Visualisation par immunofluorescence des interactions entre les protéines de réparation de l’ADN

Les cassures double brin de l’ADN induites par les radiations, ou DSB, déclenchent le recrutement de protéines de réparation de l’ADN sur le site endommagé, activant ainsi la réparation de l’ADN.

Pour détecter les protéines de réparation de l’ADN γH2AX et 53BP1 sur les sites DSB par immunofluorescence indirecte, prélever des lamelles contenant des cellules épithéliales. Irradiez un sous-ensemble des cellules. Incuber, permettant au contrôle des cellules non irradiées et irradiées de se développer pendant des temps spécifiques.

Traiter avec un tampon pour extraire les noyaux cellulaires. Fixer les noyaux cellulaires pour préserver leur morphologie. Traiter avec une solution bloquante pour minimiser la liaison des anticorps primaires non spécifiques.

Ajoutez des anticorps primaires ciblant les deux protéines de réparation de l’ADN. Les anticorps se lient aux protéines respectives.

Incuber avec des anticorps secondaires marqués avec des fluorophores rouges et verts, respectivement. Les anticorps secondaires – spécifiques à chaque anticorps primaire – se lient à leurs cibles. Ajoutez un support de montage contenant du DAPI sur une lame de verre. Montez les lamelles dessus pour l’imagerie.

Le DAPI – un colorant de liaison à l’ADN – se lie aux rainures mineures riches en AT de l’ADN double brin, contre-colorant les noyaux. Visualisez les noyaux cellulaires à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Par rapport aux noyaux cellulaires non irradiés, les noyaux irradiés présentent plusieurs foyers γH2AX qui diminuent avec le temps, indiquant une réparation progressive de l’ADN dans les cellules cultivées pendant de plus longues périodes.

Les signaux de fluorescence rouge et vert qui se chevauchent apparaissent en jaune, indiquant la co-localisation de γH2AX et 53BP1 sur le site DSB après irradiation.

Commencez par cultiver 40 000 cellules HeLa dans chaque puits d’une plaque de 12 puits avec une lamelle en verre ronde de 18 millimètres jusqu’à une confluence de 80 %. Après avoir exposé les cellules à 4 irradiations gamma grises, lavez-les deux fois avec 1 millilitre de PBS. Ensuite, retirez complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de NEB dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 2 minutes à température ambiante, puis retirer le NEB.

Gardez à l’esprit que le temps d’incubation peut varier en fonction de la lignée cellulaire, mais ne doit généralement pas dépasser deux minutes. Lavez les cellules avec 1 millilitre de PBS. Ensuite, retirez complètement le PBS et ajoutez 200 microlitres de PFA à 4 % dans chaque puits pour la fixation cellulaire.

Incuber les cellules pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius, puis retirer le PFA et ajouter 1 millilitre de PBS dans chaque puits. Retirez complètement le PBS, puis ajoutez 200 microlitres de solution de blocage dans chaque puits et incubez les cellules pendant 2 heures à température ambiante, ou 16 à 18 heures à 4 degrés Celsius.

Diluez l’anticorps primaire dans un tampon de dilution et agitez-le jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Dans une boîte d’humidité, collez un morceau de parafilm et ajoutez 10 microlitres d’anticorps primaires en une seule goutte. Alignez un bord de la lamelle du puits avec la goutte et abaissez-la lentement sur le parafilm en étalant le liquide. Incuber la lamelle pendant 2 heures à température ambiante.

Après l’incubation, lavez les lamelles trois fois dans du PBS pendant 1 minute par lavage. Diluez l’anticorps secondaire dans un tampon de dilution et un vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé. Appliquez 10 microlitres d’anticorps secondaires sur chaque lamelle comme décrit précédemment, et incubez pendant 2 heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Lavez les lamelles trois fois avec du PBS - et une fois avec de l’eau - pendant 1 minute par lavage. Ensuite, montez-les sur des lames de verre avec un support de montage à base de glycérol contenant du DAPI. Scellez les lamelles avec du vernis à ongles transparent et laissez-les sécher pendant 20 minutes. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 60X et utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers l’oculaire.

Pour l’acquisition d’images XYZ, ouvrez le logiciel d’acquisition et définissez le « Type de scanner » sur « Galvano », le « Mode scanner » sur « Aller-retour » et la taille d’image « 512 par 512 ». Dans le panneau PMT, réglez le mode sur VBM, le mode moyen sur Image et le balayage séquentiel sur Ligne. Ensuite, réglez les détecteurs de colorant et de chaleur. Réglez le canal 1 sur DAPI et SD1, le canal deux sur Alexa Fluor 488 et HSD3, et le canal 3 sur Alexa Fluor 647 et HSD4. Sélectionnez « ON » dans « Z ».

Pour régler l’image en direct, appuyez sur le bouton En direct de la fenêtre en direct et réglez la mise au point. Ensuite, utilisez la fenêtre « outil PMT » pour régler l’intensité, la sensibilité, le gain et le décalage du laser. Pour les piles Z, sélectionnez De début à fin et 15 tranches. Sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer les images et appuyez sur le bouton Démarrer de LSM pour commencer à les acquérir. Lorsque vous avez terminé, appuyez sur le bouton Series Done pour terminer l’acquisition de l’image.