Name: Assay Rat angiogenèse Mésentère (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Apprenez l'angiogenèse de novo dans les fenêtres mésentériques du rat, un modèle quantitatif pour étudier la formation de vaisseaux sanguins et évaluer les agents modulateurs systémiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Soutien financier pour la plupart des études ont été fournies par le Conseil suédois de la recherche médicale (subvention 5942).

1. Animaux <ol><li> Les petits rongeurs comme les rats, souris et porcs Guinée, ont été utilisés comme des modèles animaux. Malheureusement, les souris adultes (de nombreuses souches de souris ont été évalués) ont tendance à manquer ou qui n&#39;ont qu&#39;un très faible nombre de potentiels-parent microvaisseaux (à partir de laquelle l&#39;angiogenèse peuvent provenir) au sein de leurs fenêtres mésentériques, ce qui rend les études utilisant des souris non fiables. Par conséquent, le dosage a été développé principalement pour les rats. </li><li> Les rats, qui sont acclimatés à un environnement standard d&#39;au moins 7 jours suivant la livraison de l&#39;éleveur, sont généralement logés par paires dans une cage standard sous un 12-hr cycle lumière / obscurité avec libre accès à l&#39;eau et de granulés. Chaque animal est marqué. Nous utilisons principalement des rats adultes jeunes (70-10 typiquement semaines d&#39;âge des différentes souches, mais en général des rats Sprague-Dawley; chez les rats jeunes que 5-6 semaines d&#39;âge, le nombre des microvaisseaux autochtones ont tendance à être faible) obtenu auprès d&#39;éleveurs diversifiés. Dans la période antérieure à l&#39;expérience et à travers l&#39;expérience, les animaux sont pesés tous les deux jours, et toujours sur le jour du sacrifice. Lorsque les animaux sont traités simultanément IP (pour l&#39;induction de l&#39;angiogenèse, voir ci-dessous) et SC ou IV ou PO, ils sont pesés chaque jour. Cela permet la création de groupes expérimentaux et de contrôle du poids du corps égale au début de l&#39;expérience, et permet la surveillance de l&#39;influence du traitement sur le poids corporel de gain au cours de l&#39;expérience. Depuis des rats mâles adultes croissance robuste physiologiquement (gagne environ 40-60 g par semaine selon le type de souche), le gain de poids de retard est un marqueur de substitution sensible de la toxicité, systémique bien-être, l&#39;anorexie, et un retard de croissance. </li></ol> Nous travaillons dans un établissement de haute qualité des soins aux animaux et des efforts considérables sont faits pour minimiser les niveaux de stress subi par les animaux. Les directives actuelles éthiques sont ceux établis par Workman P. et al. (Lignes directrices pour la protection et l&#39;utilisation des animaux dans la recherche contre le cancer. Br. J. Cancer 102, 1555-1577, 2010). Le Comité d&#39;éthique animale de l&#39;Université de Göteborg a approuvé ces études. 2. Pro-angiogéniques traitement par voie intrapéritonéale <ol><li> Le candidat pro-angiogéniques facteur à tester est dissoute et diluée dans l&#39;endotoxine saline utilisée pour la perfusion des patients (même à des niveaux extrêmement bas, l&#39;endotoxine est pro-angiogénique). Toutes les solutions sont constitués fraîchement sur le jour de l&#39;injection, une filtration stérile (Millipore 0,22 um-filtration), contrôlé pour un pH neutre (07/01 au 07/03), et utilisé à température ambiante. L&#39;agent de test est injecté à des concentrations faibles ou très faibles. Par exemple, le rat rVEGF 164 (564-RV/CF; R &amp; D Systems Europe, Ltd, Oxon, UK), qui est le VEGF-A prédominante isoforme chez le rat, est dilué à 96 pmol / ml dans une solution saline sans endotoxines, congelés et décongelés et un volume de 5 ml est injecté ip dans le rat. Nous utilisons une seringue de 5 ml avec 0,8 mm d&#39;aiguille (aiguille verte, 21G) pour injection ip. Ce traitement, administré deux fois par jour pendant 4,5 jours, soit., À partir de lundi matin (jour 0) au vendredi matin (jour 4), induit une réponse robuste angiogenèse germination dans les tissus de test mésentériques, avec un pic aux alentours de la Journée 21. Administrer l&#39;ip solution garantit que la totalité du volume est livré dans la cavité péritonéale (et non dans les intestins, la vessie ou de tout autre organe). L&#39;injection rapide de 5 ml permet de confirmer tactiles par l&#39;opérateur que le jet de fluide est passé à travers la paroi abdominale dans la cavité abdominale. Après, avant ou simultanément avec l&#39;ip pro-angiogéniques de traitement, tout agent de test de choix peuvent être administrés par voie systémique. </li></ol> 3. Administation systémique de l&#39;angiogenèse modulant agents <ol><li> Toute autre voie que la voie IP peut être utilisée, puisque le traitement IP peut affecter la réaction en cours angiogéniques par l&#39;induction de l&#39;inflammation ou éventuellement en activant les mastocytes dans les tissus d&#39;essai, qui peut conduire à une forte pro-angiogéniques de réponse. Outre l&#39;administration orale ou injection SC ou IV, nous utilisons souvent l&#39;administration SC en utilisant mini-pompes osmotiques (un ou plusieurs, avec des volumes variables et de pompage fois) pour fournir la solution à un taux constant jusqu&#39;à deux ou plusieurs semaines. </li><li> La perfusion continue sous-cutanée d&#39;agents de test Remplissage et l&#39;implantation de mini-pompes osmotiques Habituellement le jour 5, c&#39;est à dire, un jour après la fin du traitement VEGF IP, mini-pompes osmotiques (par exemple, le modèle 2ML2, avec un taux de pompage constant de 5,0 l / h pour les 14-15 jours; Alzet pompes osmotiques, Mountain View, CA , USA) sont remplies dans des conditions stériles avec l&#39;agent d&#39;essai ou le véhicule approprié. Après stockage dans stérile à 0,9% (p / v) de NaCl nuit à 37 ° C, la pompe (s) sont implantés chirurgicalement sc sur le dos (sur le côté de la moelle épinière Column dans la région des omoplates) de rats qui ont été anesthésiés à l&#39;aide de gaz isoflurane (EFP Isoba; Schering-Plough Santé Animale, Merck &amp; Co., Inc, Whitehouse Station, NJ, USA), d&#39;abord dans une chambre étanche transparent et puis par un masque (pour minimiser le stress causé à l&#39;animal suivant, la chambre est rincée avec de l&#39;air avant qu&#39;il soit réutilisé). L&#39;incision cutanée faite pour l&#39;implantation de la pompe est suturée immédiatement après l&#39;implantation à l&#39;aide du fil de soie. Depuis la prise de poids des animaux physiologiquement pendant la période expérimentale et les agents de test sont administrés à un taux constant, la dose réelle sélectionné pour un médicament à l&#39;essai par kg de poids corporel est plus élevé que la dose moyenne au début de la période de perfusion et est plus faible que la dose moyenne à la fin de la période de perfusion. La perfusion continue, tel que décrit ici, peut être considérée comme une forme étendue du traitement métronomique. </li></ol> 4. Fin à l&#39;expérience <ol><li> Un animal à la fois est placé dans une chambre hermétique transparente, ce qui est rincée avec gaz CO 2, qui tue rapidement les animaux. La chambre est rincée avec de l&#39;air avant d&#39;être réutilisés. </li></ol> 5. La récolte d&#39;échantillons tissulaires <ol><li> Comme indiqué dans le DVD, la paroi abdominale est ouverte et le mésentère petits-intestinale est identifiée, y compris la partie la plus distale qui atteint la valvule iléo-caecale (jonction de l&#39;intestin grêle et le gros intestin). Quatre (ou plus) de la plus distale située «fenêtres» sont numérotées et réparties sur une norme objective non traitée Superfrost Plus-lames (DAKO Denmark A / S, Glostrup, Danemark). Il est important d&#39;éviter, si possible, contaminant les échantillons de sang avec le contenu intestinal, ou d&#39;autres fluides corporels, comme ces matériaux peuvent être colorées de manière non spécifique, mais cela n&#39;invalide pas la visualisation ultérieure immunohistochimique des microvaisseaux. </li><li> Chaque spécimen fenêtre mésentérique avec le segment intestinal attachés petite est étalé sur une lame et séchées à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, la souche intestinale est coupée, alors que les spécimens intacts mésentère membraneuses sont stockés à -20 ° C pendant des périodes prolongées. Ceci est illustré dans le DVD. </li></ol> Il convient de mentionner que la vascularisation des tissus et des brevets peuvent être visualisées avant la récolte avec transmise microscopie intravitale lumière. 6. Protocole pour la coloration immunohistochimique des microvaisseaux <ol><li> Jour 0 Les spécimens sont autorisés à dégeler de -20 ° C à la température ambiante, séché dans une armoire à 60 ° C pendant 1 heure, et conservés à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Jour 1 Placer les lames dans la coloration détenteurs diapositive (dans chaque piste seconde) dans une cuvette et la laver deux fois avec du TBS (pH 7,8) pendant 10 minutes à température ambiante. La solution est jeté et remplacé par la solution suivante, et ainsi de suite pour toutes les étapes suivantes. </li><li> Traitement à la trypsine Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec une solution de trypsine (25 ° C pendant 20 minutes). Jeter la solution et incuber à deux reprises avec une solution de saccharose à 2,5% (à température ambiante pendant 10 minutes chaque fois). Jeter la solution et rincer une couple de fois dans l&#39;eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes chacune). </li><li> Bloquant Remplir le bocal coloration qui va du port le support de diapositives coloration avec 0,5% de H 2 O 2 dans le méthanol (température ambiante pendant 30 minutes). Jeter la solution et rincer à l&#39;eau distillée (à température ambiante pendant quelques minutes). Jeter la solution et rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) (température ambiante pendant 8 minutes à chaque fois). </li><li> D&#39;incubation Toutes les incubations sont dans une chambre humidifiée à température ambiante. Environ 150 ul de chacune des solutions ci-dessous sont utilisées par diapositive. Les lames sont placées dans une chambre humidifiée et les solutions sont à la pipette sur les spécimens (les parties non-membraneuse n&#39;avez pas besoin d&#39;être couvert par les solutions). Pour chacune des étapes suivantes, soigneusement secouer toute la solution avant que la solution suivante est ajoutée. <ol><li> Incubation avec Normal (blocage) de sérum (de cheval) (kit ABC) 3 gouttes d&#39;une solution jaune / 10 ml de tampon de dilution pendant 20 minutes. </li><li> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps primaire ARU0181, dont les étiquettes rat cellules endothéliales vasculaires. L&#39;anticorps est dilué 1:600 ​​avec un tampon de dilution (Biosource) (100 ul diluée 40 fois [congelés] ainsi que 900 ul de tampon de dilution) et l&#39;incubation a lieu durant la nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Jour 2 Les lames sont retirés de la chambre humide, l&#39;anticorps primaire est jetée, et les lames sont placées dans un support de diapositives coloration, qui est immergée dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS(PH 7,8) pendant 8 minutes. <ol><li> L&#39;incubation avec l&#39;anticorps biotinylé (ABC kit) Les lames sont placées horizontalement dans une chambre humidifiée et incubées avec 1 goutte de solution de bleu / 10 ml de tampon de dilution pendant 30 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans un support de diapositives coloration immergé dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes. </li><li> L&#39;incubation avec le réactif ABC Les lames sont à nouveau placés horizontalement dans une chambre humidifiée et les solutions suivantes sont à la pipette sur la partie membraneuse des spécimens: 2 gouttes de solution d&#39;orange et 2 gouttes de solution brune SCT / 10 ml (pH 7,4) pendant 30 minutes. Mélanger soigneusement 30 minutes avant utilisation! Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives dans la cuvette et la rincer deux fois avec du TBS (pH 7,4) pendant 8 minutes. </li></ol></li><li> Coloration avec DAB (0,05%) Cette étape doit être réalisée dans une hotte chimique aéré! Placer les lames et ajouter le 3,3-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich) solution à l&#39;aide d&#39;une pipette: solution de DAB 0,1% dans du TBS (pH 7,4) [congelés] est dilué 1:1 avec un mélange de 10 ul H 2 O 2 et 7,5 ml du SCT (pH 7,4). Cette solution est stérilisée par filtration juste avant utilisation (pour éliminer toutes les particules qui peuvent occulter l&#39;image microscopique). Colorer les spécimens pendant 8 minutes. Jeter la solution et le lieu de la glisse dans le support de diapositives coloration immergé dans la cuvette. Rincer sous l&#39;eau courante puis à l&#39;eau distillée pendant quelques minutes. </li><li> Déshydratation Les lames sont conservées dans le support de diapositives coloration. Rincez en défaussant et le remplissage du bocal contenant l&#39;eau distillée coloration / éthanol: eau distillée, alcool à 70%, 95% d&#39;alcool, l&#39;alcool absolu, avec 2 minutes de chaque solution. </li></ol> 7. Imagerie et l&#39;évaluation du réseau microvasculaire dans chaque échantillon de fenêtre mésentérique Après coloration immunohistochimique des cellules endothéliales vasculaires Comme le montre le film, les microvaisseaux sont visualisés au microscope in situ dans le tissu intact. <ol><li> Tout d&#39;abord, nous utilisons un microscope dessin avec plage de grossissement de 14 à 34 (Leica M Sauvage 3Z) au crayon sur du papier blanc de la zone de la fenêtre entière, ainsi que toute la zone vascularisée (VA) par la fenêtre mésentérique. VA, comme un pourcentage de toute la région, est facilement mesurée à l&#39;aide planimétrie informatisée ou non informatisé (ou tout simplement en découpant et la pondération de l&#39;image de toute la fenêtre, et les images de toutes ses parties vascularisé). </li><li> En utilisant une autre microscope à dessin, les profils individuels des microvaisseaux, qui sont facilement identifiables, sont dessinés à l&#39;encre noire sur papier blanc à 80 de grossissement dans les champs choisis au hasard. C&#39;est le point de départ pour l&#39;évaluation ultérieure morphométrique informatisée de la longueur de complications microvasculaires (MVL), qui est essentiellement une mesure de la densité microvasculaire. </li><li> En option, les variables liées à la formation de structures microvasculaires, ainsi que ceux pour l&#39;évaluation du nombre de germes microvasculaires et la longueur des pousses individuelles microvasculaires (n ° SP et Le. SP, respectivement) peuvent être déterminées. -Le contraste optimal entre les structures représentées bateau noir et le fond blanc facilite les analyses détaillées des images dans la plupart des commerciaux morphométriques des programmes informatisés. </li><li> Dans la plupart des cas, les principales variables sont VA et MVL, qui, lorsqu&#39;il est multiplié génèrent ensemble de la longueur totale microvasculaires (TMVL). </li></ol> 8. Analyse statistique Nous utilisons habituellement la norme non-paramétrique de Mann-Whitney U-test pour analyser non apparié (bilatéral) observations. Une moyenne de quatre fenêtres mésentérique par animal est utilisé comme point de données indépendantes pour chaque variable de la fenêtre mésentérique. Le critère de signification statistique est p ≤ 0,05.

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+testing+with+angiogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li>
<li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast-cell-mediated+angiogenesis%3A+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B+Cell.+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li>
<li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+meteronomic+chemotherapy%3A+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

Le test a été introduit en 1986 3 et a successivement été développé et affiné dans notre laboratoire 7,10-12. Comme indiqué dans les articles de synthèse (invité) 1, 2, le test se compare bien à d&#39;autres mammifères dans le dosage angiogenèse in vivo à l&#39;égard en particulier aux fonctions importantes telles que le tissu de test adulte est nativement vascularisé et manque de l&#39;angiogenèse physiologique; un traumatisme minime, le cas échéant, est infligés au tissu; variables réellement quantitatifs sont mesurés, ce qui permet une analyse statistique sur la dose-réponse et moléculaire-activité des études; angiogenèse germination se produit, ce qui est prédominant dans les tissus normaux et de tumeurs, et les données de toxicité sont facilement accumulés chez les rats qui se développent vigoureusement physiologiquement à l&#39;âge adulte. Caractéristiques défavorables peuvent comprendre le fait que le test est relativement fastidieux, surtout lorsque l&#39;évaluation du nombre et la longueur des segments individuels et les choux de microvaisseaux microvaisseaux, qu&#39;il ne permet pas d&#39;observations real-time/serial, et qu&#39;il n&#39;est guère adaptée pour les souris Depuis de nombreuses fenêtres mésentérique chez la souris manque microvaisseaux parent potentiel à partir duquel de nouveaux capillaires peuvent provenir. Observations en temps réel sont, cependant, permis par microscopie intravitale où les fenêtres extériorisé mais intact mésentériques sont écrasés sur une platine de microscope tandis que l&#39;animal est anesthésié, tel que discuté dans 1. Des avancées significatives dans la recherche sur l&#39;angiogenèse ont été réalisés dans les dernières décennies en utilisant des modèles tels que la cornée micropocket, poussin chorioallantoïque membrane, et des dosages sc prise Matrigel, qui sont des outils utiles mais finalement limité. Les futures applications cliniques des thérapies anti-angiogéniques et pro-angiogéniques nécessiter l&#39;établissement et la validation des plus sensibles et biologiquement pertinent, réellement quantitatifs modèles pré-cliniques, telles que celle décrite dans le rapport actuel.

Tampons et réactifs 0,5 M solution stock de Tris-HCl (pH 7,8) Tris (hydroxyméthyl) aminomethan (60,57 g) est dissous dans ~ 900 ml d&#39;aqua dest et ~ 45 ml d&#39;HCl 25% (concentré) est ajouté pour atteindre un pH de 7,8 suivie d&#39;une dilution à 1 litre avec l&#39;eau distillée. Tampon Tris salin (TBS; pH 7,8) Pour 200 ml de la solution stock est ajouté 18 g de NaCl dissous dans dest ~ 1800 ml d&#39;aqua avec ajustement du pH à 7,8 à l&#39;aide de la solution mère, suivie d&#39;une dilution à 2 litres avec l&#39;eau distillée. SCT (pH 7,4) Pour 200 ml de la solution stock est ajouté 18 g de NaCl dissous dans dissous dans dest ~ 1800 ml d&#39;aqua avec ajustement du pH à 7,4 à l&#39;aide de la solution mère, suivie d&#39;une dilution à 2 litres avec l&#39;eau distillée. Solution de trypsine (0,05% de trypsine, 0,1% CaCl 2) Contient 0,1 g de trypsine et 0,2 g de CaCl2 dans 200 ml du SCT (pH 7,8). Solution de saccharose à 2,5% Contient 5 g de saccharose dans 200 ml du SCT (pH 7,8). Solution mère d&#39;azide de sodium à 1% dans du TBS (pH 7,4) Contient 1 g de Na-azide dans 100 ml avec le SCT (pH 7,4). Tampon de dilution: 0,1% de BSA, 0,01% de Na-azide (Utilisée pour diluer les anticorps dans le kit Vectastain ABC). Contient 0,1 g d&#39;albumine sérique bovine (BSA) et 1 ml de 1% de Na-azide, dilué à 100 ml avec le SCT (pH 7,4). ABC kit PK Vectastain 4002, ABC peroxydase IgG de souris Sérum de cheval normal; sérum de blocage; solution jaune: 3 drops/10 ml de tampon de dilution. Anticorps biotinylé; IgG anti-souris; solution bleue: 1 drop/10 tampon de dilution ml. ABC-réactif: la solution d&#39;orange, 2 gouttes, plus solution brune 2 ml drops/10 SCT (pH 7,4). Mélanger ces solutions 20 minutes avant utilisation! Souris (monoclonaux) anti-rat endothélium (Biosource International, Camarillo, Californie, USA) <table border="1"><tbody><tr><td> Catalogue # </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td> Clone # </td><td> MRC OX-43 </td></tr></tbody></table> Cet anticorps est dirigé contre toutes les cellules de l&#39;endothélium vasculaire chez le rat, à l&#39;exception de ceux dans le cerveau. Vectastain peroxydase avidine biotine (ABC) kit Le kit contient des anticorps primaires, anticorps secondaire biotinylé, complexe enzymatique avidine biotinylé (ABC), et le substrat enzymatique. Voir <a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a> ou <a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.se</a> pour les protocoles. Albumine sérique bovine (BSA) (Sigma-Aldrich, catalogue # A-4503). DAB = 3,3 &#39;-diaminobenzidine ISOPAC (Sigma-Aldrich, catalogue # D 9015). La trypsine du pancréas de bovin (Sigma-Aldrich, catalogue # T 4665). Peroxydase Vectastain ABC-kit, la souris IgG (Immunkemi F &amp; D AB, Järfälla, Suède)

assay rat angiogenèse mésentère

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

Le mésentère de rat adulte angiogenèse fenêtre de dosage est biologiquement appropriée et est exceptionnellement bien adapté à l&#39;étude de l&#39;angiogenèse in vivo [voir les articles de synthèse], qui est la forme dominante de l&#39;angiogenèse dans les tumeurs humaines et non-tumorale des tissus, comme nous le verrons dans l&#39;examen des invités les documents 1,2. L&#39;angiogenèse induite dans les parties membraneuses mésentérique par voie intrapéritonéale (IP) d&#39;injection d&#39;un facteur pro-angiogénique peut être modulée par voie sous-cutanée (sc), par voie intraveineuse (IV) ou orale (po) le traitement avec des agents modificateurs de choix. Chaque partie membraneuse du mésentère est translucide et encadrées par du tissu adipeux, ce qui lui donne une apparence de la fenêtre ressemblant. Le test a les caractéristiques avantageuses suivantes: (i) le tissu test est nativement vascularisé, quoique faiblement, et depuis il est extrêmement mince, le réseau de microvaisseaux est pratiquement en deux dimensions, ce qui permet à l&#39;ensemble du réseau pour être évalué au microscope in situ; ( ii) chez des rats adultes le tissu test manque significative l&#39;angiogenèse physiologique, qui caractérise la plupart des adultes normaux des tissus de mammifères, le degré de vascularisation native est, cependant, en corrélation avec l&#39;âge, tel que discuté dans 1; (iii) le niveau négligeable de l&#39;angiogenèse induite par un traumatisme assure une sensibilité élevée, (iv) le dosage reproduit la situation clinique, selon le test de médicaments modulant l&#39;angiogenèse sont administrés par voie systémique et les réponses observées reflètent l&#39;effet net de toutes les voies métaboliques, cellulaires et moléculaires des altérations induites par le traitement, (v) le dosage permet d&#39;évaluations objectives, quantitatives, les variables sans biais de l&#39;extension spatiale microvasculaire, la densité et la formation de structures de réseau, ainsi que des capillaires germination, permettant ainsi des analyses statistiques robustes de la dose-effet et moléculaires relations structure-activité, et (vi ) le dosage révèle avec une grande sensibilité aux effets toxiques ou nocifs des traitements en termes de diminution du taux de physiologiques gain de poids corporel, comme des rats adultes une croissance vigoureuse. Mât-à médiation cellulaire angiogenèse a été démontrée en utilisant ce dosage 3,4. Le modèle démontre un haut niveau de discrimination quant à la posologie à effet et les effets mesurés de la systémique administré chimiquement ou fonctionnellement médicaments étroitement liés et les protéines, y compris: (i) à faible dose, administré metronomically chimiothérapeutiques standard de rendement diversifié, la drogue les effets spécifiques (ie, les activités de l&#39;angiogenèse suppressif, neutre ou angiogenèse stimulation 5), (ii) les risques naturels en fer-insaturés de la lactoferrine humaine, ce qui stimule le VEGF-A-médiée angiogenèse 6, et naturel de fer-insaturés lactoferrine bovine, qui inhibe le VEGF-A- angiogenèse médiation 7, et (iii) les fractions d&#39;héparine de faible poids moléculaire produite par des moyens divers 8,9. Par ailleurs, le dosage est très adapté à des études sur les effets combinés sur l&#39;angiogenèse d&#39;agents qui sont administrés par voie systémique de façon simultanée ou séquentielle. L&#39;idée de faire cette vidéo provient de la fin du Dr Judah Folkman quand il a visité notre laboratoire et témoin de la méthodologie d&#39;être démontrée. Examen des documents (invité) discuter et évaluer le dosage Norrby, K. Dans des modèles in vivo de l&#39;angiogenèse. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006). Norrby, K. Le dépistage des drogues avec des modèles de l&#39;angiogenèse. Expert Opin. Drogues. Découvert. 3, 533-549 (2008).

Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l&#39;angiogenèse physiologique et qui n&#39;a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l&#39;initiation et le développement de l&#39;angiogenèse après administration intrapéritonéale d&#39;agents de test, et (ii) la modification de l&#39;angiogenèse après l&#39;administration systémique de certains agents de test.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

L'essai d'angiogenèse par fenêtre mésentérique chez le rat adulte est biologiquement approprié et s'avère exceptionnellement adapté à l'étude de l'angiogenèse bourgeonnante dans ...

Bienvenue au Département de pathologie de l'Hôpital universitaire de GaN, à Guttenburg, en Suède. Je suis le Dr Klaus Norby, et la méthode que vous êtes sur le point de voir a été mise au point dans mon laboratoire. L'angiogenèse cliniquement pertinente, qui se produit dans des conditions d'hypoxie, en association avec des tumeurs solides ou toute autre maladie angiogénique, se déroule presque exclusivement dans des tissus normalement vascularisés. Chez les petits rongeurs adultes, le mésentère, qui relie l'intestin grêle à la paroi postérieure du corps, contient plusieurs parties minces et membraneuses. Chez le rat, on dénombre environ 40 à 50 de ces fenêtres mésentériques. Elles sont pratiquement transparentes et donc visibles à l'œil nu comme des fenêtres ; chaque fenêtre est entourée de tissu adipeux chez le rat adulte mâle.Les fenêtres mésentériques sont naturellement vascularisées et ne présentent pas d'angiogenèse physiologique mesurable. Elles offrent donc l'opportunité d'étudier l'angiogenèse de novo dans un tissu mammalien adulte naturellement vascularisé. Autrement dit, l'initiation d'une réponse angiogénique complète à partir de zéro, en surmontant les inhibiteurs d'angiogenèse présents de façon endogène dans le tissu test, comme dans tous les tissus normaux chez la souris. Les microvaisseaux natifs pouvant servir de vaisseaux parentaux font défaut dans de nombreuses fenêtres, ce qui rend malheureusement le test imprévisible chez la souris sous sa forme native.Les fenêtres mésentériques chez le rat contiennent normalement un nombre relativement faible de petits vaisseaux sanguins situés en périphérie chez les rats adultes. Ces fenêtres mésentériques ont naturellement une épaisseur comprise entre cinq et dix micromètres. Cela permet d'étaler un tissu intact sur des lames et de l'observer au microscope, ce qui rend possible l'observation de tous les vaisseaux de chaque fenêtre et confère aux vaisseaux une extension essentiellement bidimensionnelle.La méthode offre une opportunité inégalée de réaliser des mesures quantitatives de l'extension spatiale, de la densité, de la formation de motifs et de la taille des microvaisseaux sanguins. Le site sous-cutané est populaire pour les études d'angiogenèse ; toutefois, en raison de l'hétérogénéité des cellules endothéliales et des propriétés spécifiques aux tissus, le contrôle de l'angiogenèse dans les tissus sous-cutanés et les tumeurs en croissance sous-cutanée pourrait ne pas refléter le contrôle de l'angiogenèse dans les organes viscéraux métastatiques tels que les poumons, le foie, les os et le cerveau. Ceci est important car les métastases viscérales sont généralement responsables, en dernier ressort, de la létalité du cancer.Le fait que la fenêtre mésentérique soit viscérale devrait être avantageux à cet égard. L'objectif de notre projet est d'étudier quantitativement certains aspects de l'angiogenèse de novo. Nous injectons donc un facteur pro-angiogénique établi ou une substance test par voie intrapéritonéale.Nous injectons habituellement cinq millilitres à la fois chez des rats adultes non anesthésiés. Un tel volume expose rapidement l'ensemble du mésentère au liquide injecté. Toute solution injectée par voie intrapéritonéale, à condition que son volume ne soit pas minime, devrait affecter toutes les cellules du tissu étudié, d'autant que la couche mésothéliale de cellules recouvrant la fenêtre mésentérique extrêmement fine est hautement perméable aux solutés. Comme aucune intervention chirurgicale n'est nécessaire, l'angiogenèse observée dans la fenêtre mésentérique n'est pas influencée par une angiogenèse induite par cicatrisation, de sorte que le traitement angiogénique est administré sous forme d'injections intrapéritonéales.Pour des raisons pratiques, nous utilisons un protocole de traitement comprenant deux injections quotidiennes pendant une période de cinq jours, du lundi matin au vendredi matin, comme c'est la norme lors de l'étude des effets angiogéniques de protéines définies telles que le VEGF 1 65, le VEGF 1 64 et le FGF basique, par exemple. Habituellement, la solution d'infusion Pharmacia est utilisée comme véhicule. Le nombre de traitements peut sembler élevé, mais il a été démontré qu'il n'est pas toujours possible d'induire une angiogenèse statistiquement significative, même en utilisant des facteurs pro-angiogéniques aussi puissants que le VEGF et le FGF basique lorsqu'ils sont administrés à des niveaux environ physiologiques en une seule dose ou en quelques doses espacées. Il convient de rappeler que de puissants inhibiteurs endogènes de l'angiogenèse sont actifs dans les tissus.L'administration de modalités thérapeutiques modulant l'angiogenèse imite une situation thérapeutique clinique. Un ou plusieurs facteurs modulant l'angiogenèse peuvent être administrés par voie systémique, sous-cutanée, intraveineuse ou orale. Par exemple.Cela imite une situation de traitement clinique dans laquelle on peut étudier non seulement l'effet de la molécule mère, mais aussi celui de ses métabolites. Le système permet un certain contrôle des effets toxiques des agents modulant l'angiogenèse administrés par voie systémique. Comme les rats adultes grandissent physiologiquement et peuvent augmenter de poids d'environ 40 % au cours d'une expérience de deux ou trois semaines, il est possible, en pesant les animaux, d'évaluer dans quelle mesure le traitement a ralenti l'augmentation du poids corporel, ce qui peut être considéré comme un indicateur des effets toxiques.Cela permet d'éviter des doses toxiques lors des tests de substances modulant l'angiogenèse. Un avantage important, car il pourrait être impossible d'interpréter les résultats en termes d'effets anti-angiogéniques spécifiques si un effet toxique est intervenu. Étant donné que les rats adultes grandissent considérablement plus rapidement que les souris adultes, l'effet des agents toxiques sur le gain de poids corporel devrait constituer un indicateur plus sensible des effets toxiques généraux chez le rat que chez la souris.Nous allons maintenant vous montrer comment préparer les échantillons de fenêtres mésentériques. Ces animaux ont été euthanasiés à l'aide de CO2. Les fenêtres mésentériques sont étalées sur des lames courtes ordinaires de trois par un pouce, en commençant par l'extrémité distale du mésentère.L'angiogenèse ne peut pas être observée à l'œil nu dans la fenêtre mésentérique, en partant de la valve iléocæcale et en progressant dans un sens rétrograde. Les quatre fenêtres prélevées à partir de la partie la plus distale du mésentère sont utilisées. L'échantillon sur la lame est séché à température ambiante pendant 20 minutes.Le moignon intestinal est sectionné. Les échantillons sont ensuite conservés dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. De cette manière, les échantillons peuvent être stockés pendant plusieurs mois, voire des années, sans détérioration marquée de la qualité.La coloration est effectuée à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'endothélium de rat. Laissez l'échantillon sécher à l'air, ne pas monter avec une lame couvre-objet. La quantification des incidents de vaisseaux sanguins dans chaque fenêtre mésentérique est réalisée à l'aide d'une microscopie morphométrique assistée par ordinateur, en utilisant un microscope à dessin avec un grossissement optique total compris entre 14 et 34. L'ensemble de la fenêtre mésentérique est visualisé.L'agrandissement est choisi par paliers fixes afin que la plus grande partie possible du champ de vision soit couverte par l'échantillon. Toute la surface de la fenêtre est facilement représentée, car la limite entre la fenêtre et le tissu adipeux environnant est nette. Toutes les parties vascularisées sont ensuite dessinées selon des critères soigneusement définis.Même les plus petits vaisseaux sanguins nouvellement formés, dont le diamètre mesuré à des agrandissements plus élevés se situe aux alentours de 2,5 à 3,0 micromètres, peuvent être clairement discernés. Le fait que le diamètre moyen de l'érythrocyte du rat soit égal ou supérieur à 6,3 micromètres illustre à quel point ces vaisseaux sont petits. La surface de toutes les parties vascularisées dans une fenêtre, exprimée en pourcentage de la surface totale de la fenêtre, est appelée la surface vascularisée relative va.Il s'agit, en pratique, d'une mesure de l'extension spatiale des vaisseaux, qui présentent essentiellement une extension bidimensionnelle ; la VA peut ainsi être facilement mesurée à l'aide de télémétrie assistée par ordinateur, par exemple. L'étape suivante consiste à enregistrer la densité des microvaisseaux et la formation des motifs dans trois régions centrales des zones vascularisées de chaque fenêtre. Ces régions sont choisies systématiquement au hasard à un grossissement optique de 80.Chaque vaisseau est visualisé comme une ligne unique à l’aide d’un microscope de dessin. L’image de chaque champ de vision est transférée vers une image numérisée et un analyseur d’image, puis chaque vaisseau dans l’image numérisée est réduit à une épaisseur d’un pixel. Ensuite, l’appareil mesure le nombre de pixels, qui représente les vaisseaux et est exprimé comme une fraction de l’ensemble des pixels du champ de vision.Ce pourcentage, la longueur microvasculaire ou MVL, représente la longueur des microvaisseaux par unité de surface vascularisée et constitue une mesure composite de la densité des microvaisseaux. En multipliant la moyenne de la surface vascularisée (VA) de quatre champs par animal par la MVL moyenne du groupe de traitement correspondant, on calcule la longueur totale des microvaisseaux par animal, ou TMVL. Nous avons en outre mis au point des techniques d'analyse quantitative détaillée de la densité et de la composition des microvaisseaux par analyse d'image.Ces paramètres incluent la mesure de la distance réelle entre deux microvaisseaux successifs, des points de branchement, de l'IE, de la longueur des microvaisseaux individuels, des segments LEMS, du nombre de microvaisseaux, du nombre de segments par unité de volume tissulaire, du NOMS, ainsi que du nombre de points de branchement des microvaisseaux par unité de volume tissulaire, NOBP. Le degré de tortuosité des microvaisseaux, MVT, est déterminé par la différence entre la distance la plus courte et la distance réelle entre deux points de branchement successifs, par la présence de croisements de microvaisseaux exprimée par l'indice d'intersection INIS, et par la formation de boucles interconnectées. L'indice de formation de boucles, INLF, peut également être mesuré avec précision à l'aide de techniques similaires en périphérie du réseau de microvaisseaux.Nous sommes également en mesure de quantifier les variables correspondantes pour les pousses, notamment la longueur des pousses, LESP, et le nombre de pousses par unité de volume tissulaire, NOSP, en concevant des essais car il peut exister des différences significatives entre les animaux d'un même groupe de traitement et même entre les fenêtres mésentériques d'un même animal. Nous avons constaté que la conception suivante peut s'avérer pratique : le nombre d'animaux par groupe de traitement au cours de l'observation, huit à douze ; le nombre de fenêtres par animal analysées en termes de VA ; le nombre de champs observés pour chaque fenêtre analysée en termes de longueur microvasculaire, MVL ; la longueur des microvaisseaux, segments, LEMS ; le nombre de segments de microvaisseaux, NOMS ; le nombre de microvaisseaux, points de ramification, NOBP ; la tortuosité des microvaisseaux, MVT ; l'indice d'intersection, I ; l'indice de formation de boucles, INF. Trois animaux traités avec un véhicule sont utilisés comme témoins. Le test d'angiogenèse sur fenêtre mésentérique est particulièrement adapté aux études d'effet dose-dépendant et aux analyses cinétiques de l'angiogenèse.Cela peut être réalisé en traitant des groupes d'animaux avec différentes doses d'un facteur pro-angiogénique et en sacrifiant ces animaux à différents moments au cours de la réponse angiogénique. La phase expansive, le pic et la phase subséquente de régression angiogénique peuvent ainsi être discernées en termes quantitatifs. Des études de ce type ont révélé que la réponse angiogénique *de novo* à tout facteur de croissance ou cytokine testé est spécifiquement dépendante de la dose en ce qui concerne la vitesse, la puissance et la durée.En outre, le motif des nouveaux vaisseaux, en ce qui concerne l'extension spatiale et les modifications des microvaisseaux, est souvent nettement dépendant de la dose et du temps, comparé à l'angiogenèse induite par le VEGF ou le FGF basique à des doses approximativement physiologiques. L'angiogenèse induite par les mastocytes, ou MCMA, provoquée par l'activation sélective des mastocytes in situ, présente une puissance nettement plus élevée et une durée remarquablement plus longue. En réalité, l'angiogenèse médiée par les mastocytes a été décrite pour la première fois à l'aide de cet essai, en raison de la possibilité de quantifier des variables objectives d'angiogenèse, du haut degré de pertinence biologique du système et de la possibilité de vérifier l'effet de traitements toxiques.La méthodologie est particulièrement adaptée aux analyses de structure-activité et de réponse dose-dépendante. Le modèle de MWAA chez le rat constitue un système d'étude de l'angiogenèse dans un tissu viscéral vascularisé de façon native chez l'adulte, dans lequel l'angiogenèse physiologique est absente et qui n'est pas affecté par une intervention chirurgicale, excluant ainsi toute influence d'une angiogenèse induite par la cicatrisation. Le test est véritablement quantitatif et évalue avec précision plusieurs variables objectives biologiquement pertinentes décrivant l'extension spatiale, la densité et la formation du réseau des microvaisseaux.Le test est très adapté à l'étude des effets systémiques de l'angiogenèse, des facteurs modulateurs, ainsi qu'aux études de structure-activité et de réponse dose-effet. La méthodologie décrite ici a été mise au point au laboratoire du Dr Kloss Carl Norby, au Département d'anatomie pathologique, Hôpital universitaire Reka, Université jute Borg de Göteborg en Suède. L'ensemble des études de ce projet a bénéficié du soutien du Conseil suédois de la recherche médicale, numéro de projet 5 9 4 2.On tient à remercier chaleureusement l'assistance technique compétente de Mme Gun Effer, impliquée depuis le début du projet, de Mlle Monica Anderson, absente, et de Mme Ann Nemar Lindgren.J'espère que cette brève présentation vous a donné une idée du potentiel de ce dosage. Si vous utilisez ce dosage dans votre laboratoire, je serais heureux de vous aider en cas de problème technique. J'apprécierais par ailleurs grandement toute suggestion que vous pourriez avoir.Merci.

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo montre un modèle pour étudier le développement de l'hyperplasie intimale après le déploiement du stent aide d'un vaisseau humain (IMA) dans un modèle de rat immunodéprimé.

Human artère mammaire interne (IMA) à la transplantation et stenting: un modèle humain pour étudier le développement de la resténose intra-stent

Cet article décrit un modèle simple pour stimuler l'angiogenèse dans le mésentère de rat. Le modèle produit des augmentations spectaculaires de la germination capillaire, la zone vasculaire et la densité vasculaire au cours d'une évolution dans le temps relativement court dans un tissu qui permet la visualisation en face de l'ensemble des réseaux microvasculaires vers le niveau de la cellule unique.

Extériorisation Mésentère Rat: Un modèle pour étudier la dynamique cellulaires impliqués dans l&#39;angiogenèse

Les cellules humaines myélome multiple (MM) nécessitent le micro-environnement favorable des cellules mésenchymateuses et des composants de la matrice extracellulaire pour la survie et la prolifération. Nous avons établi un modèle in vivo d'embryons de poulet avec des cellules de myélome et mésenchymateuses humaines greffées à étudier les effets des médicaments contre le cancer sur la croissance tumorale, l'invasion et l'angiogenèse.

Mise en place d&#39;un modèle de xénogreffe humain de myélome multiple dans le poulet pour étudier la croissance tumorale, l&#39;invasion et l&#39;angiogenèse

La technique Landis modifiée permet de mesurer par appariement la conductivité hydraulique de microvaisseaux individuels dans le mésentère de rats normaux et génétiquement modifiés dans des conditions de contrôle et d’essai à l’aide de techniques de microperfusion. Il s’agit d’une méthode pratique pour évaluer les mécanismes qui régulent la perméabilité des microvaisseaux et les échanges transvasculaires dans des conditions physiologiques.

Microperfusion Technique chargé d&#39;enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Ce manuscrit décrit un test de formation de tubes pour quantifier les effets d’un composé ou d’une condition donnée sur l’angiogenèse en utilisant la formation de tubes de cellules endothéliales dans un environnement contrôlé.

Stratégique des cellules endothéliales Tube Formation Assay: Comparaison matrice extracellulaire et le facteur de croissance réduit la matrice extracellulaire

L’angiogenèse implique des interactions multicellulaires et multisystémiques qui doivent être étudiées dans un environnement physiologiquement pertinent. L’objectif de cette étude est de démontrer la capacité du modèle de culture de mésentère de rat à faire des comparaisons en time-lapse de réseaux microvasculaires intacts au cours de l’angiogenèse.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Méthode pour imagerie time-lapse de Cultured Rat mésentériques microvasculaires Networks

Nous présentons ici une nouvelle application du test de l’anneau aortique où prémarqués cellules mésenchymateuses sont conjointement cultivés avec réseaux endothéliales dérivées aorte de rat. Cette nouvelle méthode permet la visualisation des homing cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et intégration aux réseaux endothéliales, quantification des propriétés du réseau et l’évaluation des MSC immunophenotypes et l’expression génique.

Le dosage de co-culture anneau aortique : Un outil pratique pour évaluer le potentiel angiogénique de cellules stromales mésenchymateuses In Vitro

Ici, un modèle expérimental critique d'ischémie de membre postérieur est présenté suivi d'une batterie de tests fonctionnels, histologiques et moléculaires pour évaluer l'efficacité des thérapies angiogéniques.

Évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de l'ischémie hindlimb

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Évaluation du microenvironnement tumoral de la perméabilité vasculaire médiée par la voie de la metastasie associée à la dissémination des cellules cancéreuses à l'aide de l'imagerie intravitale et de l'analyse des tissus fixes

Ici, nous montrons le potentiel thérapeutique des neutrophiles tumeur-associés anti-angiogenic après leur transfert dans les souris tumeur-portantes. Ce protocole peut être utilisé pour manipuler l'activité neutrophile ex vivo et pour ensuite évaluer leur fonctionnalité in vivo dans le développement de tumeurs. Il s'agit d'un modèle approprié pour l'étude des immunothérapies potentielles à base de neutrophiles.

Transfert de neutrophiles tumoraux manipulés dans des souris porteuses de tumeurs pour étudier leur potentiel angiogénique In Vivo

Le protocole actuel permet de récupérer des structures tubulaires formées dans l’essai classique d’angiogenèse-formation de tubes in vitro où les cellules, telles que les cellules trophoblastiques, s’organisent en structures capillaires sur une couche de matrice de membrane basale extracellulaire. Les structures récupérées sont utilisées pour l’isolement de l’ARN et des protéines pour diverses analyses biochimiques.

Récupération de cellules trophoblastiques à partir d’un test de formation de tube d’angiogenèse pour l’analyse de l’expression des marqueurs de différenciation

Apprenez l'angiogenèse de novo dans les fenêtres mésentériques du rat, un modèle quantitatif pour étudier la formation de vaisseaux sanguins et évaluer les agents modulateurs systémiques.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

Explorer plus de vidéos