Bioingénierie de l'homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

L’objectif global de cette procédure est de générer un réseau vasculaire humain in vivo. Ceci est accompli en cultivant d’abord des cellules endothéliales formant des colonies dérivées de sang humain et des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine. Les deux types de cellules sont ensuite mélangés dans un gel à base de collagène, qui est injecté par voie sous-cutanée dans une souris immunodéficiente.

Sept jours plus tard, l’implant est récolté et évalué pour la formation d’un réseau vasculaire humain. En fin de compte, la présence de microvaisseaux spécifiques à l’homme à l’intérieur des implants peut être vérifiée grâce à son histologie et à son immunohistochimie. Le principal avantage de cette technologie par rapport à une méthode acide comme l’implantation chirurgicale de construction est la LED, elle est simple et facile à réaliser, et elle ne nécessite pas de chirurgie.

Commencez par décongeler un flacon de CFC E et diluez immédiatement les cellules dans un cône de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM. Faites tourner la suspension cellulaire à 1200 tr/min pendant cinq minutes et Resus suspendez la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu EGM chaud. Transférez ensuite les cellules dans une plaque de culture tissulaire de 100 millimètres recouverte de 1 % de gélatine et incubez les cellules pendant la nuit dans un incubateur humidifié.

Le lendemain matin, aspirez doucement le milieu et toutes les cellules non liées. Nourrissez ensuite les cellules liées avec 10 millilitres de milieu frais E GM deux. Continuez ce processus au cours des prochains jours jusqu’à ce qu’une monocouche confluente se forme.

Lavez ensuite les cellules avec 10 millilitres de PBS. Remplacez le PBS par deux millilitres de tripsin EDTA et remettez la plaque dans l’incubateur pendant cinq minutes. Après cinq minutes sous un microscope, tapotez doucement la plaque et vérifiez si les cellules se sont détachées.

Sinon, répétez les brèves incubations avec un léger balancement. Une fois que les cellules se sont complètement détachées, ajoutez huit millilitres de milieu EGM deux aux cellules et transférez les cellules dans un conique de 15 millilitres. Comptez les cellules et faites-les tourner à 1200 tr/min pendant cinq minutes.

Maintenant, plaquez les cellules sur des plaques de culture tissulaire recouvertes de 1 % de gélatine à une densité d’assise de 5 000 cellules par centimètre carré. Dans le milieu EGM deux, incubez les cellules et nourrissez-les tous les deux à trois jours avec le milieu EGM deux. Répétez cette procédure pour les passages suivants entre les passages quatre et huit.

Les CFC E seront prêts à l’emploi. Ce protocole peut également être utilisé pour faire grandir les MSC. Il suffit de remplacer le moyen E GM two par le moyen M-S-C-G-M.

Utilisez une plaque de culture non revêtue. Commencer la sous-culture à 80 % de confluence et la sous-culture à une densité d’ensemencement de 10 000 cellules par centimètre carré. Cette expérience nécessite 800 000 E CFC et 1 200 000 MSC par implant.

Généralement, cinq implants sont préparés simultanément. Pour commencer, aspirez un milieu cellulaire des plaques de culture et lavez chaque plaque de cellules avec 10 millilitres de PBS. Remplacez le PBS par deux millilitres de trypsine EDTA et incubez les plaques avec un léger balancement.

Vérifiez les cellules au microscope toutes les deux à cinq minutes jusqu’à ce qu’elles se soient toutes détachées. Ajoutez ensuite huit millilitres de DMEM et récupérez la solution cellulaire. Dans une conique de 15 millilitres, comptez les cellules et transférez suffisamment de cellules pour cinq implants dans une seule conique de 15 millilitres.

Ensuite, faites tourner les cellules à 1200 tr/min pendant cinq minutes et retirez le snat. Préparez soigneusement un mélange de fibrinogène et de fibronectine de collagène sur de la glace. Ensuite, remettez très doucement en suspension la pastille de cellule dans le mélange glacé.

En évitant la formation de bulles d’air, chargez la suspension cellulaire dans une seringue d’un millilitre et fixez-y une aiguille de calibre 26 bouchée. Maintenez la seringue chargée sur de la glace jusqu’à ce que le mélange cellulaire soit injecté. Anesthésiation de quatre souris immunodéficientes nues athymiques âgées de six semaines à l’aide d’une chambre au fluor ISO.

Une fois que les souris sont anesthésiées et ne répondent plus au pincement des orteils, procédez aux injections pour chaque souris. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez 50 microlitres de solutions de thrombine par voie sous-cutanée dans la région dorsale supérieure. Au même endroit, injectez 200 microlitres du mélange de cellules.

À l’aide d’une aiguille de calibre 26, les macromolécules injectées vont se gélifier et former une petite mais appréciable bosse sous la peau. Après l’injection, placez les souris sur une couche de gaze pour plus de confort et de chaleur. Observez-les jusqu’à ce qu’ils deviennent ambulatoires.

Au cours des trois prochains jours, faites une observation quotidienne de l’état de santé général de l’animal. Une semaine après les injections, euthanasiez les souris avec du dioxyde de carbone et retirez chirurgicalement le bouchon de gel. Une fois récupérés, photographiez les bouchons de gel à côté d’une règle, puis placez chaque bouchon de gel dans une cassette histologique et immergez-les dans de la formine tamponnée à 10 % neutre pendant la nuit à température ambiante.

Le lendemain, lavez la formine tamponnée à 10 % neutre avec de l’eau distillée. Conservez les cassettes dans le PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient évaluées pour une évaluation histologique. Faites des sections de sept microns de l’implant intégrées dans de la paraffine.

Quantifiez ensuite la densité des micro-vaisseaux dans la partie médiane des implants. À l’aide d’une coloration H et E, marquez le nombre de vaisseaux par millimètre carré pour démontrer la nature humaine des vaisseaux microvasculaires. Colorez les sections avec un anticorps anti-CD 31 humain disponible dans le commerce à une dilution de un à 100.

Cette image en contraste de phase montre la morphologie caractéristique des pavés des cellules endothéliales dans une monocouche confluente typique de sang de cordon dérivé des CFC. Cette image montre la morphologie typique de la forme du fuseau des CSM dérivées de la moelle osseuse humaine. Après une incubation d’une semaine chez la souris hôte, l’implant marqué d’une ligne pointillée jaune semblait très différent des tissus de l’hôte à un grossissement plus élevé.

Plusieurs microvaisseaux ont été révélés, leurs structures luminales contenant des globules rouges et sont mis en évidence par les pointes de flèches jaunes. Lorsque les bouchons ont été examinés immunohistochimiquement, la lumière des microvaisseaux était réactive à un anticorps monoclonal contre le CD 31 humain. Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec de l’hématine.

Une fois maîtrisée, cette technologie peut être réalisée à une once près si elle est exécutée correctement.