Name: Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Découvrez comment mesurer la charge bactérienne et analyser les réponses immunitaires chez des souris infectées par Listeria monocytogenes. Cette méthode combine cytométrie en flux et comptage d'unités formant colonies pour caractériser les dynamiques cellulaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan et Jonathan Wilksch pour des conseils et des réactifs. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) et de la Santé et de l&#39;Australian National Medical Research Council (575552). NO est soutenue par un Prix d&#39;études supérieures en Australie. OW est soutenu par une bourse de RD Wright, de l&#39;Australian National Health Medical Research Council.

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<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Listeria est l'un des organismes les plus couramment utilisés pour caractériser les réponses immunitaires de l'hôte aux bactéries intracellulaires6. Le protocole présenté ici permet de mesurer la charge bactérienne et les réponses des cellules immunitaires au sein d'un même tissu chez une souris donnée. Cette double mesure effectuée sur un tissu particulier pour chaque souris infectée permet des comparaisons plus solides à l'intérieur et entre des groupes de souris (représentant soit des souches différentes, soit différents points temporels post-infection). Bien qu'une infection par Listeria par administration orale puisse également être utilisée pour étudier les réponses immunitaires chez la souris, l'injection intraveineuse est souvent préférée car : 1) elle assure un transport rapide et efficace dans la circulation sanguine ; 2) elle provoque une infection systémique synchronisée et reproductible ; et 3) l'espèce Mus porte une mutation dans le gène codant pour le récepteur E-cadhérine, ce qui limite l'infection par Listeria par voie orale (cette mutation affecte la capacité de Listeria à se lier au récepteur E-cadhérine de la souris et à franchir efficacement la muqueuse épithéliale du tractus gastro-intestinal)16-18.
Plusieurs étapes critiques sont présentes dans ce protocole. Premièrement, la souche d'inoculum de Listeria doit être préparée à partir d'une culture fraîche sur HBA incubée une nuit entière, afin de garantir la viabilité et la virulence. Deuxièmement, il est important de déterminer précisément la concentration en UFC de l'inoculum avant et après l'injection de chaque souris, afin de s'assurer que cette concentration n'ait pas varié de manière significative entre la première et la dernière souris injectée. Troisièmement, l'injection de Listeria dans la veine caudale doit être réalisée de manière uniforme pour toutes les souris. Enfin, il est nécessaire de perfuser le foie afin d'éliminer les leucocytes non résidents, ce qui permet une mesure précise des cellules immunitaires présentes dans le foie, et non celle des leucocytes circulant dans le sang périphérique. Toutes ces étapes, si elles ne sont pas correctement exécutées, peuvent entraîner une variabilité indésirable du fardeau bactérien et/ou des réponses immunitaires entre les souris individuellement infectées par Listeria.
Deux limites de ce protocole sont la compétence de l'expérimentateur pour infecter les souris par injection intraveineuse et la détection de la charge bactérienne dans les tissus. Si une même personne injecte un grand nombre de souris, la viabilité de Listeria (c'est-à-dire la concentration en UFC) peut diminuer au fil du temps une fois l'inoculum congelé décongelé (par exemple, &gt;2 heures entre l'injection de la première et de la dernière souris). Il incombe à l'expérimentateur de déterminer combien de souris il ou elle peut injecter avant que l'inoculum ne soit compromis. Une autre limitation de cette méthode est que la charge de Listeria ne peut pas être mesurée avec précision en dessous de 100 UFC/organe en raison des quantités relativement faibles d'homogénat tissulaire cultivé (par exemple, la Figure 3 indique que 100 UFC/organe constitue la limite de détection). Pour mesurer plus précisément des valeurs inférieures d'UFC/organe, une plus grande quantité d'homogénat tissulaire peut être cultivée (jusqu'à 0,5 mL par boîte, plusieurs boîtes pouvant être utilisées), afin d'échantillonner une plus grande proportion du tissu pour la détection de Listeria. En l'absence de Stomacher, des méthodes alternatives d'homogénéisation du tissu, comme l'utilisation d'un homogénéisateur tissulaire, peuvent être utilisées à la place aux étapes 7.1-7.2. Sur le plan pratique, si l'espace dans l'incubateur à 37 °C est limité pour la culture des échantillons tissulaires provenant de souris infectées, les boîtes de culture HBA peuvent être incubées à température ambiante pendant 2 à 3 jours (les colonies croîtront plus lentement à température ambiante). Toutefois, la température ambiante ne doit pas être utilisée lors de la culture destinée à la préparation de stocks congelés de Listeria.
Ce protocole décrit une approche de base pour caractériser l'infection par Listeria chez la souris et peut être utilisé avec d'autres souches de Listeria que la souche EGD. En plus du foie et de la rate, des suspensions unicellulaires peuvent également être préparées à partir de ganglions lymphatiques. Dans les deux cas, ces suspensions unicellulaires peuvent être utilisées pour diverses analyses, notamment la quantification des sous-populations de cellules immunitaires et la stimulation in vitro de cellules immunitaires triées. Une fois les techniques de base maîtrisées, ce protocole peut également être adapté pour isoler des lymphocytes T spécifiques de Listeria19, caractériser les cellules dendritiques20, ou réaliser une épuisement des cellules immunitaires à certains moments après l'infection21,22, afin de caractériser plus précisément la réponse immunitaire chez les souris infectées par Listeria.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Cheval gélose au sang de base n ° 2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Préparation de la gélose de base pour les plaques HBA </td></tr><tr><td> Le sang de cheval (défibriné) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Ajouter 5-10% à la base d&#39;agar </td></tr><tr><td> Brain Heart Infusion (BHI) (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Les médias du cerveau coeur perfusion déshydratée </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits à fond plat </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 tamis cellulaire um </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Petite boîte de Pétri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 Biomaster laboratoire de système de </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sacs en plastique Stomacher </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;albumine sérique bovine </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon FACS </td><td></td><td></td><td> 0,1% (p / v) de sérum albumine bovine dans du PBS </td></tr><tr><td> Isotonique Percoll (33,75 Percoll% dans PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, PBS 1x 62.5mL fait 100mL isotonique Percoll </td></tr><tr><td> TAC Tampon </td><td></td><td></td><td> Tris 17mm, 140mm de chlorure d&#39;ammonium dans l&#39;eau distillée </td></tr><tr><td> FCS / EDTA </td><td></td><td></td><td> Sérum de veau fœtal à 10mm EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA </td><td></td><td></td><td> FACS tampon + EDTA 5mM </td></tr><tr><td> Le bleu trypan </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (p / v) dans du PBS, stérilisée par filtration </td></tr><tr><td> 2mL Cryovial </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 seringue à insuline gauge/1mL </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;aiguille </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Seringue </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01T (1ml), SS-053 (5 ml), le SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) est un agent pathogène facultatives Gram-positives intracellulaires 1. Études sur les souris utilisent généralement une injection intraveineuse de la bactérie Listeria, qui se traduit par une infection systémique 2. Après l&#39;injection, Listeria diffuse rapidement à la rate et du foie due à l&#39;absorption par CD8a + cellules dendritiques et les cellules de Kupffer 3,4. Une fois phagocyté, différentes protéines bactériennes permettent d&#39;échapper à la Listeria phagosome, survivre dans le cytosol, et infecter les cellules voisines 5. Pendant les trois premiers jours de l&#39;infection, différentes cellules immunitaires innées (monocytes, par exemple, les neutrophiles, les cellules NK, cellules dendritiques) arbitrer les mécanismes bactéricides qui minimisent la prolifération de Listeria. Lymphocytes T CD8 + sont ensuite recrutés et responsable de l&#39;apurement éventuel de Listeria provenant de l&#39;hôte, habituellement dans les 10 jours d&#39;infection 6. Dédouanement réussie de Listeria chez les souris infectées dépend de la survenue de réactions appropriées immunitaire de l&#39;hôte 6. Il ya un large éventail de sensibilités parmi les souches de souris consanguines 7,8. Généralement, les souris à une susceptibilité accrue aux infections Listeria sont moins capables de contrôler la prolifération bactérienne, démontrant augmentation de la charge bactérienne et / ou une clairance retardée par rapport à des souris résistantes. Des études génétiques, y compris les analyses de liaison et de souches de souris knock-out, ont identifié des gènes différents pour lesquels la variation des séquences affecte réponses de l&#39;hôte à l&#39;infection Listeria 6,8-14. Détermination et comparaison des cinétiques d&#39;infection entre les différentes souches de souris est donc une méthode importante pour l&#39;identification des facteurs génétiques de l&#39;hôte qui contribuent à la réponse immunitaire contre la bactérie Listeria. Comparaison des réponses de l&#39;hôte à différentes souches de Listeria est également un moyen efficace d&#39;identifier les facteurs de virulence bactériens qui peuvent servir de cibles potentielles pour un traitement antibiotique ou de la conception du vaccin. Nous décrivons ici une méthode simple pour mesurer la charge bactérienne (unités formant colonie [CFU] par les tissus) et la préparation des suspensions à cellule unique du foie et la rate pour une analyse FACS des réponses immunitaires chez des souris infectées par Listeria. Cette méthode est particulièrement utile pour la caractérisation initiale de l&#39;infection par Listeria dans les souches de souris roman, ainsi que la comparaison des réponses immunitaires entre les différentes souches de souris infectées par la bactérie Listeria. Nous utilisons la bactérie Listeria monocytogenes EGD souche 15, qui, lorsqu&#39;elles sont cultivées sur gélose au sang, présente une zone halo caractéristique autour de chaque colonie, en raison de β-hémolyse 1 (figure 1). Charge bactérienne et les réponses immunitaires peuvent être déterminés à tout moment-point après l&#39;infection par homogénat de tissu en culture sur gélose au sang et à la préparation de suspensions de cellules de tissu pour analyse FACS en utilisant les protocoles décrits ci-dessous. Nous tenons à souligner que les personnes qui sont immunodéprimées ou enceintes ne devraient pas manipuler de Listeria, et les institutionnels concernés comité de biosécurité et la gestion de l&#39;animalerie doit être consulté avant le début des travaux.

Listeria monocytogenes est un organisme modèle pour étudier les réponses immunitaires et une susceptibilité génétique à des bactéries intracellulaires chez les souris. Cette méthode permet de mesurer la charge bactérienne et de générer une seule cellule de suspensions de foie et de rate de souris pour l&#39;analyse de FACS pour déterminer les changements dans les cellules immunitaires dues à l&#39;infection par Listeria.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) est un agent pathogène intracellulaire facultatif à Gram positif1. Les études sur les souris utilisent généralement l'injection intraveineuse de...

Ce vidéo montre une méthode permettant de mesurer la charge bactérienne et de produire ainsi que d'analyser des suspensions monocellulaires à partir de souris, de foie et de rate. Premièrement, un inoculum de listeria est préparé et injecté par voie intraveineuse chez des souris. Ensuite, le sang, le foie et la rate sont prélevés sur des souris euthanasiées à des temps choisis.Des suspensions uniques de cellules sont préparées à partir de tissus récoltés et d'homogénats de tissus AC cultivés sur des boîtes de gélose au sang de cheval. Les suspensions cellulaires obtenues peuvent ensuite être analysées pour leur viabilité et leur teneur en cellules immunitaires par analyse en fax, tandis que la charge bactérienne est déterminée en fonction des unités formant des colonies. Cette méthode peut aider à caractériser les réponses immunitaires aux infections stéroïdiennes, telles que celles observées entre souches mâles sensibles et résistantes, tout en déterminant simultanément la charge bactérienne dans les organes infectés.Commencez cette procédure en préparant l'inoculum de listeria à la concentration souhaitée. Les instructions pour la culture, le stockage et la préparation de la listeria sont disponibles dans le protocole écrit joint. Une fois l'inoculum prêt, transférez deux aliquotes de 100 microlitres dans des tubes microfusés stériles contenant chacun 900 microlitres de PBS afin d'obtenir une dilution au 1/10. Ensuite, transférez 100 microlitres de chaque dilution sur des boîtes de gélose au sang de cheval (HBA) et étalez soigneusement à l’aide d’un outil d’étalage stérile pour effectuer des dénombrements d’unités formant colonies (UFC). Incubez ensuite les boîtes retournées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Puis, transférez les souris dans une cage propre.Placer la cage à 50 centimètres sous une lampe infrarouge de 250 watts pendant cinq minutes afin de garantir la dilatation de la veine caudale. Cela permet une meilleure visualisation pendant l'injection. Voici la souche de souris résistante à Listeria, C57BL/6, et la souche de souris sensible à Listeria. Valve C sera injectée ; mélanger délicatement la suspension de Listeria en retournant le tube plusieurs fois.Ensuite, chargez une seringue d'un millilitre équipée d'une aiguille de calibre 27 pour injecter 200 microlitres par souris. Veillez à purger tout bulle d'air présente dans la seringue avant l'injection. Placez la souris dans un dispositif de contention.Ensuite, localisez la veine latérale de la queue de la souris en identifiant d'abord l'artère caudale, située au milieu de la face dorsale. Tournez ensuite légèrement la queue vers le côté latéral afin d'identifier la veine. Essuyez doucement la queue avec un tampon contenant de l'éthanol à 70 %, puis injectez après avoir retiré la seringue.Appliquez brièvement une pression sur la plaie d'entrée avec un carré de gaze stérile. Notez qu'il est beaucoup plus difficile d'identifier la veine de la queue chez les souris de couleur noire après l'injection. Replacez la souris dans sa cage après avoir injecté toutes les souris de la plaque et incubez l'inoculum restant pour effectuer des dénombrements d'unités formant colonies.Comme la veille, compter le nombre de colonies le lendemain et déterminer les concentrations de l'inoculum de listeria avant et après injection. L'halo caractéristique entourant les colonies individuelles, tel qu'illustré ici, est dû à l'hémolyse bêta. Une fois les dénombrements avant et après injection effectués, calculer la moyenne des unités formant des colonies en additionnant les valeurs des unités formant des colonies avant et après injection, puis en divisant par deux.Enfin, à différents moments après l'injection, prélevez du sang et récupérez le foie et la rate chez des souris sacrifiées. Si une analyse par fax doit être réalisée, le foie doit être perfusé avant son prélèvement afin d'obtenir du sang ; effectuez immédiatement après l'euthanasie une saignée cardiaque et collectez autant de sang que possible dans un tube de prélèvement approprié. Pour perfuser le foie, commencez par ouvrir la cavité abdominale et retirez puis jetez la vésicule biliaire.La veine cave interne est une veine qui court parallèlement à la colonne vertébrale et transporte le sang depuis la partie inférieure du corps, y compris le foie, vers le cœur. À l’aide d’une paire de ciseaux, sectionnez la veine juste sous le cœur afin de créer une sortie pour le liquide de perfusion. Ensuite, retournez les lobes hépatiques vers la tête et déplacez les intestins vers la droite afin d’exposer la veine porte hépatique, qui pénètre par la partie inférieure du foie.Par le côté inférieur droit, insérez un aiguille courbée de 26 gauge d'une longueur d'un demi-pouce dans la veine porte hépatique et injectez 10 millilitres de PBS. Après l'injection d'un à deux millilitres de PBS, le foie passera d'une couleur rouge foncé à une couleur brun clair. La solution injectée s'écoulera par la veine cave inférieure sectionnée. La perfusion hépatique garantit que les cellules récupérées proviennent du foie et non du sang circulant.Ensuite, retirez le foie perfusé de la cavité corporelle de la souris et immergez-le dans le tube contenant le tampon facts sur de la glace. Puis retirez la rate et placez-la sur de la glace pour un traitement similaire, comme décrit dans la section suivante. Pour obtenir des suspensions cellulaires hépatiques uniques à partir du foie, commencez par transférer le foie perfusé du tampon fax vers une passoire cellulaire de 70 microns placée dans une boîte de Pétri de 60 millimètres.À l’aide d’un piston de seringue de cinq litres, faire passer le tissu à travers le tamis cellulaire dans la boîte de Pétri. Transférer la suspension de cellules uniques dans un tube conique de 50 millilitres à bouchon vissable et compléter le volume total à 40 millilitres avec du tampon fax froid.Vortexez la suspension cellulaire. Ensuite, mettez de côté un aliquot de un millilitre pour la détermination de la charge bactérienne. Plus tard dans la procédure, placez le tube de 50 millilitres dans la centrifugeuse et faites précipiter les cellules par centrifugation à 500 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir éliminé le surnageant, répétez cette étape de lavage en resuspendant le culot dans 40 millilitres de tampon fax froid et en centrifugeant. Resuspendez à nouveau. Suspender le culot dans 20 millilitres de milieu isotonique par puits à température ambiante, puis centrifuger la suspension cellulaire à 700 ×g pendant 12 minutes à température ambiante.Après la centrifugation, une couche en forme de disque d'hépatocytes flottera au-dessus du Percoll, tandis que les leucocytes formeront un culot au fond du tube ; éliminez la couche d'hépatocytes et le Percoll en versant dans un récipient pour déchets. Resuspendez ensuite le culot contenant les leucocytes dans quatre millilitres de tampon TAC pour lyser les érythrocytes, puis incubez les cellules à température ambiante pendant un maximum de 10 minutes en retournant fréquemment. À l'issue de l'incubation, filtrez la suspension cellulaire à travers une membrane en nylon de 100 microns dans un nouveau tube de centrifugeuse de 10 millilitres.Recouvrir la suspension cellulaire filtrée avec un millilitre de tampon fax EDTA comme indiqué ici. Ensuite, centrifuger à 350 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, resuspendre dans cinq millilitres de tampon fax EDTA, puis centrifuger à nouveau et resuspendre le culot dans 0,5 à trois millilitres de tampon fax EDTA, selon la taille du culot. Déterminer le nombre de leucocytes hépatiques viables à l’aide d’un hémocytomètre selon l’exclusion par le bleu de trypan du foie.Des suspensions uniques de cellules peuvent ensuite être marquées avec des anticorps spécifiques pour les marqueurs de surface cellulaire souhaités et analysées par cytométrie en flux. Une fois que les suspensions uniques de cellules auront été obtenues à partir de tissus hépatiques et spléniques, les charges bactériennes seront déterminées pour certaines parties de la procédure. Une machine à homogénéiser sera utilisée pour homogénéiser le tissu en tenant fermé un sac ER gastrique afin de prévenir toute fuite.Commencez par l'étaler à plat sur une paillasse propre. Passez un stylo rond et épais sur le tissu jusqu'à ce qu'il soit broyé à l'intérieur du sachet. Ajoutez cinq millilitres de PBS dans chaque sachet stomacal contenant le tissu broyé.Placer l'estomac ou les poches dans l'estomac et faire fonctionner à grande vitesse pendant 10 minutes. La machine à estomac possède deux pales qui compriment l'estomac ou les poches à une vitesse définie, homogénéisant le contenu en une suspension uniforme et retenant les aérosols éventuels. À l’aide d’une pipette, mélanger l’homogénat dans la poche. Ensuite, transférer 300 microlitres en double exemplaire dans une plaque de 96 puits à fond plat.Dans les puits de la plaque 96 puits, effectuez une dilution sérielle de un à dix jusqu’à une dilution de dix puissance cinq. Pour chaque échantillon d’homogénat de tissu, utilisez soigneusement un étaleur stérile pour déposer 0,1 millilitre de chaque dilution sur une plaque HBA préalablement séchée. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, compter le nombre d'unités formant colonies pour chaque dilution et calculer les unités formant colonies par tissu en tenant compte de la fraction du tissu, des facteurs de dilution et du volume de l'homogénénat. Vérifier si des souris C57BL/6 ont été infectées avec environ 2000 unités formant colonies de *Listeria* à trois et sept jours post-infection, les souris ont été euthanasiées et le foie a été perfusé et récolté avec la rate. Des dilutions de l'homogénénat splénique ou de la suspension monocellulaire hépatique ont été cultivées sur des boîtes de gélose HBA afin de déterminer la charge bactérienne.Dans les résultats présentés ici, la ligne pointillée indique la limite de détection à 100 unités formant colonies par organe. Notez que la charge en listeria est plus élevée au troisième jour qu'au septième jour. Ceci s'explique par le fait qu'au septième jour, diverses cellules immunitaires contribuent à l'élimination de la listeria.Dans ces deux tissus, la rate et le foie, des suspensions cellulaires uniques ont été marquées au bleu de trypan et déposées sur un hémocytomètre. Les cellules situées dans la zone de comptage indiquée dans le cadre rouge seront comptabilisées. Les cellules non viables absorbent le bleu de trypan et apparaissent en bleu, tandis que les cellules viables restent incolores.Comme indiqué ici, le nombre de cellules viables dans la rate, représenté à gauche, et le nombre de leucocytes viables dans le foie, représenté à droite, augmentent au cours de l'infection. Cette augmentation est due aux cellules immunitaires, notamment les neutrophiles et les lymphocytes, qui s'activent, prolifèrent et migrent vers ces deux sites d'infection. À titre d'exemple des niveaux de cellules immunitaires au cours d'une infection à listeria, des histogrammes représentatifs et le nombre de lymphocytes T CD8 positifs sont présentés ici.Le nombre de cellules T CD8 positif diminue temporairement en raison de la lymphopénie dans la rate aux jours deux à trois, avant d'augmenter nettement à partir du jour cinq post-infection, tant dans la rate que dans le foie. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'oscillation des androgènes, l'analyse des cellules T spécifiques de l'antigène et les tests fonctionnels des cellules immunitaires triées peuvent être réalisées afin de caractériser davantage les réponses immunitaires à l'infection par Listeria.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

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