Name: Ex vivo limagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez l'imagerie ex vivo de cellules T fluorescentes dans des tranches de ganglions lymphatiques murins par microscopie widefield et confocale. Cette méthode permet d'analyser en temps réel la migration et la motilité des lymphocytes T dans le tissu lymphatique.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Alain Trautmann qui nous ont encouragés à effectuer des tranches de ganglions lymphatiques. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la Ligue Nationale Contre le Cancer le, la Fondation pour la Recherche Médicale en France et l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer.

1. Préparation des tranches à partir des ganglions lymphatiques <ol><li> Préparer un 4% à faible point de fusion d'agarose solution pour incorporer. Diluer agarose dans du PBS et micro-ondes cette solution. Lorsque l'agarose est complètement dissous, de maintenir la solution à 37 ° C jusqu'à utilisation. </li><li> Préparer une plaque de 6 puits de culture de tissu. Ajouter 1,1 ml du milieu RPMI complet de culture par puits, et d'insérer un filtre organotypique dans chaque puits. Placer la plaque de 6 puits à 4 ° C jusqu'au moment de transfert de tranches. </li><li> Placez les rondelles en acier inoxydable, avec un diamètre intérieur de 4 mm, dans un plat en plastique rempli d'un milieu RPMI complet. Rondelles sera en outre utilisée pour concentrer les cellules sur la tranche coupée vibratome. </li><li> Sacrifice de la souris en conformité avec les règles locales de protection des animaux. Retirez délicatement les ganglions lymphatiques périphériques du tissu environnant et les placer dans un récipient de plastique contenant PBS glacé. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager la structure des ganglions lymphatiques, car ces organes sont très doux. </li><li> Verser les 4%, gel d'agarose dans un plat en plastique de 35 mm et délicatement le transfert des nœuds dans le gel. Laissez le gel d'agarose sur la glace pendant 5 min à durcir. </li><li> Retirer le bloc de l'antenne et les garnitures de la gélose, afin de laisser 3-5 mm de gel autour de chaque noeud lymphatique. </li><li> Fixez les noeuds embarqués sur le disque spécimen de la vibratome avec de la colle tissulaire non-toxique. Installez le disque spécimen dans le plateau rempli de PBS glacé. </li><li> Section de l'agar-tissu inclus à 320 um d'épaisseur avec la vitesse vibratome mis sur une gamme lente (0,3 mm / s) et la fréquence de vibration mis sur une gamme moyenne (1,5 mm). </li><li> Soigneusement transfert de tranches de ganglions lymphatiques comme ils sont coupés sur les inserts culture organotypique l'aide de pinces fines. Déposer 3 tranches sur chaque insert. Utiliser le plus grand soin que les tranches peuvent être facilement endommagés. Un ganglion lymphatique périphérique sera typiquement un rendement de 5 sections lorsqu'il est coupé à 320 um. Jeter les tranches premier et le dernier, car ils ne contiennent que des tissus superficiels. </li><li> Placez les rondelles en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle. Assurez-vous que les rondelles soient bien positionnés sur l'agarose entourant les tissus. </li><li> Incuber la plaque de culture à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié avant d'être prêt à l'assiette des cellules T. </li></ol> 2. Isoler les cellules T des ganglions lymphatiques de souris <ol><li> Isoler les cellules T en fonction de l'article précédemment publié JoVE 3. </li><li> Utiliser les cellules T immédiatement et passez à la section suivante. Sinon, les lymphocytes pourrait être cultivé pendant la nuit dans RPMI complet-milieu supplémenté avec 10 ng / ml d'IL-7. </li></ol> 3. Étiquetage des cellules T isolées <ol><li> Laver les cellules dans du HBSS. Les remettre en suspension dans le même tampon à 10 x 10 6 par ml. </li><li> Ajouter le même volume de HBSS contenant 1 uM cellulaire Tracker verte CMFDA donnant une concentration finale de 0,5 uM. </li><li> Incuber la suspension cellulaire à 37 ° C pendant 5 min. Laver les cellules deux fois avec RPMI complet et moyen terme. </li><li> Resuspendre les cellules à une concentration finale de 10 x 10 6 par ml dans RPMI complet et moyen terme. Ces cellules marquées seront plaqués sur les tranches. </li></ol> Autres colorants fluorescents de CMFDA pourrait être utilisé aussi, mais gardez à l'esprit que ces molécules sont potentiellement toxiques au-dessus de certaines concentrations. 4. Placage étiquetés cellules T sur les tranches de ganglions lymphatiques <ol><li> Retirer l'excès moyennes contenues dans la partie intérieure de la rondelle avec une pipette. Ne laissez pas le tissu devient sèche; travailler rapidement pendant cette étape. </li><li> Doucement passer 10 à 20 cellules T ul étiquetés qui correspond à 1 à 2 x 10 5 cellules dans la partie intérieure de la rondelle. Des précautions doivent être prises pour ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Soyez sûr que la goutte de suspension cellulaire reste en place. </li><li> Placer les tranches avec des cellules dans l'étuve à 37 ° C et 5% de CO 2 d'au moins 30 minutes pour permettre aux lymphocytes de migrer dans les tissus. </li></ol> 5. Imagerie des cellules T à l'intérieur des tranches de ganglions lymphatiques Dans cette vidéo, article, nous cellules T d'image fluorescente dans des tranches de ganglions lymphatiques avec un grand champ microscope inversé et un microscope confocal debout. <ol><li> Réglez la température à 37 ° C. Nos microscopes sont équipés de chambres à température contrôlée. </li><li> Installer un système de perfusion permettant la perfusion continue de la tranche de ganglion lymphatique avec oxygénée (5% de CO 2, 95% d'O 2) rouge de phénol milieu RPMI sans. Dans notre système, perfusé des médias pénètre dans la chambre de l'imagerie d'un côté par la gravité. Le milieu est aspiré par une pompe reliée à un flacon de collecte des déchets. Réglez le débit des médias à 1 ml / min. </li><li> Avec une pince fine, délicatement enlever la tranche de la plaque de 6 puits et tremper la préparation dans un milieu RPMI réchauffé oxygéné pendant quelques secondes pour se débarrasser des cellules fluorescentes pas infiltré dans le tissu. </li></ol> ImaGing cellules T avec un microscope à champ large inversé <ol start="4"><li> Placez la tranche à l'envers sur une chambre d'imagerie sur mesure qui se compose de fils de nylon collé sur la partie intérieure d'un plat à fond de verre. Dans cette chambre, le fils de nylon d'élever la tranche du verre et de permettre la solution oxygénée à diffuser dans les tissus. Ceci est nécessaire que la migration des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques est fortement dépendante de l'oxygène. Fixez la tranche en ajoutant sur lui une rondelle en acier inoxydable. Dans ces conditions, la tranche se situe à quelques microns au-dessus du fond du plat, ce qui facilite le renouvellement de la solution de perfusion. </li><li> Pour capturer un grand champ de vision (800 x 800 um, environ un tiers de la surface de trancher le nœud), de recueillir des images en utilisant un objectif 10x à sec. Nous avons constaté que le 10x Nikon S Fluor 0,5 NA était le plus approprié pour nos analyses. </li></ol> Une expérience d'imagerie time-lapse typiques capte 5 avions optiques couvrant une profondeur totale de 50 um dans le sens axial (z) la dimension. Fluorescent des cellules T sont généralement imagée à des intervalles allant 10 à 30 secondes pendant 10 à 20 min. Imagerie des cellules T avec un microscope confocal debout Le microscope confocal utilisé dans ce protocole est un Leica SP5 équipé d'un objectif 20x immersion dans l'eau (l'Olympe, 20x/0.95 NA). <ol start="6"><li> Fixez la tranche à l'étape de l'imagerie du microscope. Remarque: En général, nous placer une rondelle sur la préparation pour l'immobiliser. </li><li> Régler une session d'imagerie en recueillant une série d'images le long de l'axe z. Pour les cellules T d'image dans une structure de tissu intact, la position de départ est généralement fixé à 5 à 10 microns en dessous de la cellule T étiqueté premier. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs En suivant cette vidéo-protocole vous devriez vous attendre à visualiser un grand nombre de cellules T fluorescentes accumulés dans la zone T du nœud, un phénomène qui se produit normalement dans cet environnement particulier in vivo (figure 1). En particulier, les cellules T doivent être exclus des zones de cellules B, qui sont généralement juste en dessous de la capsule. Une expérience réussie se traduira également par les lymphocytes T recrutés dans le tissu (figure 2), en affichant un comportement très mobiles (figure 3) cohérentes avec les résultats publiés obtenus dans les ganglions lymphatiques intactes 4. En moyenne, la vitesse moyenne de l'individu au sein de cellules T tranches devrait être proche de 10 um / min (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Les lymphocytes T s'accumulent dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un nœud lymphatique tranche 30 min avant l'acquisition d'image (photo du haut). L'image est la projection maximale de 5 images couvrant 50 microns dans la direction z. L'image en champ clair est indiqué en bas. Les images ont été capturées avec un microscope à champ large. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Les cellules T sont recrutés dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un noeud lymphatique tranche de 30 minutes avant l'acquisition d'images en utilisant un microscope confocal. Les images ont été capturées à la surface de coupe (photo du haut) et 40 um ci-dessous (image du bas). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Les cellules T sont très mobiles dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T ont été imagées pendant 12 min à l'aide d'un microscope à champ large. Trajectoires de cellules T individuelles sont affichées sous forme de couleur pistes pour représenter les déplacements croissante du bleu (faible cellules mobiles) au rouge (forte cellules mobiles). Pistes ont été calculés en utilisant le logiciel Imaris. La ligne blanche suit le bord du nœud, tandis que l'ovale pointillé délimite la zone B putatifs cellule. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Dans une tranche de ganglion lymphatique, la vitesse des cellules T est proche de 10 um / min. Les vitesses ont été calculées en utilisant le logiciel à partir des pistes Imaris représenté dans la figure 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Nous avons décrit une simple technique rapide et robuste pour générer des tranches de ganglions lymphatiques, qui sont utilisées pour étudier le comportement des cellules T introduit. Ces dernières années, cette méthode a été appliquée avec succès à l&#39;aide du thymus et des tranches de ganglions lymphatiques d&#39;identifier les facteurs contrôlant le positionnement extracellulaire des cellules T et la motilité 1,5. Il a également été utilisé pour mesurer les réponses Ca 2 + dans les thymocytes lors de la sélection positive et dans les cellules T à 2,6 reconnaissance de l&#39;antigène. Le dosage de tranche de superposition présente des avantages et des limites qui méritent d&#39;être discutés. Fait à noter, ce système permet d&#39;accéder à des tissus, utile si on a besoin de manipuler des tranches pharmacologiquement afin d&#39;interférer avec le contrôle moléculaire de la migration cellulaire. Suite à l&#39;imagerie, les tranches peuvent être traitées pour l&#39;immunohistochimie pour recueillir plus d&#39;informations sur les structures qui ont été imagées. Par ailleurs, l&#39;observation peut être faite avec un microscope à fluorescence à champ large traditionnels. Bien que la résolution n&#39;est pas aussi bonne qu&#39;avec une confocale ou un microscope à deux photons et que la phototoxicité est en principe plus sévère avec un photon à la microscopie à deux photons, il a les avantages de la simplicité, un coût inférieur, et les grands choix de longueurs d&#39;onde d&#39;excitation. L&#39;imagerie des cellules T dans un ganglion lymphatique intact nécessite l&#39;injection intraveineuse de lymphocytes marqués que par la suite la maison pour les organes lymphoïdes. Comme nous l&#39;avons montré précédemment 1, le dosage tranche est parfaitement compatible avec l&#39;expérience de transfert adoptif. Toutefois, la longueur du temps nécessaire pour les cellules T à l&#39;accueil dans les ganglions lymphatiques peut compliquer l&#39;utilisation de colorants fluorescents qui ont tendance à s&#39;échapper des cellules au cours du temps. C&#39;est le cas de la Ca 2 + colorant fura-2. Avec le recrutement rapide (&lt;30 min) de cellules T dans les tissus, le dosage tranche fournit une occasion d&#39;utiliser des colorants tels. Enfin, cette méthode a le grand avantage d&#39;analyser les fonctions des cellules T dans plusieurs tissus humains maintenus en vie. Ce système expérimental présente aussi des limites qui doivent être conservés à l&#39;esprit. Dommages liés à la découpe peut affecter le fonctionnement des cellules T, en particulier dans la région superficielle du tissu près de la surface de coupe. Afin d&#39;évaluer la mort cellulaire dans la tranche, nous avons utilisé le colorant fluorescent SYTOX verte qui pénètre les cellules avec la membrane plasmique compromise. Nos expériences révèlent qu&#39;environ 20% des cellules ganglionnaires au total, principalement localisées dans la région superficielle du tissu, ont été marqués par fluorescence avec ce colorant nucléaire. Un autre problème potentiel avec le test est la capacité des tranches de conserver d&#39;importants facteurs solubles, y compris les chimiokines. Bien, nous n&#39;avons aucune indication que nos données ont été affectés par ces problèmes, car les cellules T affiche une bonne motricité dans la tranche, nous tenons à souligner l&#39;importance de l&#39;imagerie des cellules T dans les régions saines situées à plusieurs dizaines de microns de la surface de coupe. Alors, cela pourrait être fait avec des microscopes traditionnels (grand champ ou confocale), comme dans ce protocole, il est probable que la préparation de tranches du ganglion lymphatique associé à l&#39;imagerie à deux photons va augmenter la résolution spatiale en profondeur et réduire la phototoxicité.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Pinces fines </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mm inserts de culture </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> RPMI complet-milieu est faite en ajoutant 10% inactivé à la chaleur sérum de veau foetal et de la pénicilline / streptomycine </td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Basse température de gélification agarose, de type VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butyl colle cyanoacrylate, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Rondelles en acier inoxydable de 4 mm de diamètre intérieur </td><td> Magasin de bricolage </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellule Tracker verte CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo l&#39;imagerie de cellules t dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale widefield

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Cellules T naïves en permanence le trafic d&#39;organes lymphoïdes secondaires, y compris les ganglions lymphatiques périphériques, afin de détecter des antigènes exprimés rares. La migration des cellules T dans les ganglions lymphatiques est un processus complexe qui implique des facteurs cellulaires et chimiques, y compris les chimiokines. Récemment, l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons a permis de suivre les cellules T dans les ganglions lymphatiques intactes et d&#39;en tirer quelques informations quantitatives sur leur comportement et leurs interactions avec d&#39;autres cellules. Bien qu&#39;il existe des avantages évidents à un système in vivo, cette approche nécessite une instrumentation complexe et coûteux et offre un accès limité au tissu. Pour analyser le comportement des cellules T dans les ganglions lymphatiques murins, nous avons développé un test de 1 tranche, initialement mis en place par les neurobiologistes et transposée récemment murin thymus 2. Dans cette technique, marqué par fluorescence des cellules T sont plaqués sur le dessus d&#39;une tranche de ganglion lymphatique aiguë préparé. Dans cette vidéo, article, la localisation et la migration des cellules T dans les tissus sont analysés en temps réel avec un grand champ et un microscope confocal. La technique qui complète in vivo microscopie à deux photons offre une approche efficace à l&#39;image de cellules T dans leur environnement naturel et pour élucider les mécanismes qui sous-tendent la migration des cellules T.

Ce protocole décrit une méthode pour imager des cellules T fluorescentes introduites dans les tranches de ganglions lymphatiques. La technique permet en temps réel des analyses de la migration des cellules T avec grand champ traditionnel fluorescence ou microscopie confocale.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Les lymphocytes T naïfs migrent continuellement vers les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques périphériques, afin de détecter des antigènes exprimés rarement. La migration...

L'objectif général de cette procédure est d'observer des lymphocytes T fluorescents dans des tranches de ganglion lymphatique par microscopie à grand champ et microscopie confocale. Cela est réalisé en premier lieu en prélevant un ganglion lymphatique de souris et en l'incorporant dans de l'agarose à bas point de fusion. Le ganglion est ensuite découpé en sections de 320 micromètres d'épaisseur à l'aide d'un vibratome.Ensuite, les lymphocytes T marqués par un colorant fluorescent sont ensemencés sur une tranche de ganglion lymphatique. Enfin, les lymphocytes T ayant infiltré la tranche sont visualisés par microscopie à grand champ et microscopie confocale. En définitive, des images fixes et des enregistrements vidéo peuvent être obtenus, montrant comment les lymphocytes T sont recrutés dans le ganglion lymphatique et quel type de comportement moteur ils présentent au sein du tissu lymphatique. D'accord.Le principal avantage de ces techniques appliquées à un métal existant, comme la photomicroscopie et les organes intacts, est que les cellules T peuvent être visualisées dans un système tridimensionnel à l’aide d’un microscope conventionnel à champ clair. En outre, les préparations légères permettent d’accéder au tissu. Commencez par préparer une solution à 4 % d’agarose à bas point de fusion en diluant l’agarose dans du PBS et en chauffant le mélange obtenu au micro-ondes jusqu’à dissolution complète de l’agarose.Conserver la solution à 37 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Ensuite, remplir un plat en plastique avec du RPMI. Compléter les milieux de culture et placer des entretoises en acier inoxydable ayant des diamètres intérieurs de quatre millimètres dans le plat.Remplir un autre plat avec du PBS glacé, puis ajouter environ 1,1 millilitre de RPMI. Ajouter le milieu de culture complet par puits dans une plaque de culture tissulaire à six puits. Insérer un filtre organotypique dans chaque puits de la plaque à six puits et placer la plaque à quatre degrés Celsius.Retirer soigneusement les ganglions lymphatiques périphériques de leurs tissus environnants chez une souris euthanasiée. Dissecter les ganglions lymphatiques avec précaution car ils sont très fragiles. Il est très important d'éliminer toute la graisse du tissu, car elle est très toxique pour les cellules.Placer les ganglions lymphatiques dans la boîte en plastique contenant le PBS sur de la glace pilée. Verser ensuite le gel d'aro 4 % dans une boîte en plastique de 35 millimètres et transférer délicatement les ganglions dans le gel. Placer ensuite l'aro sur de la glace pendant cinq minutes afin qu'il durcisse ; une fois l'aro durci, retirer le bloc de la boîte et tailler l'agar, en laissant environ trois à cinq millimètres de gel autour de chaque ganglion lymphatique.Ensuite, utilisez une colle non toxique pour fixer les nœuds inclus sur le disque d'échantillon d'un viome. Installez le disque d'échantillon dans le plateau amovible du viome et remplissez le plateau avec du PBS glacé. Réglez la vitesse du viome sur une plage lente et la fréquence de vibration sur une plage moyenne, puis sectionnez le tissu inclus dans l'agar à une épaisseur de 320 microns.Jetez la première tranche, car elle ne contient que du tissu superficiel, puis utilisez une pince fine pour transférer délicatement les tranches de ganglion lymphatique au fur et à mesure de leur découpe dans les inserts de culture organotypique. Placez un anneau en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle, en veillant à ce que les anneaux reposent sur l'agarose sans recouvrir le tissu du ganglion lymphatique. Incubez ensuite la plaque de culture contenant les tranches de ganglion lymphatique à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié avec 5 % de dioxyde de carbone.Pendant la préparation des lymphocytes T pour cette étape, utilisez des lymphocytes T cultivés toute la nuit en présence d'IL-7, isolés par sélection positive des cellules CD4 à l'aide de billes magnétiques selon la méthode de purification Miltenyi MACS, comme décrit dans l'article JoVE précédemment publié par Matthew et Callaghan. Lavez les lymphocytes T dans du HBSS pendant cinq minutes à 300 × g à 20 °C. Resuspendez-les dans du HBSS frais à une concentration de 10 × 10⁶ cellules par millilitre.Ensuite, ajouter un micromolaire de traceur cellulaire vert C-M-F-D-A dans un tube d'HBSS et combiner cette solution avec la solution cellulaire pour obtenir une concentration finale de colorant de 0,5 micromolaire. Incuber la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du milieu RPMI complet pendant cinq minutes à 300 × g et à 20 degrés Celsius, resuspendre les lymphocytes T marqués à une concentration finale de 10 × 10⁶ cellules par millilitre.Dans du milieu de culture complet RPMI frais, récupérez les tranches de ganglion lymphatique de l'incubateur. Retirez à l’aide d’une pipette le milieu excédentaire contenu au centre du compartiment sans toucher le tissu. À l’aide de la pointe de la pipette, délivrez délicatement de 10 à 20 microlitres de lymphocytes T marqués au centre du compartiment.Veillez à ce que la goutte de suspension cellulaire reste en place. Incubez les tranches tissulaires et les lymphocytes T pendant au moins 30 minutes afin de permettre aux lymphocytes de migrer vers le tissu. Pour commencer l'acquisition d'images, réglez la chambre de contrôle de température du microscope à 37 degrés Celsius.Remplissez un système de perfusion afin de permettre une perfusion continue de la coupe de ganglion lymphatique avec un milieu RPMI sans phénol rouge et oxygéné ; réchauffez également un petit plat en plastique contenant du RPMI oxygéné à ce moment-là. Dans le système illustré ici, le milieu perfusé pénètre dans la chambre d'observation par un côté sous l'effet de la gravité. Le milieu est aspiré à l’aide d’une pompe reliée à un récipient de collecte des déchets.À l’aide de pinces fines, retirez délicatement du incubateur les tranches de ganglion lymphatique infiltrées par les lymphocytes T. Retirez une tranche de ganglion lymphatique de la plaque à six puits. Plongez la tranche dans le milieu RPMI réchauffé et oxygéné pendant quelques secondes afin de rincer les cellules fluorescentes qui n’ont pas infiltré le tissu.Ensuite, placez la tranche fraîchement lavée à l’envers sur la chambre d’imagerie. Les fils de nylon surélèvent la tranche par rapport au verre et permettent à la solution oxygénée de diffuser dans le tissu. Cette étape est nécessaire car la migration des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques dépend fortement de l’oxygène.Ensuite, fixez la coupe en plaçant une rondelle en acier inoxydable par-dessus afin de capturer un large champ de vision. Acquérez les images à l’aide d’un objectif sec de 10 fois. Transférez la coupe de ganglion lymphatique fraîchement lavée, face vers le haut, dans une boîte en plastique.Placer une rondelle sur la préparation pour l'immobiliser. Les tranches sont désormais prêtes à être observées. Installer la préparation sur la platine du microscope confocal droit et faire la mise au point avec l'objectif 20 fois.Ensuite, démarrez une session d'acquisition d'images et commencez la récolte des données. C-M-F-D-A. Des lymphocytes T marqués en vert ont été ajoutés à une coupe de ganglion lymphatique 30 minutes avant l'acquisition d'images, comme illustré ici. L'image correspond à la projection maximale de cinq images couvrant 50 micromètres dans la direction Z, capturées à l'aide d'un microscope à champ large ici.On peut observer la même figure sous forme d'une image en champ clair dans cette vidéo. Des lymphocytes T fluorescents verts ayant infiltré une coupe de ganglion lymphatique sont imagés avec un microscope à champ large pendant neuf minutes. L'animation représente une projection Z de 50 microns.Remarquez la migration active des cellules T au sein de la coupe. Les trajectoires de cellules T individuelles provenant du même champ microscopique sont affichées ici sous forme de traînées codées par couleur, représentant leur déplacement croissant, allant des cellules peu mobiles en bleu aux cellules très mobiles en rouge. Les traînées ont été calculées à l'aide d'un Mars.La ligne blanche indique le bord du ganglion, tandis que les ovales en pointillés délimitent les zones B supposées. Ici, les cellules T ajoutées à une coupe de ganglion lymphatique ont été observées pendant 10 minutes au microscope confocal. L'animation représente une projection Z de 50 microns.Oui, cette technique peut être adaptée à d'autres types de tissus. Et ce qui est intéressant, c'est que la coupe en tranches est la seule méthode permettant d'explorer les mécanismes sous-jacents à la migration et à la localisation des lymphocytes T dans les tumeurs humaines. Par exemple.

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Analyse en temps réel de la migration des lymphocytes T résidents dans différentes régions tumorales à l’aide de la microscopie confocale

Haute résolution intravitale imagerie avec un contraste accru jusqu'à 120 um de profondeur dans les ganglions lymphatiques de la souris adulte est obtenue en modulant spatialement le modèle d'excitation d'un multi-focal microscope à deux photons. En 100 profondeur pm nous avons mesuré des résolutions de 487 nm (latéraux) et 551 nm (axial), contournant ainsi les limites de diffusion et de diffraction.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Les mécanismes qui régissent la motilité interstitielle des cellules CD4 T effecteurs aux sites d'inflammation sont relativement peu connus. Nous présentons une approche non invasive pour visualiser et manipuler dans des cellules in vitro -primed T CD4 dans le derme de l' oreille enflammée, ce qui permet pour l' étude du comportement dynamique de ces cellules in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

Nous décrivons ici un modèle de souris rapporteure transgénique pour visualiser les cellules productrices d’IL-22 à l’intérieur de différents tissus de souris. Cette méthode peut être utilisée pour suivre l’emplacement d’autres cytokines ou protéines de secrétaire chez la souris.

Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Ce protocole décrit une méthode pour image résident-infiltration tumorale T CD8 cellules marquées avec des anticorps fluorescent couplés au sein de tranches de tumeur du poumon humain. Cette technique permet des analyses en temps réel de la migration des cellules T CD8 par microscopie confocale.

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Nous décrivons une méthode pour visualiser gFP-étiquetée IELs utilisant l'imagerie intravitale de l'intestin grêle murine par microscopie confocale de disque de rotation inversée. Cette technique permet le suivi des cellules vivantes dans la muqueuse jusqu'à 4 h et peut être utilisée pour étudier une variété d'interactions intestinales immunisées-épithéliales.

Imagerie intravitale des lymphocytes intraépithéliales dans l'intestin grêle de Murine

La combinaison de l'étiquetage des anticorps, de la compensation optique et de la microscopie lumineuse avancée permet une analyse tridimensionnelle des structures ou organes complets. Décrit ici est une méthode simple pour combiner l'immunolabeling des tranches de rein épaisses, la compensation optique avec le cinnamate d'éthyle, et l'imagerie confocale qui permet la visualisation et la quantification des structures tridimensionnelles de rein.

Effacement optique et imagerie du tissu rénal immunolabeled

Découvrez l'imagerie ex vivo de cellules T fluorescentes dans des tranches de ganglions lymphatiques murins par microscopie widefield et confocale. Cette méthode permet d'analyser en temps réel la migration et la motilité des lymphocytes T dans le tissu lymphatique.

Ex vivo l'imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

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