Name: Placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez la préparation in ovo pour étudier le destin cellulaire chez les embryons de poulet E2.5. Cette méthode utilise des billes imbibées de facteurs de croissance pour explorer la différenciation tissulaire en neurobiologie.

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1. Retirer les oeufs de l&#39;incubateur A E2-2.5 (~ 17 Saint HH), retirez les oeufs et les préparer en conséquence. Ils peuvent être travaillés immédiatement ou retournés à la couveuse pendant quelques heures. Les œufs peuvent être placés à la température ambiante en toute sécurité pendant plus d&#39;une heure. Les œufs peuvent rester en dehors, pour la durée des manipulations. Parfois, ils peuvent prendre une heure ou plus. Remarque: Plus ils restent longtemps à température ambiante, moins ils sont susceptibles de survivre. 2. Préparation de l&#39;encre de Chine <ol><li> Préparer une solution fraîche de l&#39;encre de Chine 4% dans du PBS stérile. </li><li> Remplir une seringue de 3 ml avec la solution. </li><li> Placer une aiguille de calibre 27 ½, pouce sur la seringue. </li><li> En utilisant une paire de pinces hémostatiques, plier l&#39;aiguille à un angle de 90 °. </li></ol> 3. Ouverture des œufs et l&#39;injection d&#39;encre de Chine <ol><li> En utilisant une paire de forceps, peler la cassette et ouvrez la fenêtre, en le fixant en utilisant le verso de la bande sur la face arrière de l&#39;œuf. </li><li> Guide de l&#39;aiguille inclinée jusqu&#39;à ce qu&#39;elle se situe juste en dessous de l&#39;embryon. Placer l&#39;aiguille sous le disque flottant assure que l&#39;encre, qui est toxique pour l&#39;embryon, ne viendra pas en contact direct. </li><li> Vous devez seulement d&#39;injecter suffisamment d&#39;encre pour créer un contraste confortable. Cela est généralement inférieur à mL ¼. </li></ol> 4. L&#39;ouverture du tube neural <ol><li> Prenez une paire de ciseaux de dissection fine et couper la fine membrane qui se trouve sur le dessus, ou parfois autour de l&#39;embryon. </li><li> Prenez une paire de pince 55 ou une sonde de tungstène et d&#39;ouvrir le tube neural d&#39;arrière en avant. Assurez-vous que l&#39;ouverture est assez grand pour placer un cordon en elle. </li></ol> Remarque: Selon l&#39;âge, une sonde de fin de tungstène peuvent être utilisés pour faire la même chose. 5. Récupération d&#39;un revêtement en acrylique perles héparine <ol><li> En utilisant une paire de pince 55, de trouver une perle intacte dans la solution. Laissez le cordon de s&#39;attacher à la pointe, fermer lentement la pince. </li><li> Retirer le cordon de la solution et l&#39;amener plus sur le sommet de l&#39;œuf. </li><li> Une fois que la bille est hors de sa solution, il ne sera probablement pas se détacher jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait été placé dans l&#39;albumine. </li></ol> 6. Placer le cordon de <ol><li> Une fois la perle a été placé sur le dessus de la zone cible, l&#39;utilisation d&#39;une sonde de tungstène pour le guider vers le cerveau antérieur ou le fixer dans le cerveau postérieur. </li><li> Ajouter quelques gouttes de PBS à l&#39;aide d&#39;une pipette 10 ul. </li></ol> 7. Fermeture de l&#39;oeuf <ol><li> Fermer l&#39;œuf à l&#39;aide du petit morceau de ruban adhésif pour fermer la fenêtre. </li><li> Sceau de l&#39;œuf, selon le protocole apprêter, disponible à <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Selon les protéines que vous souhaitez utiliser, il existe des protocoles différents sur la façon de préparer les perles. Dans ces expériences, nous utilisons l&#39;héparine acryliques perles, mais Affi-Gel perles peuvent également être utilisés. Nous avons trouvé que les billes d&#39;héparine-acryliques sont plus faciles à manipuler dans l&#39;environnement aqueux de l&#39;albumine d&#39;oeuf. Les perles sont trempés dans 5 l de protéines nuit à 4 ° C. Perles de contrôle sont placés dans du PBS stérile jusqu&#39;au moment du placement. L&#...

<table><tbody><tr><td>Œufs</td><td>Animal</td><td></td><td></td><td>Fecondés, E2-2,5 (~ stade 17 HH)</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Encre de Chine</td><td>Outil</td><td>Higgins</td><td></td><td>Préparer une solution à 4 % dans du PBS stérile.</td></tr><tr><td>PBS stérile</td><td></td><td></td><td></td><td>Alternativement, un cocktail d'anticorps peut être utilisé</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles 27G 1/2</td><td>Outil</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Inclinées à 90 degrés</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Outil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>taille 55</td></tr><tr><td>Pinces hémostatiques</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Bande de Parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>pour sceller les œufs</td></tr><tr><td>Microsonde au tungstène</td><td>Outil</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Outil n°24. Poignée en option.</td></tr></tbody></table>

placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Le tube neural exprime de nombreuses protéines spécifiques dans les schémas spatio-temporelle pendant le développement. Ces protéines ont été montré pour être critique pour la détermination du destin cellulaire, migration cellulaire, et la formation des circuits neuronaux. L&#39;induction neuronale et la structuration impliquent des protéines morphogénétiques osseuses (BMP), Sonic hedgehog (SHH), facteur de croissance des fibroblastes (FGF), entre autres. En particulier, le profil d&#39;expression de Fgf8 est à proximité de régions BMP4 et SHH exprimer. Ce schéma d&#39;expression est compatible avec les interactions de développement qui facilitent la structuration dans le télencéphale. Ici, nous offrir une démonstration visuelle d&#39;une méthode dans laquelle une préparation ovo peut être utilisé pour tester les effets des FGF dans la formation du cerveau antérieur. Perles sont revêtues de protéines et placé dans le tube neural de développement à fournir une exposition prolongée. Parce que la procédure utilise de petites perles soigneusement placé, il est peu invasive et permet plusieurs perles pour être placé dans un seul tube neural. Par ailleurs, la méthode permet le développement continu de sorte que les embryons peuvent être analysées à un stade plus mature pour détecter des changements dans l&#39;anatomie et à la structuration neuronale. Ce protocole simple mais utile pour l&#39;imagerie permet en temps réel. Il fournit un moyen de faire spatialement et temporellement des changements limités à des niveaux de protéine endogène.

Une variété de facteurs de croissance et les protéines interagissent pour induire les cellules à prendre sur le destin des cellules différentes lors du développement. Ici nous démontrons l&#39;utilisation d&#39;un en préparation pour répondre ovo interactions possibles entre les différentes protéines dans le développement en plaçant des perles sur E2.5 embryons de poulet.

Placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène

Le tube neural exprime de nombreuses protéines selon des schémas spatiotemporels spécifiques au cours du développement. Il a été démontré que ces protéines sont essentielles pour la cellule...

Bienvenue dans le laboratoire Raburn. Je suis Matt Korn, du département de Neurobiologie et de Comportement de l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, nous allons prendre un œuf, l'ouvrir et y placer une perle imprégnée de facteur de croissance.La préparation remarquable d'un œuf nous permettra d'ajouter un facteur de croissance afin de modifier le destin d'un certain nombre de types de tissus différents à ce stade précoce du développement embryonnaire. Deux jours et demi, ou stade 17. Très bien, nous sommes donc ici au microscope.J'ai mes œufs et tous mes outils. Alors, allez-y, prenez simplement un œuf ici et vous pouvez voir où se trouve notre ruban. Joint de vitrage.J'ai ce joli petit beignet. Il est simplement fabriqué en argile artistique que l'on peut trouver dans une boutique d'art. Et je vais prendre une paire de forceps très médiocre.Ils existent depuis longtemps. Les extrémités sont assez émoussées, mais elles fonctionnent très bien pour soulever légèrement le ruban adhésif afin que la fenêtre apparaisse. Je peux les poser.Je vais simplement replier ceci et glisser l'œuf, cette fenêtre, derrière comme ceci. Maintenant, je peux le placer sous le microscope et effectuer tout type de manipulation. Dans ce cas, nous allons utiliser les billes, et je vais prendre mon encre de Chine tout de suite, sans l'encre de Chine.On peut voir qu'il y a un petit disque embryonnaire ici même, légèrement décalé sur le côté. Donc, si je tourne simplement l'œuf, je peux voir où un peu de sang forme un cercle ici. Et je peux alors prendre mon aiguille avec l'encre de Chine.Et je vais simplement me déplacer sur le côté ici, et je vais passer sous le disque où se trouve un embryon. Je ne veux pas en mettre trop, juste assez pour voir le contraste de l'embryon par rapport au fond noir. Ensuite, je vais simplement faire pivoter ceci afin que la partie dorsale de l'embryon soit orientée vers l'avant.Et ce que vous pouvez observer ici est la région céphalique. Le tube neural se prolonge ici et nous avons quelques somites qui nous permettent d'en déterminer l'âge. Et si je zoome davantage, nous pouvons constater que le cœur présente un battement très lent mais régulier, ce qui est excellent.Le cœur était là, mais il ne battait pas. Nous devrions être un peu préoccupés par le caractère vital de cet échantillon. Comme il n'y a pas de membrane épaisse qui le recouvre, je peux simplement utiliser ma sonde au tungstène ici.Je, et il y a une membrane fine, et je vais simplement déplacer cela afin de pouvoir accéder à l'embryon. Nous plaçons des billes dans le cerveau antérieur ainsi que dans le cerveau postérieur. Et pour celle-ci, je vais cibler le cerveau antérieur.Maintenant, pour y accéder, je dois traverser une membrane. Lorsqu'elles sont plus jeunes, je peux simplement utiliser une sonde au tungstène pour pénétrer par le tube neural et atteindre la région où je souhaite placer la perle. Maintenant, je vais utiliser ma sonde au tungstène.Et j'utilise mes deux mains simplement pour stabiliser ma main. Je vais maintenant manœuvrer l'embryon. Dès que j'aurai introduit la perle ici, je pourrai la placer directement dans le tube neural et jusqu'au cerveau antérieur.Très bien, maintenant que j'ai ouvert l'embryon, je peux procéder à sa préparation et placer la perle. Ce que je vais faire, c'est enfoncer légèrement ma sonde plus profondément afin d'ouvrir le tube neural, ce que vous pouvez voir ici. Je vais maintenant zoomer un peu plus près.Je change légèrement mon point de focalisation ici. Et vous pouvez voir qu'il y a une petite ouverture intéressante, mais je n'ai pas encore fait de trou au-dessus de l'endroit où se trouve le céphalon de la queue, car c'est précisément là que va se placer la perle. Je ne veux donc pas de trou par lequel la perle pourrait s'échapper.Je veux qu’il soit un peu en retrait, comme ça je peux insérer la bille et la pousser vers l’avant. Maintenant, je vais donc prendre une bille. Vous pouvez voir qu’il existe plusieurs tailles différentes.Il s'agit d'acrylique héparinisée, placée dans du PBS. Je vais prendre une paire de forceps n°55. Vous pouvez voir que je vais plonger dans le PBS et que je vais simplement choisir celle qui me convient.Et une fois qu’il est sorti du PBS, il adhère généralement à la pince, on peut le voir là. Continuez et recouvrez les billes. Rendez-moi mon œuf.Je vais mettre l'œuf au point. Je vais donc avancer et placer la perle sur la pince 55. Elle est un peu plus haute sur la pince que ce que je préfère, mais c'est ainsi.Et je vais simplement le guider vers l’orifice que j’ai pratiqué dans le tube neural. Une fois qu’il est à l’intérieur du tube neural, il devient facile de le manipuler vers l’avant du cerveau en développement. Je vais donc prendre ma sonde en tungstène et simplement la pousser.Lorsque vous placez la perle dans le c&eacute;phalon, vous devez faire attention, car ce qui se produit, c'est que, lorsque l'embryon vieillit, il commence &agrave; fl&eacute;chir vers l'avant, puis sur le c&ocirc;t&eacute;. Tr&egrave;s souvent, lorsqu'on place une perle dans le cerveau ant&eacute;rieur, c'est-&agrave;-dire dans le c&eacute;phalon, elle tombe vers le bec, car le bec se forme dans la partie ventrale de l'embryon, l&agrave; o&ugrave; le cerveau se situe dans la r&eacute;gion dorsale. Mais ici, cela semble assez bon.Je suis plutôt satisfait de cela. Je vais prendre une pipette avec 10 microlitres de PBS stérile, et je vais simplement ajouter quelques gouttes ici. Bon, maintenant nous pouvons fermer l'œuf.Et ce que je vais faire, c'est simplement soulever la fenêtre ici, vers le haut et par-dessus, et l'œuf n'est pas encore scellé. Ce que je veux faire, pour qu'il ne s'assèche pas, c'est prendre un morceau de ce ruban plastique que nous avons utilisé et le couper. Il doit avoir à peu près la taille de la fenêtre, un tout petit peu plus grand.Et je vais l’étirer légèrement, puis je vais la positionner directement au-dessus de la fenêtre ici en veillant à ce qu’elle soit bien ajustée. Ainsi, tous les trous que nous avons faits, que ce soit lors du drainage de l’albumine ou de la découpe de la fenêtre, sont scellés. L’œuf est désormais hermétiquement fermé, il ne peut plus perdre d’uméno, et ne risque pas de se dessécher.Il devrait être capable de vieillir normalement. Voilà donc pour le positionnement des billes. Bonne chance avec vos expériences sur les poussins, et j'espère que vous obtiendrez les résultats souhaités.

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Biologie

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