Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

L’objectif global de cette procédure est de fournir une méthode pour obtenir une structure tridimensionnelle de molécules assemblées en hélicoptère à l’aide de la cryo-microscopie électronique. Le protocole commence par la préparation d’échantillons cryogéniques EM à l’aide d’une méthode de dilution rapide et de transfert arrière pour réduire transitoirement la concentration en sel lors de la préparation de la grille EM hydratée congelée. Ce processus garantit la stabilité des protéines tout en réduisant le bruit de fond et en améliorant le rapport signal/bruit lors de la collecte de données cryogénique EM à faible dose qui suit la collecte de données.

L’indexation hélicoïdale des motifs de diffraction est terminée. Un traitement d’image est ensuite effectué, suivi d’une reconstruction 3D dans l’espace réel, ce qui permet d’obtenir la carte finale de la densité de la capside ou du tube ca. En général, les personnes qui débutent dans cette méthode auront du mal car il existe plusieurs points critiques pour une collecte et une analyse optimales des données.

Par exemple, dans le cas du VIH, des assemblages tubulaires à une capside qui ne se forment que dans une solution de source molaire réduisent rapidement la concentration en sel sans affecter la structure. Il est essentiel d’obtenir des images cryo EM de haute qualité. Étant donné une image de tube, il est très difficile d’apprendre quoi faire pour indexer un tube critique et quel logiciel pourrait être envisagé pour faire de la reconstruction 3D.

Cette vidéo fournit une approche détaillée et simple pour obtenir une reconstruction 3D d’objets physiques et pourrait être utilisée comme référence pour votre expérience. Je vais faire une démonstration de la procédure avec le Dr Puja. Nous sommes tous les deux postdoctorants du Dr.Laboratory Pour préparer les assemblages de protéines de capside du VIH pour la cryo em commencent par lueur, déchargeant le côté carbone de 200 grilles de cuivre à mailles sous 25 milliampères pendant 25 secondes.

Utilisez un nébuliseur pour amener l’humidité à 80 % dans la chambre environnementale, qui est un piston de gravité manuel fait maison. Pendant ce temps, de l’éthane liquide froid dans un piston vitro bott avec de l’azote liquide monte le faiseur de congélation plongeant sur le piston à gravité manuel. Ensuite, à l’aide d’une pince, fixez la pince sur le bord de la grille.

Appliquez 2,5 microlitres d’une solution protéique préassemblée sur le côté carbone de la grille. Chargez ensuite la pince sur le piston avec le côté carbone de la grille vers l’extérieur. Ajoutez trois microlitres de tampon à faible dilution de sel à l’arrière de la grille.

Épongez immédiatement la grille avec un morceau de papier filtre du même côté. Gardez toute la surface arrière de la grille en contact étroit avec le papier filtre pendant environ six secondes. Après avoir retiré le papier filtre, plongez immédiatement la grille dans de l’éthane liquide.

Enfin, retirez la pince du piston et transférez rapidement la grille dans une boîte de rangement de grille. Commencez la cryo-microscopie électronique en chargeant la grille hydratée congelée dans un microscope à deux électrons FEI polar G. Fonctionnant à 200 kilovolts et équipé d’une caméra CCD gatin 4K par 4K.

En mode de recherche à faible dose, ajoutez un grossissement d’environ 200 x. Passez à l’écran toute la grille pour trouver des zones où la glace est appropriée. Enregistrez les positions de ces zones dans un fichier d’étape.

Rappelez les positions enregistrées et filtrez davantage ces zones. Ajoutez un grossissement de 3 900 x en mode de recherche à faible dose. Sélectionnez les zones avec une couche mince uniforme de glace pour la collecte de données, qui se caractérisent par la présence de longs tubes suspendus au-dessus d’un trou.

Enregistrez toutes les zones dans un deuxième fichier d’étape. Passez en mode exposition. Ajoutez un grossissement de 59 000 x et insérez une ouverture d’objectif de 100 micromètres.

Ajustez ensuite la stigmatisation objective et l’intensité du faisceau pour une dose d’environ 15 électrons par angström au carré et par exposition. Revenez au mode de recherche à faible dose et déplacez-vous vers une position enregistrée. Identifiez et centrez un bon tube.

À l’aide de la caméra CCD, passez en mode de mise au point, ajustez la mise au point et réglez une valeur de défocalisation normalement comprise entre 0,5 et 2,5 micromètres. Passez ensuite en mode d’exposition et réglez un temps d’exposition de 0,3 à 0,5 seconde pour une dose de 15 électrons par angström carré. Collectez les images sur une caméra à plateau, en laissant les films reposer pendant 10 secondes avant qu’une exposition ne soit prise.

Après la collecte des images, passez à la position enregistrée suivante et répétez ce processus pour collecter plus d’images. Développer les films à fond en D 19 pendant 12 minutes. Numérisez ensuite les images à l’aide d’un scanner Nikon Super cool scan 9 000 ED d’une taille de pixel de 6,35 micromètres.

Un objet hélicoïdal peut être indexé par deux paramètres. L’ordre de Bessel N et le numéro de ligne de couche L dans la transformée de foreer du réseau de surface d’un objet hélicoïdal. Chaque ligne de couche est caractérisée par N et L et correspond à un ensemble de lignes sur le réseau de surface, comme indiqué par les indices H et K.

Pour commencer l’indexation hélicoïdale, utilisez le programme Helix boxer d’Iman pour découper un tube relativement long et droit avec un diamètre uniforme et enregistrer l’image au format MRC. Mesurez ensuite le rayon du tube à l’aide du programme boxer d’Iman. Déterminez la distance de répétition HEL à l’aide d’un programme basé sur la corrélation croisée tel que I-M-G-C-C-F dans le package MRC.

Calculez ensuite le foyer. Transformez avec une nouvelle longueur de boîte qui est une intégrale de la distance de répétition. Ensuite, choisissez deux lignes de couche principales qui définissent deux vecteurs de réseau de surface de base, un zéro et zéro un en unités de pixel FFT.

Déterminez les numéros de ligne de couche ainsi que les rayons d’amplitude maximale pour les deux lignes de couche principales dans la transformée de Fourier. Étant donné les numéros de ligne de couche et les valeurs des ordres de Bessel pour les deux lignes de couche principales, la rotation entre les sous-unités et l’élévation axiale de l’hélice d’une étoile peuvent être obtenues à l’aide de la règle de sélection décrite dans la procédure écrite. Ces deux nombres réels décrivent la symétrie de la vis du tube.

La reconstruction 3D commence par la segmentation des particules à l’aide du programme Iman. Boxeur. Après avoir ouvert une micrographie contenant des particules hélicoïdales, coupez une particule en segments qui se chevauchent dans le panneau de commande du boxer. Choisissez le mode hélice et définissez les paramètres pour la boxe.

La taille de la boîte doit être supérieure au diamètre de la particule et la valeur de l’OLA doit être d’environ 90 % de la taille de la boîte. Après la gauche, en cliquant sur l’une des extrémités du boxeur de particules, vous générerez automatiquement une série de boîtes de particules le long de la longueur de l’hélice, enregistrez les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées. L’étape suivante consiste à effectuer une reconstruction 3D initiale à l’aide de la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale de l’espace réel I-H-R-S-R avant d’être traitée avec I-H-R-S-R.

Inversez le contraste des images cryo-EM et appliquez le filtrage LOWPASS. Ouvrez ensuite l’interface graphique du programme I-H-R-S-R en tapant générateur. Fournissez à l’interface graphique toutes les informations relatives à la pile de particules en boîte, y compris le nom et le chemin de la pile, le nombre d’images dans la pile et les valeurs des paramètres de symétrie.

Cliquez sur le bouton Terminer pour créer le script de reconstruction. B 25 ÉPER. J’utilise un cylindre plein ou creux comme référence initiale et je laisse la procédure se dérouler jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de changements dans la symétrie de vis définie, ce qui se produit généralement après quelques cycles. Une symétrie hélicoïdale droite devrait donner une reconstruction convergée de manière stable.

La reconstruction générée au cours du dernier cycle servira de référence initiale pour un raffinement ultérieur. Enfin, effectuez une reconstruction 3D avec raffinement itératif en utilisant la carte de densité 3D générée par I-H-R-S-R comme référence initiale pour un raffinement supplémentaire au cours du raffinement. La symétrie hélicoïdale est fixée à la rotation entre les sous-unités et à l’élévation axiale, qui sont déterminées à partir de la procédure I-H-R-S-R.

Ensuite, déterminez la défocalisation et l’astigmatisme présents dans la micrographie à l’aide des programmes CTF trouver trois et CTF incliner à l’aide des programmes d’araignée appelés FT et mu multiplient les segments de particules par la fonction de transfert de contraste. Le CTF abrégé effectue une correspondance de projection en comparant les projections des volumes de référence avec les images corrigées du CTF à l’aide de l’alignement multi-références. La variation de l’angle d’inclinaison hors de l’alignement normal est limitée à plus ou moins 10 degrés et, échantillonnée par pas d’un degré, introduit des contraintes telles que des coefficients de corrélation élevés dans des angles simples proches de zéro degré ou de 180 degrés et des décalages X limités.

Pour les paramètres d’alignement de chaque segment, n’incluez dans la reconstruction que les segments qui satisfont aux contraintes. Après chaque cycle de raffinement itératif, une reconstruction 3D est générée à l’aide de la rétroprojection et divisée par certains sur le CTF au carré pour imposer la symétrie hélicoïdale pour générer un volume de symétries. Le raffinement itératif prend fin lorsqu’il n’y a plus d’amélioration de la résolution de la nouvelle reconstruction 3D.

Un seul ensemble de capside VIH un, un tube 92 e, a été mis en boîte et sa transformée de Fourier est calculée pour l’indexation hélicoïdale des deux rayons, les numéros de ligne de couche et les rayons d’amplitude maximale pour les lignes de couche un zéro et zéro un ont été déterminés. Les valeurs finales de moins 12 et 11 ont ensuite été calculées pour un zéro et zéro un respectivement avec une distance de répétition de 5195,48 angströms. La symétrie en vis du tube a été déterminée comme suit : delta Z est égal à 6,81 angströms et delta cinq est égal à 328,88 degrés, delta Z et delta cinq ont été affinés à 7,13 angströms et 328,86 degrés à l’aide de I-H-R-S-R et une reconstruction initiale a été générée après 10 cycles itératifs.

La reconstruction finale après raffinement itératif a considérablement amélioré la carte de densité par rapport au modèle initial calculé avec I-H-R-S-R. La carte de densité des tubes d’assemblage de capside est représentée sous la forme de trois coupes orthogonales parallèles à l’axe du tube et proches de la surface, perpendiculaires à l’axe du tube et parallèles à l’axe du tube et à travers celui-ci. La structure affichée résulte du rendu de surface de la carte de densité 3D profilée à 1,8 Sigma englobant 100 % du volume.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’obtenir une structure 3D de molécules assemblées alliées à l’aide de la microscopie électronique Crow.