Induction du glioblastome à l’aide de la transposition médiée par SB : une technique de génération d’un nouveau modèle de souris à l’aide de l’intégration médiée par transposon du plasmide SB dans le cerveau d’une souris néonatale

Commencez par prendre un tube contenant un mélange de plasmides. Le plasmide de la belle au bois dormant ou transposon SB est conçu pour porter un élément transposable comprenant un oncogène induisant le glioblastome d’origine humaine pris en sandwich entre deux séquences répétées inversées. De plus, ce mélange contient un plasmide de transposase SB qui possède un élément exprimant l’enzyme transposase.

Maintenant, ajoutez un réactif de transfection approprié dans le tube. Aspirez le mélange d’injection dans une seringue munie d’une micro-aiguille. Ensuite, fixez un bébé souris anesthésié en position couchée sur un cadre stéréotaxique. Visualisez la région de la tête du chiot pour localiser les sutures crâniennes. Positionnez la micro-aiguille au-dessus des sutures crâniennes.

Injectez le mélange dans le ventricule latéral - une cavité à l’intérieur du parenchyme cérébral. Par la suite, la solution est dispersée dans le parenchyme cérébral, où les molécules réactives de transfection facilitent l’entrée des plasmides dans les cellules. Une fois à l’intérieur de la cellule, le plasmide transposase exprime les molécules de l’enzyme transposase, qui reconnaissent les séquences répétées inversées et excisent l’élément transposon.

L’élément transposable ADN se réintègre ensuite dans la région de répétition TA de l’ADN génomique du chiot. La transposition génétique entraîne une transformation oncogénique des cellules cérébrales, conduisant au développement d’un glioblastome dans le cerveau de la souris.

3 à 4 semaines avant l’expérience, installez une cage d’élevage de souris avec un mâle et une femelle. Incluez un igloo en plastique coloré pour enrichir l’environnement et augmenter les chances d’accouplement. Retirez le mâle une fois qu’une grossesse a été confirmée et, 18 jours après le jour de l’accouplement, commencez à surveiller la femelle pour l’accouchement. Assurez-vous qu’une mère porteuse est disponible au moment de l’accouchement.

Le premier jour postnatal, effectuez les injections intraventriculaires. Préparez la solution d’injection en aliquotant d’abord 20 microlitres du mélange d’ADN contenant les plasmides de transposon à une concentration finale de 0,5 microgramme d’ADN par microlitre. Ensuite, ajoutez une aliquote de 20 microlitres de solution PEI à la solution d’ADN et laissez-les incuber à température ambiante pendant 20 minutes à une heure, après quoi le mélange doit être stocké sur de la glace.

Pour l’aiguille d’injection, fixez une seringue de 10 microlitres à une aiguille hypodermique de calibre 30 biseautée à 12,5 degrés. Ensuite, fixez la seringue à une pompe à injection automatique. Testez l’installation avec 10 microlitres d’eau et assurez-vous de vider la seringue. Maintenant, refroidissez le stade stéréotaxique néonatal avec une bouillie de glace sèche et d’alcool. Lorsqu’il est refroidi entre 2 et 8 degrés Celsius, procédez aux injections.

Anesthésie un chiot en le plaçant sur de la glace pendant 2 minutes. Pendant que le chiot est sur de la glace, chargez la seringue avec la solution d’injection. Une fois anesthésié, transférez le chiot dans le cadre et immobilisez sa tête entre les barres d’oreille recouvertes de gaze. Vérifiez que la face dorsale du crâne est horizontale et parallèle à la surface du cadre. De plus, les sutures crâniennes doivent être clairement visibles.

Si la tête du chiot n’est pas immobilisée assez fermement, elle se déplacera lors de l’injection, tandis que si elle est serrée trop fermement entre les barres d’oreille du cadre, le lambda ne sera pas visible et la pression à l’intérieur de la tête forcera la solution injectée à s’échapper.

Avec le chiot fermement agrippé par le cadre, essuyez la tête avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, abaissez l’aiguille et ajustez sa position pour qu’elle entre en contact avec le lambda. Ensuite, soulevez l’aiguille et déplacez-la de 0,8 millimètre latéralement et de 1,5 millimètre vers l’extérieur. Ensuite, abaissez-le à nouveau jusqu’à ce qu’il creuse légèrement la peau. Notez les coordonnées de cette position. Ensuite, abaissez l’aiguille de 1,5 millimètre à travers la peau et le crâne et dans le cortex au niveau du ventricule latéral.

Là, injectez 0,75 microlitre en 90 secondes et attendez une minute pour laisser la solution se disperser. En attendant, le prochain chiot à injecter peut être anesthésié. Après l’attente, soulevez lentement l’aiguille. Ensuite, transférez le chiot dans un lieu de récupération sous une lampe chauffante. Le temps entre l’anesthésie et le réchauffement doit être inférieur à 10 minutes ; le plus vite sera le mieux.

Surveillez sa respiration et, si nécessaire, frottez doucement les membres pour stimuler la respiration. Une fois que le chiot est réchauffé, a une couleur rose et une respiration régulière, rendez-le à sa mère.