Name: Isolement et caractérisation de lARN-Contenant exosomes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Apprenez l'isolement et la caractérisation d'exosomes contenant de l'ARN à partir de milieux de culture cellulaire et de fluides biologiques. Ces méthodes d'ultracentrifugation et d'analyse moléculaire facilitent l'étude des fonctions biologiques des exosomes.

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Cette étude a été financée par le Conseil suédois de la recherche (K2008-57X-20 676-01-3).

1. L'isolement Exosome <ol><li> Cultiver des cellules dans un milieu avec exosomes sans sérum. Ainsi, tout sérum ajouté au milieu de culture cellulaire devrait être épuisée d'exosomes par ultracentrifugation à 120 000 xg pendant la nuit à 4 ° C avant utilisation. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à tubes coniques. </li><li> Centrifuger à 300 xg pendant 10 minutes à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Transférer le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation et s'il n'est pas complètement plein ajouter du PBS. </li><li> Centrifuger l'échantillon à 16 500 xg pendant 20 minutes à 4 ° C pour éliminer davantage les cellules et les débris cellulaires. </li><li> Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,2 um pour éliminer les particules plus grandes que 200 nm. </li><li> Transférer le surnageant filtré à des tubes d'ultracentrifugation nouvelles et sceller les tubes avant d'ultracentrifugation à 120 000 xg pendant 70 minutes à 4 ° C pour culotter les exosomes. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Pour la récupération maximale exosomes, remettre en suspension les exosomes d'enrichiréd granulés à plusieurs reprises dans un petit volume (~ 3 x 50 pi) d'un tampon approprié. Ce tampon dépend des expériences aval planifiée après l'isolement exosomes. Par exemple, un tampon de lyse est utilisé pour les protéines et l'isolement d'ARN, PBS est utilisé pour la microscopie électronique et la cytométrie en flux et pour les études fonctionnelles moyennes peuvent être préférés. </li></ol> Remarque: les exosomes peuvent également être isolés à partir des fluides corporels différents, tels que le plasma, en utilisant la même procédure que pour les milieux de culture cellulaire. Pour les fluides visqueux, il peut être nécessaire de diluer l'échantillon avec du PBS avant la centrifugation et filtration. En ce qui concerne la vitesse de centrifugation pour le point 5 ci-dessus, il peut être augmenté à 29 500 xg, et l'ultracentrifugation au point 7 peut être étendu à 90 minutes 18. Si l'échantillon doit être purifié davantage l'exosome culot peut être flotté sur un gradient de saccharose et les exosomes sera principalement trouvés dans la fraction representing une densité de 1.13 à 1.19 g / ml 2. 2. L'identification Exosome par microscopie électronique <ol><li> Afin d'éliminer les protéines contaminantes, remettre en suspension les exosomes enrichi culot dans du PBS et ultracentrifugation à 120 000 xg pendant 70 minutes à 4 ° C à re-sédimenter les exosomes. </li><li> Prenez une petite aliquote de l'échantillon pour l'isolement des protéines et de mesure des protéines totales. Assurez-vous que seule une petite partie de l'échantillon est lysé et utilisé pour la mesure de protéines et de garder intacts les exosomes, résolu dans le PBS, séparés sur la glace ou à -80 ° C pour d'autres expériences. </li><li> Déposer une goutte, environ 10 ug de protéine exosomales des exosomes intacte remis en suspension dans du PBS, sur un parafilm. Puis, avec une pince doucement la position d'une grille de nickel de carbone formvar couché sur le dessus de chaque goutte pendant 30-60 minutes. Assurez-vous que la grille est placée avec le côté face à la chute de revêtement contenant des exosomes. </li><li> Placez trois gouttes, chaque ul 30, de PBS sur le tIl Parafilm et laver la grille en séquentiellement positionnement de la grille sur le dessus des gouttelettes de PBS, et utiliser un papier absorbant entre les deux. Utilisez le papier absorbant délicatement tout en le tenant près de la côté de la grille, sans contact avec la surface revêtue. </li><li> Fixer l'échantillon par déposer une goutte de paraformaldéhyde 2% sur le Parafilm et le lieu de la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. </li><li> Répétez l'étape de lavage au point 4, avant immunomarquage avec un anticorps appropriés. Anticorps couramment utilisés sont les anti-CD63 et anti-CMH de classe II. La microscopie électronique peut également être effectuée sans que les exosomes immunomarquage peuvent être identifiés uniquement basée sur la taille et la morphologie. Cependant, nous recommandons d'évaluer la taille, la morphologie et la présence d'une protéine membranaire pour une validation plus concluants. </li><li> Transfert de la grille à une baisse de 30 pi de l'anticorps primaire de choix et incuber pendant 40 minutes. Laver en répétant le point 4, mais l'utilisation de 0,1% d'albumine sérique bovine dans le PBS au lieu de PBS seul. </li><li> Répétez le point 7, mais avec le 10 nm d'or anticorps secondaire marqué et se laver avec du PBS seul. </li><li> Post-fixer l'échantillon en ajoutant une goutte de glutaraldéhyde à 2,5% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. Répéter le lavage au point 4, mais utiliser cinq gouttes d'eau déminéralisée au lieu de trois gouttes de PBS. </li><li> Contraste de l'échantillon en ajoutant une goutte d'acétate d'uranyle 2% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 15 minutes. </li><li> Intégrer l'échantillon en ajoutant une goutte de méthyl-cellulose 0,13% et l'acétate d'uranyle 0,4% de la parafilm et incuber la grille sur le dessus de la chute pour 10 minutes. </li><li> Retirez l'excès de liquide par les délicatement en utilisant un papier absorbant, avant de positionner la grille sur un papier avec le côté enduit et laissez sécher à l'air pendant 5 minutes. </li><li> Examiner les préparatifs avec un microscope électronique ou stocker les grilles dans une case de la grille pour les travaux futurs. </li></ol> 3.Caractérisation Exosome par cytométrie en flux Comme les exosomes sont trop petites pour être détectées par des équipements de cytométrie de flux actuel, il est d'abord nécessaire de lier les exosomes à des billes revêtues d'anticorps (figure 1). Ces perles peuvent être achetés en tant que produit prêt à l'emploi ou de fait dans le laboratoire avec l'anticorps de choix. Selon l'origine exosomales cellulaire, différents anticorps peuvent être couplés à des billes qui peuvent être soit de caractère magnétique ou le latex. Nous utilisons actuellement anti-CMH de classe II ou anti-CD63 billes revêtues de cette analyse. <ol><li> Pour l'utilisation de la "maison" perles enrobées d'anticorps, nous utilisons quatre billes de latex um recouverte d'anticorps anti-CD63. Lavez 25 ul 4 billes de latex um (30 x 10 6 perles) deux fois dans 100 ul de tampon MES, 3 000 xg pendant 15-20 minutes et redissoudre le culot dans 100 pi de tampon MES. Préparer le mélange d'anticorps contenant un volume égal de 12,5 mg d'anticorps avec le même volume de tampon MES. Ajouter lesperles pour le mélange d'anticorps et incuber sous agitation pendant la nuit à température ambiante. Laver les billes revêtues d'anticorps à trois reprises avec du PBS (3 000 xg pendant 20 minutes) et de dissoudre le culot dans 100 ul de tampon de stockage (avec une concentration finale de 300 000 billes / pl). </li><li> Pour chaque échantillon (chaque anticorps), continuer avec un volume égal à un minimum de 30 ug de protéine exosomales (des exosomes intacte résolu dans le PBS) par ~ 100 000 perles enrobées d'anticorps. </li><li> Incuber les exosomes et des perles, dans un volume total de 300 ul de PBS, pendant la nuit à 4 ° C sous mouvement doux. </li><li> Bloc en ajoutant 300 pi de 200 mM de glycine et incuber pendant 30 minutes. </li><li> Lavez les complexes exosomes-billes à deux reprises en tampon de lavage (sérum de 1-3% dans le PBS), 600 g pendant 10 minutes. </li><li> Incuber les complexes exosomes-billes avec 50 ul d'anticorps IgG à 4 ° C. Lavez les complexes exosomes-billes à deux reprises en tampon de lavage comme décrit dans l'étape 5. </li><li> Ajouter 90 ul de tampon de lavage et 10 pld'anticorps de choix (idéalement anti-CD9, anti-CD63 ou anti-CD81) aux complexes exosomes-billes et incuber pendant 40 minutes sous mouvement doux. Lavez les complexes exosomes-billes deux fois dans le tampon de lavage comme décrit dans l'étape 5. </li><li> Ajouter 300 ul de tampon de lavage et d'acquérir des données en utilisant la cytométrie de flux. </li></ol> Comme discuté ci-dessus, des perles différentes peuvent être utilisées, telles que des billes de latex comme décrit dans le protocole ou des billes magnétiques. Si les billes magnétiques sont utilisés au lieu, s'il vous plaît noter que le protocole est légèrement différent. L'étape de blocage (point 4) Il n'est pas nécessaire et le lavage est effectué en plaçant le tube dans un support magnétique au lieu d'une centrifugation. Le tampon de stockage utilisé pour la "maison" perles d'anticorps enduit, contiennent 0,1% et 0,1% de glycine sodique azid dans du PBS, avec un pH de 7,2. Surtout, veillez à utiliser le sérum exosomes appauvri pour le tampon de lavage de cytométrie en flux (1-3% de sérum dans le PBS), pour éviter touteexosomes sérique contaminer l'analyse. Remarque: lors de l'exécution de caractérisation exosomes en utilisant des anticorps billes couplées, il est important de reconnaître que ce n'est qu'une sous-population spécifique, spécifique de l'anticorps utilisé, qui est isolé et caractérisé. 4. Détection Exosome par Western blot Western blot est une méthode bien établie et nous n'allons pas entrer dans les détails concernant la méthode elle-même, mais se concentrer sur l'importance d'un isolement de protéines appropriés avant la Western blot et les différents anticorps utilisés. <ol><li> Dissoudre le culot dans exosomes le tampon de lyse des protéines de choix et de pipetage à fond, suivi par vortex de mélange. Pour mieux lyser les exosomes, soniquer l'échantillon dans un bain d'eau 3 x 5 minutes avec vortex de mélange entre les deux. Enfin centrifuger l'échantillon, 13 000 xg pendant 5 minutes à température ambiante, et le transfert du surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. </li><li> Mesure de la protéine totale par une méthode de choix et de la charge de 20 à 50 mg de protéine par puits. </li><li> Séparer et transférer des protéines par électrophorèse sur gel et électrotransfert. </li><li> Bloc et laver la membrane avant d'effectuer immunomarquage contre les protéines enrichies en exosomes. </li><li> Détecter la protéine spécifique par chimiluminescence, le système d'imagerie numérique et des logiciels d'analyse. </li></ol> Comme il n'existe pas de marqueurs spécifiques exosomes, des protéines qui sont enrichis en exosomes, de toutes origines différentes cellulaire, sont couramment utilisés pour la détection des exosomes. Ce sont des protéines telles que les tétraspanines (par exemple CD9, CD63 et CD81), cytosquelette protéine associée (par exemple, ezrine) et les protéines impliqués dans la biogenèse multivésiculaires (par exemple TSG101 et Alix). D'autres protéines qui sont aussi couramment détecté dans les exosomes sont Flotillin, Hsc70 et des protéines Rab différentes, etc Toutefois, il ya aussi des cellules de protéines spécifiques dans les exosomes, comme A33 (cellules épithéliales intestinales), CD3(Cellules T) et du CMH de classe II (cellules présentatrices d'antigènes). Ainsi, en fonction de ce type de cellule les exosomes sont libérés à partir des marqueurs pour la détection peuvent varier. Comme les autres compartiments de la cellule peut également produire des vésicules, il est recommandé en outre de déterminer la présence de protéines à partir de ces compartiments tels que le réticulum endoplasmique (par exemple calnexine et GRP78) et l'appareil de Golgi (par exemple GM130). Ainsi, le manque de ces protéines indique une contamination peu ou pas de vésicules de d'autres compartiments de l'échantillon étudié. 5. L'isolement de l'ARN et l'ARN exosomales analyse <ol><li> Dissoudre le culot dans exosomes le tampon de lyse ARN de choix et d'effectuer l'extraction d'ARN. Différents kits d'isolement d'ARN peut être utilisé en fonction des expériences en aval, mais les méthodes colonne basée fournit des échantillons avec un spectre plus large de l'ARN. Nous utilisons actuellement Kit miRCURY Isolement de l'ARN par Exiqon, mais d'autres kits peuvent être adaptés en fonction de la scquestion ientific à portée de main. </li><li> Lorsque vous effectuez l'isolement d'ARN, il est important de travailler dans un environnement exempt de RNase. Par conséquent l'utilisation d'acides nucléiques et nucléase sans embouts de pipette et essuyez les deux banc et l'équipement exempt de contaminants et RNases. </li><li> Pour l'isolement d'ARN, en utilisant Kit miRCURY Isolement d'ARN, dissoudre le culot dans exosomes 350 pi de solution de lyse et d'effectuer le mélange vortex pendant 15 secondes. </li><li> Ajouter 200 pi d'éthanol à 95% et le vortex de mélange pendant 10 secondes. </li><li> Placer une colonne dans un tube de collecte et de transfert des exosomes lysées à la colonne et centrifuger 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Laver trois fois en ajoutant 400 pi de solution de lavage dans la colonne contenant l'ARN exosomales et centrifuger pendant 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Centrifuger la colonne pendant 2 minutes à 14 000 xg pour s'assurer que la colonne est sec et le lieu de la colonne sèche dans un tube Eppendorf sans RNase. </li><li> Ajouter 50 ul de tampon d'élution de la colonne et centrifuger pendant 2 minutes à 200 xg, suivi par 1 minute à 14 000 x g. </li><li> Continuer avec l'ARN isolé ou de le stocker dans -80 ° C. </li></ol> Pour la détection et l'analyse de l'ARN total extrait exosomales, utilisez un bioanalyseur Agilent 2100 avec le RNA 6000 Nano ou Kit Pico ARN 6000. L'analyse montre le rendement exosomales ARN et la distribution de taille. 6. Les résultats représentatifs Les exosomes sont trop petits pour être détectés par les méthodes de cytométrie en flux, et sont donc attachés à revêtues d'anticorps perles avant d'être analysés (figure 1). Comme exosomes-billes complexes peuvent agréger le nuage de cytométrie en flux peut contenir différentes populations de simple, double et triple perles (figure 2A). La flèche indique la seule perles qui sont encore analysés. Un CD63 positif unique de perles exosomes de la population par rapport à son contrôle isotypique est montré dans la figure 2B. e_content "&gt; En raison de la faible taille des exosomes, ils ne peuvent être directement visualisées par microscopie électronique, et non pas par microscopie optique. caractéristiques morphologiques typiques d'exosomes sont de forme ronde et de 30 à 100 nm des vésicules membranaires de taille. Dans la figure 3, la microscopie électronique photographies montrent des exosomes immunocolorés (A) avec de l'or-anticorps marqué pour le CD63 (indiqué par la flèche) et la non-immunocolorés exosomes (B). Afin de déterminer que les vésicules isolées sont en effet les exosomes et de mieux caractériser les protéines exosomales, Western blot est utilisé couramment. La figure 4 montre l'absence de la calnexine, un marqueur du réticulum endoplasmique. Cela indique une faible contamination des vésicules du réticulum endoplasmique. Par ailleurs, la figure 4 montre la présence de CD81 dans les exosomes, qui est une tétraspanine fréquemment enrichi en exosomes. L'ARN cellulaire contiennent principalements ARN ribosomal (ARNr), considérés comme les deux pics importants pour les sous-unités 18S et 28S rRNA dans une analyse Bioanalyzer (figure 5A). Toutefois, l'ARN exosomales diffèrent dans leur profil comme exosomes manque les deux pics ARNr (18S et 28S) et sont enrichies en ARN courts comme l'ARNm et miARN (figure 5B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. En raison de la faible taille des exosomes (30-100 nm), ils ne peuvent pas être distinguer du bruit et de fond lorsque analysés avec la cytométrie de flux. Par conséquent, il est nécessaire de les attacher à des billes revêtues d'anticorps avant la exosomes sont analysés, qui peuvent ensuite être visualisées par le laser. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les perles exosomes complexe peut agréger les uns avec les autres et former des billes doubles et triples (A). La flèche est la démonstration de la seule bille-exo une certaine population qui est fermée et utilisée pour une analyse ultérieure. Cette population sera directement comparée à un contrôle isotypique (rempli de gris de pointe) pour déterminer la présence de molécules de la membrane des exosomes. CD63 exosomes positifs (noir de pointe ouverte) sont présentés dans la figure B. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Les micrographies électroniques et des exosomes avec la morphologie typique et la taille (40-80 nm) (A et B). La flèche de la figure A indique la particule d'or de l'anticorps secondaire, vérifier que cette exosomes sont CD63 à sa surface de membrane. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Résultats de Western-blot montrant l'absence de la protéine de la calnexine réticulum endoplasmique, mais la présence de la protéine couramment enrichis en exosomes, tétraspanines CD81. ve_content "&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Des résultats montrant Bioanalyzer ARN présence dans les cellules (A) et les exosomes (B). Les flèches indiquent les sous-unités 18S et 28S ARNr présent dans les cellules. Comme exosomales ARN contiennent viril petit ARN ARNr peu ou pas est identifié dans les exosomes.

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</ol>

JL est un co-propriétaire d&#39;un brevet lié à l&#39;utilisation des exosomes comme vecteurs pour le transfert d&#39;ARN dans les cellules.

Lorsque l&#39;on étudie le contenu moléculaire et / ou la fonction des exosomes, il est crucial d&#39;utiliser une méthode d&#39;isolation de haute qualité qui offre un rendement approprié et le degré le plus bas possible de la contamination. La méthodologie décrite dans ce papier est une méthode bien établie pour isoler les exosomes et d&#39;étudier leur contenu en ARN et la fonction biologique. Par ailleurs, l&#39;importance de la caractérisation des exosomes isolés, par une combinaison de différentes méthodes, y compris la microscopie électronique, cytométrie en flux, et Western blot, est mis en surbrillance. Lorsque isoler les exosomes, la première phase de centrifugation (300 xg) est utilisé pour sédimenter les cellules qui pourraient être présents dans les cellules en suspension ou le fluide étudié biologique. La seconde centrifugation à 16 500 xg besoins d&#39;être suffisamment forte pour sédimenter les cellules mortes, les débris importants, les corps apoptotiques et d&#39;autres organites. Après cette centrifugation, certains protocoles comprennent une étape de nano-filtration, mais certains investigators avons exclu de cette étape. Toutefois, nous soulignons l&#39;importance de fragments de l&#39;éradication et des vésicules plus grandes que 200 nm et est donc fortement recommandé notamment une étape de filtration. Si une isolation plus strictes sont nécessaires, 100 nm filtres peuvent être utilisés, mais notez que si fluides visqueux sont utilisés, ces filtres peuvent facilement devenir bloqué et matériels exosomales est perdu. En outre, une filtration à 100 nm peuvent affecter la morphologie des exosomes et en outre si les exosomes sont sur la grande échelle, ils pourraient être perdus. Ainsi, les 200 filtres nm semble pas approprié pour l&#39;isolement exosomes. Après la filtration, l&#39;ultracentrifugation obligatoire à 120 000 xg est utilisé pour agglomérer les exosomes. Les exosomes peuvent encore être lavées avec du PBS, lié à des billes revêtues d&#39;anticorps et lavées, ou placé sur un gradient de saccharose pour éliminer les protéines de contamination. Toutefois, cela peut être un processus très consommateur de ressources que nous soutiennent ne pas être nécessaire, surtout si le volume de l&#39;échantillon de départ est faible et / ou la teneur en ARN of les exosomes est faible, comme des mesures supplémentaires seront de diminuer sensiblement le matériel supplémentaire. Toutefois, là encore, la nature des vésicules isolées doit être prouvée par la présence et l&#39;absence de certaines protéines. À ce jour, aucun marqueur protéique absolument unique pour les exosomes a été identifié pour vérifier que l&#39;échantillon contient des exosomes et rien d&#39;autre. En conséquence, une combinaison de méthodes sont nécessaires pour caractériser les exosomes, y compris la détermination de la taille et la morphologie des exosomes par microscopie électronique. En outre, la pureté de l&#39;échantillon peut être déterminée par microscopie électronique, que cette méthode peut fournir un aperçu du niveau de contamination de l&#39;échantillon, par exemple avec de grandes vésicules, telles que des microparticules, des corps apoptotiques ou des débris cellulaires. Par ailleurs, la teneur en protéines des exosomes peuvent être déterminées par cytométrie en flux et Western blot, et la combinaison de ces résultats deux méthodes dans une analyse de la membrane à la fois liés (par exemple CD63 etCD81) et intériorisé protéines (par exemple TSG101 et Alix) des exosomes. La détection des protéines enrichies en exosomes, comme CD63, TSG101 et Alix, et l&#39;absence de protéines tels que la protéine de réticulum endoplasmique calnexine, est une indication que l&#39;exosome enrichi granulés est en effet exosomes et de ne pas contaminer les vésicules d&#39;autres compartiments de la cellule. Le profil de l&#39;ARN qui est détecté dans les exosomes est fondamentalement différente de celle de l&#39;ARN dans les cellules intactes. Ainsi, l&#39;ARN exosomales analysés par bioanalyseur ou en gel à base d&#39;approches d&#39;analyse d&#39;ARN n&#39;ont pas les deux pics pour les sous-unités 18S et 28S ARNr, qui sont importants dans l&#39;analyse de l&#39;ARN cellulaire. Nous soutenons donc que la détection de quantités importantes de toute l&#39;ARNr dans un échantillon indique que l&#39;ARN total extrait n&#39;est pas d&#39;origine exosomales seul, et donc que la méthode d&#39;isolement doit être améliorée et la qualité assurée.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> L&#39;isolement Exosome </td></tr><tr><td> Optima L-90K Ultracentrifuger </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes d&#39;ultracentrifugation Quick-Seal </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Selon le rotor utilisé différents tubes sont nécessaires. Ti70 (342 414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Seal Tube Cordless Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur filtre seringue, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Pour les fluides visqueux et / ou des volumes importants, un système de filtration sous vide, 0,2 um, de VWR International peut être utilisé à la place (514-0600). </td></tr><tr><td> La microscopie électronique </td></tr><tr><td> Formvar / carbone grilles de nickel revêtement </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Souris anti-CD63 humain </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Contrôle isotypique; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Finale conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-souris conjugué d&#39;or, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Concentration finale: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega au microscope électronique </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> La cytométrie en flux </td></tr><tr><td> 4μm aldéhyde / sulfate de billes de latex </td><td> Dynamique interfaciale </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps pour le revêtement de l&#39;billes de latex </td><td></td><td></td><td> Par exemple anti-CD63 de BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-mixeur RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> IgG de sérum humain </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorps pour la détection </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Par exemple: PE anti-CD63 (556 020) de contrôle anti-CD9 PE (555 372) Isotype PE anti-CD81 (555 676) (555 749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> Ou matériel équivalent. </td></tr><tr><td> L&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;ARN exosomales analyse </td></tr><tr><td> miRCURY RNA Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyseur </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation de l&#39;arn-contenant exosomes

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Le domaine de la recherche exosomes est en pleine expansion, avec une augmentation spectaculaire dans les publications de ces dernières années. Ces petites vésicules (30-100 nm) d&#39;origine endocytique ont d&#39;abord été proposé à fonctionner comme un moyen pour les réticulocytes pour éradiquer le récepteur de la transferrine alors maturation dans les érythrocytes 1, et ont plus tard été nommé exosomes. Les exosomes sont formées par bourgeonnement vers l&#39;intérieur des endosomes, la production de corps multivésiculaires (MVBs), et sont libérés dans l&#39;environnement par la fusion des MVBs avec la membrane plasmique 2. Depuis la première découverte d&#39;exosomes, une large gamme de cellules a été démontré que la libération de ces vésicules. Les exosomes ont également été détectés dans plusieurs fluides biologiques, y compris le plasma, liquide de lavage nasal, la salive et 3-6 le lait maternel. Par ailleurs, il a été démontré que le contenu et la fonction des exosomes dépend de la cellule d&#39;origine et les conditions dans lesquelles ils sont produits. Une variété de fonctions ont été démonsconcentré pour les exosomes, telles que l&#39;induction de la tolérance contre l&#39;allergène 7,8, l&#39;éradication des tumeurs établies chez la souris 9, l&#39;inhibition et l&#39;activation des cellules tueuses naturelles 10-12, promotion de la différenciation en cellules régulatrices T 13, la stimulation de la prolifération des cellules T 14 et l&#39;induction de l&#39;apoptose des cellules T 15. Année 2007, nous avons démontré que les exosomes libérés par les mastocytes contiennent de l&#39;ARN messager (ARNm) et microARN (miARN), et que l&#39;ARN peut être la navette d&#39;une cellule à l&#39;autre via des exosomes. Dans les cellules du destinataire, l&#39;ARNm par les exosomes navette a été montré pour être traduit en protéine, ce qui suggère une fonction de régulation de l&#39;ARN transfert 16. En outre, nous avons aussi montré que les exosomes dérivés de cellules cultivées sous stress oxydatif peut induire une tolérance contre le stress supplémentaires dans les cellules receveuses et suggèrent donc une fonction biologique de la navette exosomales ARN 17. Milieux de culture cellulaire et biologique co fluidesntain un mélange de vésicules et de jeter des fragments. Une méthode de haute qualité d&#39;isolement pour les exosomes, suivie par la caractérisation et l&#39;identification des exosomes et leur contenu, est donc crucial de distinguer les exosomes d&#39;autres vésicules et des particules. Ici, nous présentons une méthode pour l&#39;isolement des exosomes de deux milieu de culture cellulaire et des fluides corporels. Cette méthode d&#39;isolement est basé sur la centrifugation répétée et étapes de filtration, suivie d&#39;une étape d&#39;ultracentrifugation finale dans laquelle les exosomes sont culottées. Important d&#39;identifier les méthodes les exosomes et de caractériser la morphologie et la teneur en protéines exosomales sont mis en évidence, y compris la microscopie électronique, cytométrie en flux et Western blot. La purification de l&#39;ARN total exosomales est basée sur la chromatographie colonne de centrifugation et le rendement exosomales ARN et la distribution de taille est analysé en utilisant un bioanalyseur.

Ce document démontre des méthodes pour l&#39;isolement, la purification et la détection des exosomes, ainsi que des techniques d&#39;analyse de leur contenu moléculaire. Ces méthodes sont adaptables pour l&#39;isolement des deux exosomes milieux de culture cellulaire et les fluides biologiques, et peut-delà de l&#39;analyse de contenu moléculaire également être utile dans les études fonctionnelles.

Isolement et caractérisation de l&#39;ARN-Contenant exosomes

Le domaine de la recherche sur les exosomes s'étend rapidement, avec une augmentation spectaculaire du nombre de publications ces dernières années. Ces petites vésicules (30-100 nm) de...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer si les cellules et les fluides biologiques d'intérêt libèrent ou contiennent des ARN présents dans des exosomes. La première étape pour isoler les exosomes consiste à éliminer les cellules et les débris cellulaires. Ensuite, le surnageant est filtré afin de retirer les particules plus grandes.Les exosomes sont ensuite mis en pellet par ultracentrifugation lors d'une deuxième étape. Les exosomes sont caractérisés par microscopie électronique, cytométrie en flux et analyse sanguine par immunotransfert afin de démontrer que les vésicules isolées possèdent la morphologie, la taille et la composition protéique typiques des exosomes. Ensuite, l'ARN est isolé à partir des exosomes purifiés.Afin de déterminer quel ARN contiennent les exosomes, les résultats obtenus grâce à ces méthodes bien établies de purification, de détection et de caractérisation des exosomes peuvent faciliter des études ultérieures sur les exosomes, comme leurs fonctions biologiques. Cette présentation montrera donc comment les exosomes peuvent être isolés par différentes méthodes, et les deux personnes qui présenteront cela sont mes deux étudiantes au doctorat, Maria, El et Cecelia. Euh. Bonne chance.La lignée cellulaire humaine HC one est utilisée pour cette démonstration d'isolement d'exosomes afin d'entamer la procédure d'isolement des exosomes. Dans un premier temps, cultivez les cellules dans un milieu contenant un sérum exempt d'exosomes. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans des tubes coniques et centrifugez à 300 ×g pendant 10 minutes à 4 °C.Pour faire précipiter les cellules, transférez le surnageant dans des tubes d'ultracentrifugation et centrifugez l'échantillon à 16 500 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius afin d'éliminer davantage les cellules et les débris cellulaires. Ensuite, filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,2 micron pour éliminer davantage les particules de plus de 200 nanomètres. Enfin, scellez les tubes d'ultracentrifugation contenant le surnageant filtré et ultracentrifugez à 120 000 ×g pendant 70 minutes à quatre degrés Celsius afin de faire précipiter les exosomes.Les exosomes sont récupérés en ouvrant la tube d'ultracentrifugation, en éliminant le surnageant et en resuspendant le culot enrichi en exosomes. Pour une récupération maximale des exosomes, resuspendre à plusieurs reprises le culot enrichi en exosomes dans un petit volume d'un tampon approprié dans un tube Eppendorf.Rincer deux fois avec un tampon supplémentaire du même volume que précédemment. Le tampon dépend du type d'expériences réalisées après l'isolement des exosomes. Pour la microscopie électronique, utiliser environ 10 microgrammes de protéine exosomale provenant des exosomes intacts.Resuspendre dans du PBS. Notre microscopie électronique sur grille de nickel recouverte de carbone peut être réalisée sans immunomarquage, car les exosomes peuvent être identifiés uniquement en fonction de leur morphologie et de leur taille. Toutefois, il est recommandé d'utiliser un anticorps primaire tel que l'anti-CD63 ou l'anti-MHC classe II, suivi d'anticorps secondaires marqués par de l'or de 10 nanomètres.Étant donné que les exosomes sont trop petits pour être détectés par les équipements actuels de cytométrie en flux, il est nécessaire de lier d'abord les exosomes à des billes revêtues d'anticorps. Selon l'origine cellulaire des exosomes, différents anticorps sont couplés à des billes magnétiques ou en latex. Dans cette démonstration, des billes en latex revêtues d'anticorps anti-CD63 seront utilisées pour chaque échantillon.Utilisez un volume équivalent à 30 à 40 microgrammes de protéine exosomale de l'exosome intact. Suspendez les exosomes dans des billes en PBS et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius sous agitation douce. Le jour suivant, bloquez en ajoutant 300 microlitres de glycine à 200 millimolaire et incubez pendant 30 minutes.Lavez le complexe de billes à exosomes deux fois, puis incubez les complexes de billes à exosomes avec 50 microlitres d'anticorps IgG à quatre degrés Celsius. Lavez les complexes de billes à exosomes deux fois, ajoutez 90 microlitres de tampon de lavage et 10 microlitres d'anticorps au choix aux complexes de billes à exosomes, puis incubez pendant 40 minutes à l'abri de la lumière. Sous agitation douce, lavez les complexes de billes à exosomes deux fois, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage, transférez les échantillons dans des tubes de cytométrie en flux et acquérez les données à l'aide de la cytométrie en flux.Cette démonstration de western blot mettra l'accent sur l'importance d'une isolation adéquate des protéines avant le western blot ainsi que sur les différents anticorps utilisés. Dissoudre le culot d'exosomes dans le tampon de lyse protéique choisi, puis pipeter soigneusement et mélanger au vortex afin de lyser davantage les exosomes. Soniquer l'échantillon dans un bain d'eau, centrifuger l'échantillon à 13 000 ×g pendant cinq minutes, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube Eppendorf. Mesurer la concentration totale en protéines selon la méthode choisie, puis charger les protéines sur le gel.Ensuite, séparez et transférez les protéines par électrophorèse sur gel et transfert électrophorétique, puis bloquez et lavez la membrane avant de réaliser une immunomarquage contre des protéines enrichies dans les exosomes, car il n'existe pas de marqueurs spécifiques aux exosomes. Les protéines enrichies dans les exosomes provenant de toutes origines cellulaires différentes sont couramment utilisées pour la détection des exosomes. Il s'agit notamment des tétrasapnines, par exemple CD9, CD63 et CD81.Des protéines associées au cytosquelette telles que l'ezrine et des protéines impliquées dans la biogenèse des multivésicules telles que TSG 1 0 1 et LY servent de contrôle négatif pour vérifier la présence de protéines contaminantes couramment retrouvées dans les vésicules provenant d'autres compartiments, comme la kexine et la GRP 78 du réticulum endoplasmique. Différents kits d'isolement de l'ARN peuvent être utilisés selon les expériences prévues. Dans cette démonstration, une méthode basée sur une colonne sera utilisée pour l'isolement de l'ARN.Il est important d'utiliser des pointes de pipette exemptes d'acides nucléiques et de nucléases et de nettoyer soigneusement le plan de travail et l'équipement pour éliminer les contaminants et les ARN. Dissoudre le culot d'exosomes dans 350 microlitres de solution de lyse et vortexer l'échantillon. Ajouter 200 microlitres d'éthanol à 95 % et mélanger à l'aide d'un vortex. Placer une colonne dans un tube de collecte et transférer les exosomes lysés sur la colonne, puis centrifuger. Laver trois fois avec 400 microlitres de solution de lavage afin de s'assurer que la colonne est sèche. Centrifuger deux minutes à 14 000 ×g après le dernier lavage et placer la colonne sèche dans un tube eppendorf RNAs free. Éluer l'ARN dans 50 microlitres de tampon d'élution pour la détection et l'analyse de l'ARN total extrait des exosomes.Un bioanalyseur Agilent 2100 peut être utilisé avec le kit RNA 6,000 nano ou RNA 6,000 pico, car les exosomes sont trop petits pour être détectés par les méthodes de cytométrie en flux disponibles. Ils sont fixés sur des billes revêtues d'anticorps avant leur analyse. Étant donné que ces complexes exosome-bille peuvent s'agréger en cytométrie en flux, le diagramme de dispersion peut contenir différentes populations de complexes exosome-bille simples, doubles et triples.Comme indiqué ici, la flèche indique la population de complexes individuels de billes et d'exosomes, qui correspond à la population faisant l'objet d'une analyse complémentaire. Un histogramme de cytométrie en flux montre une population de billes portant un seul exosome positive pour la protéine CD63. Plus la courbe ouverte est décalée vers la droite, plus l'échantillon est positif pour CD63.En raison de leur petite taille, les exosomes ne peuvent être visualisés qu'au microscope électronique. Les caractéristiques morphologiques typiques des exosomes incluent des vésicules sphériques de 30 à 100 nanomètres. Une immunomarquage d'exosomes avec un anticorps marqué or colloïdal dirigé contre CD63 est montré, indiqué par la flèche sur le Western blot.Les résultats montrent l'absence de la protéine du réticulum endoplasmique, la calnexine, dans l'échantillon exosomal, mais révèlent la présence de la tétraspanine CD81, une protéine couramment enrichie dans les exosomes. L'ARN cellulaire contient principalement de l'ARN ribosomique, visible sous forme de deux pics correspondant à la sous-unité 18 s d'ARN ribosomique située à gauche et à la sous-unité 28 s située à droite dans cette analyse sur bioanalyseur. Toutefois, les ARN exosomaux diffèrent dans leurs profils, car ils contiennent peu ou pas d'ARN ribosomique et sont enrichis en ARN courts, tels que l'ARN messager et l'ARN micro.L'isolement peut être effectué en environ trois heures s'il est réalisé correctement. Lors de l'utilisation de cette méthode, il est important d'effectuer toutes les étapes, y compris celles qui ne sont pas documentées, afin d'éviter la contamination par des vésicules plus grandes. Depuis le développement de cette technique, il est devenu beaucoup plus facile de caractériser les exosomes, tant sur le plan biochimique que biologique.Par ailleurs, nous avons beaucoup appris sur la communication intercellulaire médiée par les exosomes dans différents systèmes. De plus, cette technique a permis de développer les exosomes en tant que biomarqueurs pour diverses maladies. Je vous remercie beaucoup de votre attention.

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JoVE Journal

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Biologie

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