Bioingénierie de l'homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

L'objectif général de cette procédure est de générer un réseau vasculaire humain in vivo. Cela est réalisé en cultivant d'abord des cellules formant des colonies endothéliales provenant du sang humain et des cellules souches mésenchymateuses provenant de la moelle osseuse humaine. Les deux types cellulaires sont ensuite mélangés à un gel à base de collagène, qui est injecté par voie sous-cutanée dans une souris immunodéficiente.

Sept jours plus tard, l'implant est récupéré et évalué pour la formation d'un réseau vasculaire humain. En fin de compte, la présence de microvaisseaux spécifiques à l'humain à l'intérieur des implants peut être vérifiée par histologie et immunohistochimie. Le principal avantage de cette technologie par rapport à une méthode plus invasive comme l'implantation chirurgicale de constructions est que la DEL est simple et facile à réaliser, et elle ne nécessite pas de chirurgie.

Commencez par décongeler un flacon de CFCs E et diluez immédiatement les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM. Centrifugez la suspension cellulaire à 1200 tr/min pendant cinq minutes et resuspendez le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu EGM deux chaud. Transférez ensuite les cellules dans une plaque de culture tissulaire de 100 millimètres revêtue de gélatine à 1 % et incubez les cellules toute la nuit dans un incubateur humidifié.

Le lendemain matin, aspirez délicatement le milieu et toutes les cellules non liées. Ensuite, nourrissez les cellules fixées avec 10 millilitres de milieu E GM deux frais. Poursuivez ce processus pendant les prochains jours jusqu’à la formation d’une monocouche confluente.

Ensuite, lavez les cellules avec 10 millilitres de PBS. Remplacez le PBS par deux millilitres de trypsine-EDTA et remettez la plaque dans l'incubateur pendant cinq minutes. Après cinq minutes, observez au microscope, tapez doucement sur la plaque et vérifiez si les cellules se sont détachées.

Sinon, répétez les courtes incubations avec agitation douce. Une fois que les cellules se sont complètement détachées, ajoutez huit millilitres de milieu EGM deux aux cellules et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Comptez les cellules et centrifugez-les à 1200 tr/min pendant cinq minutes.

Plaquez maintenant les cellules sur des plaques de culture tissulaire recouvertes de gélatine à 1 % à une densité d'ensemencement de 5 000 cellules par centimètre carré. Incubez les cellules dans le milieu EGM deux et nourrissez-les tous les deux à trois jours avec le milieu EGM deux. Répétez cette procédure pour les passages ultérieurs entre les passages quatre et huit.

Les CFC-E seront prêts à l'emploi. Ce protocole peut également être utilisé pour cultiver des CSM. Il suffit de remplacer le milieu E GM deux par le milieu M-S-C-G-M.

Utilisez une plaque de culture non revêtue. Commencez la subculture à une confluence de 80 % et effectuez la subculture à une densité d'ensemencement de 10 000 cellules par centimètre carré. Cette expérience nécessite 800 000 CFC-E et 1 200 000 CSM par implant.

Généralement, cinq implants sont préparés simultanément. Commencez par aspirer le milieu cellulaire des plaques de culture, puis rincez chaque plaque de cellules avec 10 millilitres de PBS. Remplacez le PBS par deux millilitres de trypsine-EDTA et incubez les plaques avec un mouvement doux de basculement.

Observer les cellules au microscope toutes les deux à cinq minutes jusqu'à ce que toutes les cellules se soient détachées. Ensuite, ajouter huit millilitres de DMEM et recueillir la solution cellulaire. Dans un tube conique de 15 millilitres, dénombrer les cellules et transférer un nombre suffisant de cellules pour cinq implants dans un seul tube conique de 15 millilitres.

Ensuite, centrifuger les cellules à 1200 tr/min pendant cinq minutes et éliminer le surnageant. Préparer soigneusement un mélange de fibrinogène et de fibronectine de collagène sur de la glace. Puis, reprendre délicatement le culot cellulaire dans le mélange glacé.

En évitant la formation de bulles d'air, chargez la suspension cellulaire dans une seringue d'un millilitre et fixez-y une aiguille de calibre 26 munie d'un capuchon. Conservez la seringue chargée sur de la glace jusqu'à l'injection du mélange cellulaire. Anesthésiez quatre souris athymiques nues immunodéficientes âgées de six semaines à l'aide d'une chambre contenant de l'isoflurane.

Une fois que les souris sont anesthésiées et ne réagissent plus à une pincée des orteils, procéder aux injections pour chaque souris. Utiliser une aiguille de calibre 30 pour injecter 50 microlitres de solution de thrombine par voie sous-cutanée dans la région dorsale supérieure. À l'endroit identique, injecter 200 microlitres du mélange cellulaire.

À l’aide d’une aiguille de calibre 26, les macromolécules injectées vont gélifier et former une petite bosse perceptible sous la peau. Après l’injection, placer les souris sur une couche de gaze pour plus de confort et de chaleur. Les observer jusqu’à ce qu’elles reprennent la marche.

Pendant les trois jours suivants, effectuez une observation quotidienne de l'état de santé général de l'animal. Une semaine après les injections, euthanasiez les souris au dioxyde de carbone et retirez chirurgicalement le bouchon de gel. Une fois récupérés, photographiez les bouchons de gel en les plaçant à côté d'une règle, puis placez chaque bouchon de gel dans une cassette histologique et immergez-les toute la nuit à température ambiante dans du formol tamponné neutre à 10 %.

Le lendemain, lavez le formol tamponné neutre à 10 % avec de l'eau distillée. Conservez les cassettes dans du PBS à quatre degrés Celsius jusqu'à leur évaluation histologique. Réalisez des coupes de sept micromètres de l'implant inclus dans la paraffine.

Ensuite, quantifiez la densité des microvaisseaux dans la partie médiane des implants. À l'aide d'une coloration H et E, déterminez le nombre de vaisseaux par millimètre carré afin de démontrer la nature humaine des microvaisseaux. Coloriez les coupes avec un anticorps anti-CD31 humain disponible dans le commerce à une dilution de un à cent.

Cette image en contraste de phase montre la morphologie caractéristique en pavage des cellules endothéliales dans une monocouche confluente typique de CFC-e provenant de sang de cordon. Cette image montre la morphologie typique en forme de fuseau des CSM dérivées de la moelle osseuse humaine. Après une semaine d'incubation dans l'hôte murin, l'implant marqué par une ligne pointillée jaune présentait un aspect très différent de celui des tissus de l'hôte en forte augmentation.

Plusieurs microvaisseaux ont révélé leurs structures luminales contenant des globules rouges et sont mis en évidence par les flèches jaunes. Lorsque les prélèvements ont été examinés par immunohistochimie, la lumière des microvaisseaux s'est révélée réactive à un anticorps monoclonal dirigé contre la molécule humaine CD 31. Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés à l'hématine.

Une fois maîtrisée, cette technologie peut être réalisée en moins d'une once si elle est effectuée correctement.