pour 3 à 5 larves de dpf et 50 tours pour les larves de 7 et 8 dpf.

Ensuite, ajoutez 2 millilitres de média A à la suspension cellulaire pour diluer les cellules et réduire leur agglomération avec de la myéline. Éliminez l’agglomération cellulaire en faisant passer la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube faucon froid de 50 millilitres sur de la glace. Répétez cette étape trois fois.

Transférez 1 millilitre d’aliquotes de suspension cellulaire dans des tubes froids de 1,5 millimètre et faites-les tourner à 300 x g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec l’aiguille 23G x 1", retirez le surnageant.

Avec 1 millilitre de milieu glacé à gradient de densité de 22 %, doucement recouvert de 0,5 millilitre de 1x DPBS glacé, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire. Faites tourner les tubes à 950 x g sans pause et accélérez lentement à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Après l’essorage, jetez le milieu de gradient de densité DPBS et la myéline piégée à l’interface. Ensuite, utilisez 0,5 millimètre de média A avec 2 % NGS pour laver les cellules et faire tourner les tubes à 300 x g à 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Retirez autant de surnageant que possible, puis rassemblez les pastilles de cellules des mêmes conditions expérimentales dans 1 millilitre de milieu A avec 2 % de NGS.

Si les cellules d’intérêt expriment une protéine fluorescente, faites passer la suspension cellulaire à travers un capuchon de crépine cellulaire de 35 microns et transférez-les dans des tubes FACS froids de 5 millilitres sur de la glace à l’abri de la lumière.