Name: Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Découvrez la reconstruction 3D de structures hélicoïdales par cryo-microscopie électronique appliquée aux assemblages de capside du VIH-1. Cette méthode itérative permet d'obtenir des cartes de densité détaillées pour la biologie structurale.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zhao et Gongpu Danxia Ke pour le soutien technique. Nous remercions les Drs. Edward Egelman et Niko Grigorieff pour partager leur logiciel de traitement d&#39;image. Nous reconnaissons également le personnel qui soutiennent la biologie structurale cryo-EM installations et cluster Beowulf et la grille à l&#39;Université de Pittsburgh de la médecine. Ce travail a été soutenu par GM082251 et GM085043.

1. Frozen-hydraté préparation des échantillons EM Parce que le VIH-1 protéine de capside (CA) sont stables assemblées 9 seulement en sel (NaCl 1M) tampon, ce qui contribue le bruit de fond fort dans la cryo-EM images, nous utilisons une dilution rapide et retour côte méthode de buvard pour transitoirement réduire le sel la concentration lors de la préparation de la grille congelés-hydratés EM. <ol><li> Décharge luminescente côté de carbone de 200 mailles R2 / 1 des grilles de cuivre Quantifoil sous 25mA pendant 25 secondes. </li><li> Utilisez un nébuliseur pour amener le taux d'humidité dans la chambre de l'environnement, un home-made plongeur gravité manuel, à 80%. </li><li> Dans le dewar FEI Vitrobot piston, cool éthane liquide en utilisant l'azote liquide. Montez le dewar plongent au point de congélation sur le plongeur gravité manuel. </li><li> Appliquer 2,5 ul de la solution CA prémonté sur le côté de la grille de carbone, qui est monté sur une pince, et de la charge de la pince sur le piston avec le côté de carbone de la grille face à vous. </li><li> Ajouter 3 pi de tampon de sel faible dilution (100 mM NaCl) à l'arrière de la grille et immédiatement éponger la face arrière de la grille avec un morceau de papier filtre. La surface arrière ensemble de la grille doit être en contact étroit avec le papier filtre pendant environ 6 secondes, avant de retirer le papier filtre. Plonger immédiatement dans la grille de l'éthane liquide après avoir retiré le papier filtre. </li><li> Retirer les pinces du piston et de transférer rapidement de la grille dans une boîte de stockage réseau. </li></ol> 2. Cryo-microscopie électronique de CA assemblages tubulaires <ol><li> Chargez la grille congelés-hydraté dans une exploitation FEI Polara G2 microscope électronique à 200kV et équipé d'une caméra CCD Gatan 4Kx4K. </li><li> Dans le mode à faible dose à la recherche, à un grossissement de 200x ~ et avec une dose &lt;0.001e - / A 2, l'écran toute la grille pour les zones de glace convenable et enregistrer les positions de ces domaines dans un fichier de scène. </li><li> Rappel des positions enregistrées et l'écran davantage ces domaines à un grossissement de x 3900 en mode de faible dose de recherche. Sélectionnez les zones avec un uniforme, mince couche de glace contenant bien séparées, de longs tubes sur les trous, pour la collecte des données. Enregistrer les emplacements de ces zones dans un fichier de la deuxième étape. </li><li> Passer en mode d'exposition à un grossissement de 59 000 x 100 en médaillon une ouverture de l'objectif um, et ajuster la stigmatisation objectif et l'intensité du faisceau pour une dose de ~ 15 e - / A 2 par l'exposition. </li><li> Retour au mode de faibles doses de recherche, passer à une position enregistrée et d'identifier et d'un centre à l'aide d'un tube de bons de la caméra CCD. Passez en mode mise au point, d'ajuster le focus, et définir une valeur défocalisation, normalement entre 0,5 à 2,5 um. Basculer vers le mode d'exposition, mis un temps d'exposition de 0,3-0,5 secondes, pour une dose de 15 e - / A 2, et de recueillir une image. Les images sont recueillies sur un appareil à plaques, et les films devraient être autorisés à s'installer pendant 10 secondes avant une exposition est prise. </li><li> Déplacement à la position suivante sauvés et répétez l'étape 5 pour recueillir plus d'images. </li><li> Les films sont développés en pleine force D19 pendant 12 minutes et numérisées en utilisant un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner à une taille de pixel de 6,35 um. Le format des fichiers d'image est TIFF. </li></ol> 3. Indexation hélicoïdal Un objet hélicoïdale peut être indexé par deux paramètres: l'ordre de Bessel, n, et le numéro de ligne de la couche, L. Chaque ligne du calque dans la transformée de Fourier, qui se caractérise par (n, l), correspond à un ensemble de lignes sur le réseau de surface de l'objet dénoté par hélicoïdale (h, k) des indices, en utilisant la notation d'un treillis 2D. Pour tout (h, k), une ligne de couche (n hk, l hk) est une combinaison linéaire de deux vecteurs de base (n 10, L 10) et (n 01, L 01), qui sont les valeurs de n et l les deux lignes principales couches (1, 0) et (0, 1). L peut être obtenu à partir de la hauteur de ligne couche mesurée selon l'axe Z dans la transformée de Fourier. La valeur de n peut être estimée en utilisant l'équation suivante 10 πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1) où J n est la fonction de Bessel, qui détermine l'intensité de la ligne n ème couche, r est le rayon de l'objet hélicoïdale, et R est le rayon de l'amplitude maximale de la ligne de couche. Le numéro de ligne couche, l, est lié à n par la règle 11 sélection l = tn + euh ....................( 2) où t et u sont des constantes de l'hélice. Pour toute hélice donné, il peut y avoir des unités exactement u exactement (ou très près) t cOMPLÈTE tours. <ol><li> Boîte à un tube relativement droit et long avec un diamètre uniforme en utilisant le programme du RESE 12 helixboxer et enregistrer l'image au format de la MRC. </li><li> Déterminer la distance de répétition hélicoïdale, c, en utilisant un programme de corrélation croisée basée, comme «imgccf», dans le paquet MRC 13. </li><li> Calculer la transformée de Fourier avec une longueur de nouvelle boîte qui est une intégrale de la distance de répétition, c. </li><li> Choisissez deux lignes principales couche de base qui définissent deux vecteurs en treillis de surface (1,0) et (0,1). </li><li> Mesurer le rayon du tube, r, et la hauteur et le rayon des deux lignes de la couche principale de la transformée de Fourier, L 10, R 10, R 01 L 01, respectivement (Fig. 1). </li><li> Calculer N 10 et N 01 selon l'équation (1). </li><li> Depuis n valeurs ne sont que l'estimation, quelques combinaisons de N 10 et N 01 sont testés dans les étapes ultérieures (voir l'étape 4.2) afin de trouver la symétrie hélicoïdale correcte en utilisant l'emballage IHRSR programme. </li><li> Calculer la symétrie vis décrite par deux nombres réels: la rotation entre les sous-unités (Δφ) et la montée axiale (Az) de l'hélice une étoile (n = 1). Compte tenu de l 10, L 01, n 10, 01 et n valeurs, u et t peuvent être obtenus en testant une série de valeurs m (par exemple, -50 &lt;m &lt;50) selon la règle de sélection. Enfin, Δφ et Az sont calculées en utilisant Δφ = 360 t / u et Az = c / u. </li></ol> 4. Reconstruction tridimensionnelle <ol><li> La segmentation des particules <ol><li> Ouvrez une micrographie contenant des particules hélicoïdales, en utilisant le Boxer programme graphique, qui est un programme dans le paquet du RESE. </li><li> Couper la particule hélicoïdale en segments qui se chevauchent. Dans le panneau de contrôle de Boxer, choisissez le mode Helix et définir les paramètres pour la boxe: la taille de la boîte doit être plus grand que le diamètre de la particule et la valeur pour 'Olap "doit être ~ 90% de la taille de la boîte. </li><li> Après un clic gauche sur chaque extrémité de la particule hélicoïdale, Boxer va générer automatiquement une série de boîtes de particules le long d'hélice. </li><li> Enregistrer les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées. </li></ol></li><li> Initial de reconstruction 3D en utilisant des programmes IHRSR <ol><li> Inverser le contraste des images cryo-EM et appliquer filtrage passe-bas 14 (en option) avant de traiter avec la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel (IHRSR). </li><li> Ouvrez l'interface graphique du programme IHRSR en tapant «générateur». Fournir de l'interface graphique avec toutes les informations pour la pile en boîte particules, y compris le nom et le chemin de la pile, le nombre d'images dans la pile, les valeurs pour les paramètres de la symétrie, etc Cliquez sur le bouton «Finish» pour créer le script de reconstruction, b25.spi. </li><li> Utiliser un cylindre plein ou creux comme une référence initiale et permettre à la procédure au cycle jusqu'à ce qu'il n'y a aucun changement dans la symétrie vis définis, qui survient généralement après quelques cycles. Une symétrie droite hélicoïdale doit donner une reconstruction stable convergé. La reconstruction généré lors du dernier cycle sera utilisée comme une référence initiale pour affiner davantage. IHRSR effectue la reconstruction 3D en utilisant des programmes SPIDER. </li></ol></li><li> Reconstruction avec raffinement itératif 15 La reconstruction 3D générés par IHRSR est maintenant utilisée comme une référence initiale de raffinement supplémentaire. Pendant le raffinement, la symétrie hélicoïdale est fixée à Δφ et Az, qui sont déterminés à partir de la procédure IHRSR. <ol><li> Déterminer la défocalisation et de présenter l'astigmatisme sur la micrographie et de l'utilisation de programmes CTFFIND3 CTFTILT 16. </li><li> Multipliez les segments de particules par le FCT en utilisant des programmes SPIDER 17. L'opération dite FT dans la suite de SPIDER est utilisée pour calculer la transformée de Fourier (FFT) de l'image 2D. Par la suite, la FFT est multiplié par les valeurs du FCT, déterminée dans les étapes précédentes, en utilisant l'opération appelée MU dans la suite SPIDER. La valeur obtenue est ensuite transformée inverse arrière pour former une nouvelle image (CTF-corrigé) dans l'espace réel en utilisant l'opération SPIDER, FT nouveau. </li><li> Effectuer correspondant de projection en comparant les prévisions des volumes de référence avec le FCT-corrigées des images, en utilisant l'alignement de référence multi-. La variation de l'angle d'inclinaison out-of-avion est limité à + / -10 ° et échantillonnés dans les étapes 1 °. Introduire des contraintes, telles que les coefficients de corrélation élevés, dans le plan angles proche de 0 ° ou 180 ° et limités x-quarts, pour les paramètres d'alignement de chaque segment. Inclure dans la reconstruction uniquement les segments qui satisfont les contraintes. </li><li> Après chaque cycle itératif de raffinement, une reconstruction 3D est généré en utilisant la projection arrière et divisée par la somme sur le CTF2. </li><li> Imposer la symétrie hélicoïdale de générer un volume symétrisée. Le raffinement itératif est terminé lorsque aucune amélioration dans la résolution de la reconstruction 3D nouvelle survient. </li><li> Le SPIDER forfait de traitement d'image est utilisé pour la plupart des étapes de raffinement. Une série d'opérations sont contrôlées par des scripts SPIDER, qui sont créés par l'utilisateur des fichiers de contrôle des lots contenant des séquences d'opérations et les valeurs des paramètres. La reconstruction finale est calculée en utilisant des programmes dans SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Un seul VIH-1 CA A92E tube (Fig. 1a) était hors boîte et sa transformée de Fourier (Fig. 1b) a été calculée pour l'indexation hélicoïdale. Pour les lignes de la couche (1, 0) et (0, 1), L 10 = 28, L 01 ​​= 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Etant donné un rayon de tube de 211.57Å, nous approchée n 10 =- 12, n 01 = 11 (ici, l'impartialité a été prédéterminée). Avec une distance de répétition de 5195.48Å, la symétrie à vis du tube a été déterminée comme Az = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az et Δφ ont été raffinés pour 7.1321Å et 328,86 ° en utilisant IHRSR (fig. 2a) et la reconstruction initiale est montré dans la Fig. 2b. La reconstruction finale (fig. 3), après affinage itératif, l'amélioration de la carte de densité de façon significative à partir du modèle initial calculé par IHRSR (fig. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Indexation du VIH-1 CA hélicoïdaux tube. (A) Une seule image de VIH-1 tube de CA A92E. La barre d'échelle, de 30 nm. (B) La transformée de Fourier du tube représenté en (A). Les indices hélicoïdale (n 10 =- 12, n 01 = 11) sont notés. La flèche pointe vers la ligne à la résolution de la couche 23a. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Une reconstruction initiale à l'aide IHRSR. (A) la détermination de symétrie vis pour chaque cycle itératif. Δφ et Az, à partir des valeurs initiales, convergent vers des valeurs stables après 10 cycles itératifs de raffinement. (B) La carte 3D densité initiale au bout de 10 cycles itératifs. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. La carte de densité 3D après le raffinement itératif. (AC) La carte de densité des tubes CA est affiché comme trois tranches orthogonales: parallèlement à l'axe du tube et proche de la surface (A), perpendiculaire à l'axe du tube (B), et parallèlement à et à travers l'axe du tube (C) . Barres d'échelle, de 10 nm. (D) le rendu de surface de la carte de densité 3D profilée à 1,8 s enfermer un volume de 100%.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons un ensemble de protocoles pour fournir une approche simple pour obtenir des structures 3D d&#39;objets en hélice. En utilisant les procédures décrites, nous avons acquis une structure 3D du VIH-1 assemblage de la capside partir d&#39;une image simple tube (176 segments). Structures à plus haute résolution peut être obtenue en incluant des données d&#39;image de plus. Il ya plusieurs points critiques pour la collecte des données optimale et d&#39;analyse: d&#39;abord, lors de la préparation d&#39;un échantillon de cryo-EM, la solution de l&#39;échantillon doit être effacé, laissant un uniforme, fine couche de solution qui est légèrement plus épais que la taille de l&#39;échantillon. Il ya plusieurs façons différentes d&#39;effacer l&#39;échantillon. Pour les cellules bactériennes et de spécimens tubulaires, telles que le VIH-1 de l&#39;Assemblée CA, effaçant d&#39;un côté, en particulier de l&#39;arrière-côte, est la plus appropriée. Deuxièmement, l&#39;impartialité de l&#39;hélice doit être déterminée, car cela ne peut se faire par l&#39;indexation hélicoïdale ou de reconstruction. Une pratique courante est d&#39;utiliser le gel gravure, suivie par l&#39;observation rotative 18 pour déterminer impartialité. Impartialité peut également être déterminée d&#39;après-reconstruction quand la résolution de la carte de la densité est suffisamment élevée; les modèles 3D atomiques des composants individuels devraient s&#39;intègrent bien dans la carte de la densité quand un autoritarisme est supposée correcte. Sinon, l&#39;impartialité inverse devrait être assumée. Troisièmement, un filtre de Wiener doit être utilisé pendant le traitement d&#39;image, pour les deux phases et de correction d&#39;amplitude, de réduire l&#39;amplification du bruit. Depuis le FCT à partir d&#39;une seule image a toujours des passages par zéro, une partie de l&#39;information dans l&#39;espace réciproque est perdu. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de données de projection de multiples jeux inclus pour la reconstruction 3D, chaque imagées à des valeurs différentes défocalisation.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Source </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Décharge luminescente dispositif de 100X </td><td> Décharge luminescente dispositif de 100X </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscope avec un canon à émission de champ </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4k x 4k caméra CCD </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Plongez-gel dispositif de </td><td></td><td> Home-made plongeur gravité manuelle </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 grilles treillis de cuivre holely carbone </td><td> Quantifoil Micro Outils, Jena, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> EM logiciels RESE </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM logiciels IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programmes disponibles à partir de Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM logiciels araignée </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC base des logiciels de traitement hélicoïdale </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programmes disponibles à partir de Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT et l&#39;espace réel du logiciel de raffinement hélicoïdale </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

structure du vih-1 assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-microscopie électronique (cryo-EM), combiné avec le traitement d&#39;image, est un outil puissant pour la détermination de la structure des complexes de protéines et des assemblages macromoléculaires. En fait, seule la microscopie électronique de particules 1 et à deux dimensions (2D) cristallographie électronique 2 sont devenus des méthodologies relativement courantes et un grand nombre de structures ont été résolus en utilisant ces méthodes. Dans le même temps, le traitement d&#39;image et en trois dimensions (3D) la reconstruction d&#39;objets hélicoïdale s&#39;est rapidement développée, en particulier, l&#39;itératif hélicoïdale espace réel de reconstruction (IHRSR) la méthode 3, qui utilise des outils simples d&#39;analyse des particules en conjonction avec une symétrie hélicoïdale. De nombreuses entités biologiques fonction dans les formes filamenteuses ou hélicoïdale, dont les filaments d&#39;actine 4, 5 microtubules, fibres amyloïdes 6, 7 virus mosaïque du tabac, et les flagelles des bactéries 8, et, parce que une carte de densité d&#39;une entité 3D hélicoïdale peut être atteint par une seule projection l&#39;image, par rapport aux images de nombreux nécessaires pour la reconstruction 3D d&#39;un objet non hélicoïdales, avec la méthode IHRSR, analyse structurale de ces assemblages flexibles et désordonnés hélicoïdale est maintenant réalisable. Dans cet article, vidéo, nous fournissons des protocoles détaillés pour l&#39;obtention d&#39;une carte de densité 3D d&#39;un assemblage de protéines hélicoïdales (VIH-1 capside 9 est notre exemple), y compris des protocoles pour la préparation des échantillons cryo-EM, faible dose de collecte de données par cryo-EM, l&#39;indexation des figures de diffraction hélicoïdale et le traitement d&#39;image et de la reconstruction 3D utilisant IHRSR. Comparé à d&#39;autres techniques, la cryo-EM offre conservation des spécimens optimale dans des conditions proches des conditions natives. Les échantillons sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse, par congélation rapide, et imagée dans les microscopes électroniques à la température de l&#39;azote liquide, dans des conditions à faible dose pour minimiser les dégâts d&#39;irradiation. Exemples d&#39;images sont obtenues dans des conditions quasi native aux dépens des signaux faibles et faible contraste dans les micrographies enregistrées. Heureusement, le processus de reconstruction hélicoïdale a été largement automatisée, à l&#39;exception de l&#39;indexation du spectre de diffraction hélicoïdale. Ici, nous décrivons une approche à l&#39;index structure hélicoïdale et de déterminer les symétries hélicoïdale (paramètres hélicoïdaux) de micrographies numérisés, une étape essentielle pour la 3D hélicoïdale de reconstruction. Brièvement, on obtient une carte de la densité initiale de 3D en appliquant la méthode IHRSR. Cette carte initiale est ensuite itérativement affiné par l&#39;introduction de contraintes pour les paramètres d&#39;alignement de chaque segment, de manière à contrôler leurs degrés de liberté. Une nouvelle amélioration est obtenue en corrigeant pour la fonction de transfert de contraste (FCE) du microscope électronique (correction d&#39;amplitude et phase) et en optimisant la symétrie hélicoïdale de l&#39;assemblée.

Cet article décrit une méthode pour obtenir un en trois dimensions (3D) la structure des molécules hélice assemblés par cryo-microscopie électronique. Dans ce protocole, nous utilisons assemblées VIH-1 capside pour illustrer la procédure de reconstruction 3D détaillée pour réaliser une carte de densité par la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel.

Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM), associée au traitement d'images, est un outil de plus en plus puissant pour la détermination structurelle de protéines macromoléculaires...

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode permettant d'obtenir une structure tridimensionnelle de molécules assemblées d'héli à l'aide de la microscopie électronique cryogénique. Le protocole commence par la préparation de l'échantillon de cryo-EM en utilisant une méthode de dilution rapide et de capillarité par le côté opposé afin de réduire temporairement la concentration en sel lors de la préparation de la grille de microscopie électronique vitrifiée. Ce processus assure la stabilité des protéines tout en réduisant le bruit de fond et en améliorant le rapport signal sur bruit lors de l'acquisition de données à faible dose en cryo-EM qui suit la collecte de données.L'indexation hélicale des figures de diffraction est terminée. Le traitement des images est ensuite effectué, suivi d'une reconstruction tridimensionnelle dans l'espace réel, conduisant à la carte de densité finale de la capside du VIH-1 ou du tube de CA. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car plusieurs points critiques doivent être maîtrisés pour une collecte et une analyse optimales des données.Par exemple, dans le cas du VIH, des assemblages tubulaires de capsides ne se forment que dans une solution molaire dont on réduit rapidement la concentration en sel, sans toutefois affecter la structure. Il est essentiel d'obtenir des images de haute qualité en microscopie électronique cryogénique. À partir d'une image de tube, il est très difficile de savoir comment indexer un tube critique ni quel logiciel pourrait être utilisé pour effectuer la reconstruction 3D.Ce vidéo présente une méthode détaillée et simple pour obtenir une reconstruction 3D d'objets physiques et pourrait servir de référence pour votre expérience. Je vais démontrer la procédure avec le Dr. Puja. Nous sommes tous deux postdoctorants au laboratoire du Dr. Pour préparer les assemblages de la protéine de capside du VIH-1 pour la cryo-microscopie électronique, commencez par effectuer un amorçage au plasma sur la face carbone de grilles en cuivre de 200 mailles, sous 25 milliampères pendant 25 secondes.Utilisez un nébuliseur pour porter l'humidité à 80 % dans la chambre environnementale, qui est un piston manuel à gravité fait maison. Pendant ce temps, refroidissez de l'éthane liquide dans un piston en verre à l'aide d'azote liquide, puis montez le dispositif de congélation par immersion sur le piston manuel à gravité. Ensuite, utilisez une pince pour serrer les pinces fermement sur le bord de la grille.Appliquez 2,5 microlitres d'une solution protéique préassemblée sur la face carbone de la grille. Ensuite, placez la pince sur le piston avec la face carbone de la grille orientée vers l'extérieur. Ajoutez trois microlitres de tampon de dilution à faible concentration saline sur l'arrière de la grille.Immédiatement, tamponnez la grille avec un morceau de papier filtre du même côté. Maintenez toute la surface arrière de la grille en contact étroit avec le papier filtre pendant environ six secondes. Après avoir retiré le papier filtre, plongez immédiatement la grille dans de l'éthane liquide.Enfin, retirez la pince du piston et transférez rapidement la grille dans une boîte de stockage de grilles. Commencez la microscopie électronique cryogénique en chargeant la grille hydratée congelée dans un microscope électronique FEI Polara G2 fonctionnant à 200 kilovolts et équipé d'une caméra CCD Gatan de 4K par 4K.En mode de recherche à faible dose, appliquez un grossissement d'environ 200 x. Parcourez toute la grille à la recherche de zones présentant une glace appropriée. Enregistrez les positions de ces zones dans un fichier de plateau.Rappelez les positions enregistr&eacute;es et examinez davantage ces zones. Appliquez un grossissement de 3&nbsp;900 x en mode recherche &agrave; faible dose. S&eacute;lectionnez les zones pr&eacute;sentant une couche de glace uniforme et mince pour la collecte de donn&eacute;es, caract&eacute;ris&eacute;es par la pr&eacute;sence de longs tubes suspendus au-dessus d'un trou.Enregistrez toutes les zones dans un fichier de deuxième étape. Passez en mode exposition. Ajoutez un grossissement de 59 000 x et insérez une ouverture objective de 100 micromètres.Ensuite, ajustez l'astigmatisme de l'objectif et l'intensité du faisceau pour une dose d'environ 15 électrons par angström carré par exposition. Revenez au mode de recherche à faible dose et déplacez-vous vers une position enregistrée. Identifiez et centrez un bon tube.À l’aide de la caméra CCD, passer en mode focalisation, régler la mise au point et appliquer une valeur de défocus comprise habituellement entre 0,5 et 2,5 micromètres. Puis passer en mode exposition et régler un temps d’exposition de 0,3 à 0,5 seconde pour une dose de 15 électrons par angstrom carré. Acquérir les images sur une caméra à plaque, en laissant les films se stabiliser pendant 10 secondes avant de prendre l’exposition.Après l'acquisition des images, passez à la position enregistrée suivante et répétez ce processus pour acquérir davantage d'images. Révélez les films dans du D 19 à concentration totale pendant 12 minutes. Ensuite, numérisez les images à l’aide d’un scanner Nikon Super cool scan 9 000 ED avec une taille de pixel de 6,35 micromètres.Un objet hélicoïdal peut être indexé par deux paramètres : l'ordre de Bessel N et le numéro de ligne de couche L dans la transformée de réseau surfacique d'un objet hélicoïdal. Chaque ligne de couche est caractérisée par N et L et correspond à un ensemble de lignes sur le réseau surfacique, désignées par les indices H et K.Pour commencer l'indexation hélicoïdale, utilisez le programme Helix boxer d'Iman pour encadrer un tube relativement long, droit et de diamètre uniforme, puis enregistrez l'image au format MRC. Mesurez ensuite le rayon du tube à l'aide du programme boxer d'Iman. Déterminez la distance de répétition HEL à l'aide d'un programme basé sur la corrélation croisée, tel que I-M-G-C-C-F dans le package MRC.Ensuite, calculez le foyer. Transformez avec une nouvelle longueur de boîte qui est un multiple entier de la distance de répétition. Choisissez ensuite deux lignes de couche principales qui définissent deux vecteurs de base du réseau de surface, un zéro et zéro un, en unités de pixel de la TFD.Déterminez les numéros des lignes de couches ainsi que les rayons correspondant aux amplitudes maximales pour les deux lignes de couches principales dans la transformée de Fourier. Connaissant les numéros des lignes de couches et les valeurs des ordres de Bessel pour les deux lignes de couches principales, la rotation entre les sous-unités et la montée axiale de l'hélice unidimensionnelle peut être déterminée en utilisant la règle de sélection décrite dans la procédure écrite. Ces deux nombres réels décrivent la symétrie hélicoïdale du tube.La reconstruction 3D commence par la segmentation des particules à l'aide du programme Iman.Boxer. Après avoir ouvert une micrographie contenant des particules hélicoïdales, découpez une particule en segments chevauchants dans le panneau de contrôle de Boxer. Choisissez le mode hélice et réglez les paramètres pour le cadrage.La taille de la boîte doit être supérieure au diamètre de la particule, et la valeur d'OLA doit représenter environ 90 % de la taille de la boîte. Après un clic gauche sur l'une ou l'autre extrémité de la boîte de particules, une série de boîtes de particules est automatiquement générée le long de la longueur de l'hélice, et les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées sont enregistrés. L'étape suivante consiste à effectuer une reconstruction 3D initiale en utilisant la méthode de reconstruction itérative dans l'espace réel en hélice, appelée I-H-R-S-R, avant le traitement avec I-H-R-S-R.Inversez le contraste des images de cryo-ME et appliquez un filtrage passe-bas. Ensuite, ouvrez l'interface graphique du programme I-H-R-S-R en tapant generator. Fournissez à l'interface graphique toutes les informations relatives à la pile de particules encadrées, y compris le nom et le chemin d'accès de la pile, le nombre d'images dans la pile et les valeurs des paramètres de symétrie.Cliquez sur le bouton de fin pour créer le script de reconstruction. B 25 SP.J'utilise un cylindre plein ou creux comme référence initiale et je laisse la procédure s'exécuter en boucle jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de changements dans la symétrie de vis définie, ce qui se produit généralement après quelques cycles. Une symétrie hélicoïdale droite devrait fournir une reconstruction stable et convergente.La reconstruction générée lors du dernier cycle sera utilisée comme référence initiale pour un affinement supplémentaire. Enfin, effectuez une reconstruction 3D avec affinement itératif en utilisant la carte de densité 3D produite par I-H-R-S-R comme référence initiale pour un affinement supplémentaire au cours de l'affinement. La symétrie hélicoïdale est fixée au niveau de la rotation entre les sous-unités et de l'élévation axiale, qui sont déterminées à partir de la procédure I-H-R-S-R.Ensuite, déterminez le défocalisation et l'astigmatisme présents dans la micrographie à l'aide des programmes CTF find three et CTF tilt en utilisant les programmes spider appelés FT et mu multipliez les segments de particules par la fonction de transfert de contraste. Abbréviation CTF effectuez un appariement par projection en comparant les projections des volumes de référence avec les images corrigées par la CTF à l'aide d'un alignement multi-référence. La variation de l'angle de basculement hors plan est limitée à plus ou moins 10 degrés et échantillonnée par pas d'un degré ; introduisez des contraintes telles que de hauts coefficients de corrélation pour les angles plans proches de zéro degré ou 180 degrés et des décalages X limités.Pour les paramètres d'alignement de chaque segment, inclure uniquement les segments qui satisfont aux contraintes dans la reconstruction. Après chaque cycle de raffinement itératif, une reconstruction 3D est générée à l'aide de la rétroprojection et divisée par une valeur correspondant au carré de la FTM, puis la symétrie hélicoïdale est imposée afin de produire un volume symétrique. Le raffinement itératif prend fin lorsqu'aucune amélioration supplémentaire de la résolution de la nouvelle reconstruction 3D n'est observée.Un assemblage unique de capsides de VIH, un tube de 92 e, a été délimité et sa transformée de Fourier a été calculée afin d'indexer l'hélice selon les deux rayons ; les numéros des lignes en couche ainsi que les rayons correspondant aux amplitudes maximales pour les lignes en couche « un zéro » et « zéro un » ont été déterminés. Les valeurs finales de −12 et 11 ont ensuite été calculées respectivement pour « un zéro » et « zéro un », avec une distance de répétition de 5195,48 angströms. La symétrie hélicoïdale du tube a été déterminée comme étant ΔZ = 6,81 angströms et Δφ = 328,88 degrés ; ΔZ et Δφ ont été affinés à 7,13 angströms et 328,86 degrés à l’aide de la méthode I-H-R-S-R, et une reconstruction initiale a été générée après 10 cycles itératifs.La reconstruction finale après affinement itératif a considérablement amélioré la carte de densité par rapport au modèle initial calculé avec I-H-R-S-R. La carte de densité des tubes d'assemblage de la capside est présentée sous forme de trois coupes orthogonales parallèles à l'axe du tube et proches de la surface, perpendiculaires à l'axe du tube, et parallèles passant par l'axe du tube. La structure affichée résulte d'un rendu de surface de la carte de densité 3D, seuillée à 1,8 sigma et englobant 100 % du volume.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière d'obtenir une structure 3D d'une molécule assemblée par association à l'aide de la microscopie électronique cryogénique.

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