Structure du VIH-1 Assemblées capside par cryo-microscopie électronique et reconstruction itérative hélicoïdal espace réel

L'objectif général de cette procédure est de fournir une méthode permettant d'obtenir une structure tridimensionnelle de molécules assemblées d'héli à l'aide de la microscopie électronique cryogénique. Le protocole commence par la préparation de l'échantillon de cryo-EM en utilisant une méthode de dilution rapide et de capillarité par le côté opposé afin de réduire temporairement la concentration en sel lors de la préparation de la grille de microscopie électronique vitrifiée. Ce processus assure la stabilité des protéines tout en réduisant le bruit de fond et en améliorant le rapport signal sur bruit lors de l'acquisition de données à faible dose en cryo-EM qui suit la collecte de données.

L'indexation hélicale des figures de diffraction est terminée. Le traitement des images est ensuite effectué, suivi d'une reconstruction tridimensionnelle dans l'espace réel, conduisant à la carte de densité finale de la capside du VIH-1 ou du tube de CA. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car plusieurs points critiques doivent être maîtrisés pour une collecte et une analyse optimales des données.

Par exemple, dans le cas du VIH, des assemblages tubulaires de capsides ne se forment que dans une solution molaire dont on réduit rapidement la concentration en sel, sans toutefois affecter la structure. Il est essentiel d'obtenir des images de haute qualité en microscopie électronique cryogénique. À partir d'une image de tube, il est très difficile de savoir comment indexer un tube critique ni quel logiciel pourrait être utilisé pour effectuer la reconstruction 3D.

Ce vidéo présente une méthode détaillée et simple pour obtenir une reconstruction 3D d'objets physiques et pourrait servir de référence pour votre expérience. Je vais démontrer la procédure avec le Dr. Puja. Nous sommes tous deux postdoctorants au laboratoire du Dr. Pour préparer les assemblages de la protéine de capside du VIH-1 pour la cryo-microscopie électronique, commencez par effectuer un amorçage au plasma sur la face carbone de grilles en cuivre de 200 mailles, sous 25 milliampères pendant 25 secondes.

Utilisez un nébuliseur pour porter l'humidité à 80 % dans la chambre environnementale, qui est un piston manuel à gravité fait maison. Pendant ce temps, refroidissez de l'éthane liquide dans un piston en verre à l'aide d'azote liquide, puis montez le dispositif de congélation par immersion sur le piston manuel à gravité. Ensuite, utilisez une pince pour serrer les pinces fermement sur le bord de la grille.

Appliquez 2,5 microlitres d'une solution protéique préassemblée sur la face carbone de la grille. Ensuite, placez la pince sur le piston avec la face carbone de la grille orientée vers l'extérieur. Ajoutez trois microlitres de tampon de dilution à faible concentration saline sur l'arrière de la grille.

Immédiatement, tamponnez la grille avec un morceau de papier filtre du même côté. Maintenez toute la surface arrière de la grille en contact étroit avec le papier filtre pendant environ six secondes. Après avoir retiré le papier filtre, plongez immédiatement la grille dans de l'éthane liquide.

Enfin, retirez la pince du piston et transférez rapidement la grille dans une boîte de stockage de grilles. Commencez la microscopie électronique cryogénique en chargeant la grille hydratée congelée dans un microscope électronique FEI Polara G2 fonctionnant à 200 kilovolts et équipé d'une caméra CCD Gatan de 4K par 4K.

En mode de recherche à faible dose, appliquez un grossissement d'environ 200 x. Parcourez toute la grille à la recherche de zones présentant une glace appropriée. Enregistrez les positions de ces zones dans un fichier de plateau.

Rappelez les positions enregistrées et examinez davantage ces zones. Appliquez un grossissement de 3 900 x en mode recherche à faible dose. Sélectionnez les zones présentant une couche de glace uniforme et mince pour la collecte de données, caractérisées par la présence de longs tubes suspendus au-dessus d'un trou.

Enregistrez toutes les zones dans un fichier de deuxième étape. Passez en mode exposition. Ajoutez un grossissement de 59 000 x et insérez une ouverture objective de 100 micromètres.

Ensuite, ajustez l'astigmatisme de l'objectif et l'intensité du faisceau pour une dose d'environ 15 électrons par angström carré par exposition. Revenez au mode de recherche à faible dose et déplacez-vous vers une position enregistrée. Identifiez et centrez un bon tube.

À l’aide de la caméra CCD, passer en mode focalisation, régler la mise au point et appliquer une valeur de défocus comprise habituellement entre 0,5 et 2,5 micromètres. Puis passer en mode exposition et régler un temps d’exposition de 0,3 à 0,5 seconde pour une dose de 15 électrons par angstrom carré. Acquérir les images sur une caméra à plaque, en laissant les films se stabiliser pendant 10 secondes avant de prendre l’exposition.

Après l'acquisition des images, passez à la position enregistrée suivante et répétez ce processus pour acquérir davantage d'images. Révélez les films dans du D 19 à concentration totale pendant 12 minutes. Ensuite, numérisez les images à l’aide d’un scanner Nikon Super cool scan 9 000 ED avec une taille de pixel de 6,35 micromètres.

Un objet hélicoïdal peut être indexé par deux paramètres : l'ordre de Bessel N et le numéro de ligne de couche L dans la transformée de réseau surfacique d'un objet hélicoïdal. Chaque ligne de couche est caractérisée par N et L et correspond à un ensemble de lignes sur le réseau surfacique, désignées par les indices H et K.

Pour commencer l'indexation hélicoïdale, utilisez le programme Helix boxer d'Iman pour encadrer un tube relativement long, droit et de diamètre uniforme, puis enregistrez l'image au format MRC. Mesurez ensuite le rayon du tube à l'aide du programme boxer d'Iman. Déterminez la distance de répétition HEL à l'aide d'un programme basé sur la corrélation croisée, tel que I-M-G-C-C-F dans le package MRC.

Ensuite, calculez le foyer. Transformez avec une nouvelle longueur de boîte qui est un multiple entier de la distance de répétition. Choisissez ensuite deux lignes de couche principales qui définissent deux vecteurs de base du réseau de surface, un zéro et zéro un, en unités de pixel de la TFD.

Déterminez les numéros des lignes de couches ainsi que les rayons correspondant aux amplitudes maximales pour les deux lignes de couches principales dans la transformée de Fourier. Connaissant les numéros des lignes de couches et les valeurs des ordres de Bessel pour les deux lignes de couches principales, la rotation entre les sous-unités et la montée axiale de l'hélice unidimensionnelle peut être déterminée en utilisant la règle de sélection décrite dans la procédure écrite. Ces deux nombres réels décrivent la symétrie hélicoïdale du tube.

La reconstruction 3D commence par la segmentation des particules à l'aide du programme Iman.Boxer. Après avoir ouvert une micrographie contenant des particules hélicoïdales, découpez une particule en segments chevauchants dans le panneau de contrôle de Boxer. Choisissez le mode hélice et réglez les paramètres pour le cadrage.

La taille de la boîte doit être supérieure au diamètre de la particule, et la valeur d'OLA doit représenter environ 90 % de la taille de la boîte. Après un clic gauche sur l'une ou l'autre extrémité de la boîte de particules, une série de boîtes de particules est automatiquement générée le long de la longueur de l'hélice, et les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées sont enregistrés. L'étape suivante consiste à effectuer une reconstruction 3D initiale en utilisant la méthode de reconstruction itérative dans l'espace réel en hélice, appelée I-H-R-S-R, avant le traitement avec I-H-R-S-R.

Inversez le contraste des images de cryo-ME et appliquez un filtrage passe-bas. Ensuite, ouvrez l'interface graphique du programme I-H-R-S-R en tapant generator. Fournissez à l'interface graphique toutes les informations relatives à la pile de particules encadrées, y compris le nom et le chemin d'accès de la pile, le nombre d'images dans la pile et les valeurs des paramètres de symétrie.

Cliquez sur le bouton de fin pour créer le script de reconstruction. B 25 SP.J'utilise un cylindre plein ou creux comme référence initiale et je laisse la procédure s'exécuter en boucle jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de changements dans la symétrie de vis définie, ce qui se produit généralement après quelques cycles. Une symétrie hélicoïdale droite devrait fournir une reconstruction stable et convergente.

La reconstruction générée lors du dernier cycle sera utilisée comme référence initiale pour un affinement supplémentaire. Enfin, effectuez une reconstruction 3D avec affinement itératif en utilisant la carte de densité 3D produite par I-H-R-S-R comme référence initiale pour un affinement supplémentaire au cours de l'affinement. La symétrie hélicoïdale est fixée au niveau de la rotation entre les sous-unités et de l'élévation axiale, qui sont déterminées à partir de la procédure I-H-R-S-R.

Ensuite, déterminez le défocalisation et l'astigmatisme présents dans la micrographie à l'aide des programmes CTF find three et CTF tilt en utilisant les programmes spider appelés FT et mu multipliez les segments de particules par la fonction de transfert de contraste. Abbréviation CTF effectuez un appariement par projection en comparant les projections des volumes de référence avec les images corrigées par la CTF à l'aide d'un alignement multi-référence. La variation de l'angle de basculement hors plan est limitée à plus ou moins 10 degrés et échantillonnée par pas d'un degré ; introduisez des contraintes telles que de hauts coefficients de corrélation pour les angles plans proches de zéro degré ou 180 degrés et des décalages X limités.

Pour les paramètres d'alignement de chaque segment, inclure uniquement les segments qui satisfont aux contraintes dans la reconstruction. Après chaque cycle de raffinement itératif, une reconstruction 3D est générée à l'aide de la rétroprojection et divisée par une valeur correspondant au carré de la FTM, puis la symétrie hélicoïdale est imposée afin de produire un volume symétrique. Le raffinement itératif prend fin lorsqu'aucune amélioration supplémentaire de la résolution de la nouvelle reconstruction 3D n'est observée.

Un assemblage unique de capsides de VIH, un tube de 92 e, a été délimité et sa transformée de Fourier a été calculée afin d'indexer l'hélice selon les deux rayons ; les numéros des lignes en couche ainsi que les rayons correspondant aux amplitudes maximales pour les lignes en couche « un zéro » et « zéro un » ont été déterminés. Les valeurs finales de −12 et 11 ont ensuite été calculées respectivement pour « un zéro » et « zéro un », avec une distance de répétition de 5195,48 angströms. La symétrie hélicoïdale du tube a été déterminée comme étant ΔZ = 6,81 angströms et Δφ = 328,88 degrés ; ΔZ et Δφ ont été affinés à 7,13 angströms et 328,86 degrés à l’aide de la méthode I-H-R-S-R, et une reconstruction initiale a été générée après 10 cycles itératifs.

La reconstruction finale après affinement itératif a considérablement amélioré la carte de densité par rapport au modèle initial calculé avec I-H-R-S-R. La carte de densité des tubes d'assemblage de la capside est présentée sous forme de trois coupes orthogonales parallèles à l'axe du tube et proches de la surface, perpendiculaires à l'axe du tube, et parallèles passant par l'axe du tube. La structure affichée résulte d'un rendu de surface de la carte de densité 3D, seuillée à 1,8 sigma et englobant 100 % du volume.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière d'obtenir une structure 3D d'une molécule assemblée par association à l'aide de la microscopie électronique cryogénique.