Réaction en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes : une méthode pour générer des réactions PCR de nanogouttelettes pour détecter des mutations tumorales rares

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0 vues • 4:07 min • July 8th, 2025

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La technologie dPCR (réaction en chaîne par polymérase numérique par gouttelettes) divise les réactifs d’une seule réaction PCR en millions de réactions PCR de nanogouttelettes. Cette partition de masse suivie d’une amplification détecte une quantité infime d’ADN mutant sur un large fond d’ADN de type sauvage, permettant une détection précoce du cancer.

Pour commencer, aspirez un mélange maître dPCR contenant des oligonucléotides marqués par fluorescence ainsi que d’autres réactifs PCR et une huile stabilisatrice de gouttelettes. Ajoutez ce mélange principal directement au fond de chaque puits dans un tube de bandelette PCR pour éviter les bulles d’air. Ensuite, ajoutez des échantillons d’ADN au mélange réactionnel et pipetez plusieurs fois pour mélanger.

Maintenant, transférez l’intégralité du mélange réactionnel dans une puce spécialisée d’un instrument générateur de gouttelettes. Montez un tube de bandelette PCR fraîche sur l’instrument générateur de gouttelettes. Le générateur de gouttelettes combine l’échantillon et l’huile pour former des nanogouttelettes discrètes avec une zone encapsulée qui empêche la contamination croisée entre les gouttelettes.

Une fois la gouttelétisation terminée, transférez le tube de la bandelette PCR dans un thermocycleur pour amplifier l’ADN cible. Ensuite, chargez le produit PCR dans un lecteur de gouttelettes contenant un détecteur de fluorescence, qui compte les gouttelettes fluorescentes positives et négatives. Le nombre de gouttelettes positives peut être utilisé pour calculer la concentration d’ADN cible dans l’échantillon.

Avant de commencer la procédure de PCR numérique par gouttelettes, nettoyez l’espace et l’équipement de la paillasse avec de l’eau de Javel à 10 % et de l’éthanol à 70 %, puis utilisez un tourbillon doux et centrifugez brièvement tous les réactifs, à l’exception de l’huile stabilisatrice de gouttelettes. Confirmer que la bouteille d’azote gazeux comprimé est fixée à l’instrument générateur de gouttelettes et que le réservoir de la bouteille est réglé à 90 livres par pouce carré. Ajoutez 38 microlitres de mélange réactionnel PCR numérique directement au fond de chaque puits d’une bande de tube PCR à 8 puits, en éliminant toutes les bulles avec une pointe de pipette propre.

Ajoutez 12 microlitres d’échantillon d’ADN pré-amplifié en trois exemplaires dans les puits appropriés de la bande de tubes. Pipetez doucement le volume total 10 fois pour mélanger le mélange réactionnel avec l’échantillon d’ADN et pipetez le volume complet de chaque puits dans les canaux A à H correspondants d’une puce d’instrument génératrice de gouttelettes. Insérez une nouvelle bandelette de tube PCR dans l’instrument générateur de gouttelettes et scannez l’ID de la puce de l’instrument générateur de gouttelettes dans le logiciel de l’ordinateur de l’instrument.

Ensuite, cliquez sur « Démarrer la course » pour commencer à déposer des échantillons. Lorsque la gouttelette est terminée, retirez la bande de tube PCR et appliquez les capuchons de la bande de tube. Transférez la bande tubulaire dans un thermocycleur et équilibrez la bande tubulaire avec une autre bande tubulaire contenant 80 microlitres d’eau par puits. Ensuite, faites fonctionner le thermocycleur dans les conditions de cycle thermique appropriées. Remplacez les capuchons de bande par des capuchons à grande vitesse.

Lorsque le cycle thermique est terminé, transférez la bande tubulaire dans l’instrument de quantification. Cliquez sur « Configurer un cycle » dans le logiciel de l’instrument et placez la bande de tube dans l’instrument de quantification. Placez le bouclier métallique sur une nouvelle puce d’instrument de quantification. Scannez l’ID de la puce dans l’instrument et insérez-la dans la machine. Fermez le couvercle de l’instrument. Dans le logiciel de l’ordinateur, entrez un nom pour l’exécution de la PCR numérique et pour chacune des huit voies. Ensuite, sélectionnez « Mode rapide » et cliquez sur « Démarrer » pour commencer la quantification.

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Dernière mise à jour : 22 août 2026