Assay Rat angiogenèse Mésentère

Bienvenue au Département de pathologie de l'Hôpital universitaire de GaN, à Guttenburg, en Suède. Je suis le Dr Klaus Norby, et la méthode que vous êtes sur le point de voir a été mise au point dans mon laboratoire. L'angiogenèse cliniquement pertinente, qui se produit dans des conditions d'hypoxie, en association avec des tumeurs solides ou toute autre maladie angiogénique, se déroule presque exclusivement dans des tissus normalement vascularisés. Chez les petits rongeurs adultes, le mésentère, qui relie l'intestin grêle à la paroi postérieure du corps, contient plusieurs parties minces et membraneuses. Chez le rat, on dénombre environ 40 à 50 de ces fenêtres mésentériques. Elles sont pratiquement transparentes et donc visibles à l'œil nu comme des fenêtres ; chaque fenêtre est entourée de tissu adipeux chez le rat adulte mâle.

Les fenêtres mésentériques sont naturellement vascularisées et ne présentent pas d'angiogenèse physiologique mesurable. Elles offrent donc l'opportunité d'étudier l'angiogenèse de novo dans un tissu mammalien adulte naturellement vascularisé. Autrement dit, l'initiation d'une réponse angiogénique complète à partir de zéro, en surmontant les inhibiteurs d'angiogenèse présents de façon endogène dans le tissu test, comme dans tous les tissus normaux chez la souris. Les microvaisseaux natifs pouvant servir de vaisseaux parentaux font défaut dans de nombreuses fenêtres, ce qui rend malheureusement le test imprévisible chez la souris sous sa forme native.

Les fenêtres mésentériques chez le rat contiennent normalement un nombre relativement faible de petits vaisseaux sanguins situés en périphérie chez les rats adultes. Ces fenêtres mésentériques ont naturellement une épaisseur comprise entre cinq et dix micromètres. Cela permet d'étaler un tissu intact sur des lames et de l'observer au microscope, ce qui rend possible l'observation de tous les vaisseaux de chaque fenêtre et confère aux vaisseaux une extension essentiellement bidimensionnelle.

La méthode offre une opportunité inégalée de réaliser des mesures quantitatives de l'extension spatiale, de la densité, de la formation de motifs et de la taille des microvaisseaux sanguins. Le site sous-cutané est populaire pour les études d'angiogenèse ; toutefois, en raison de l'hétérogénéité des cellules endothéliales et des propriétés spécifiques aux tissus, le contrôle de l'angiogenèse dans les tissus sous-cutanés et les tumeurs en croissance sous-cutanée pourrait ne pas refléter le contrôle de l'angiogenèse dans les organes viscéraux métastatiques tels que les poumons, le foie, les os et le cerveau. Ceci est important car les métastases viscérales sont généralement responsables, en dernier ressort, de la létalité du cancer.

Le fait que la fenêtre mésentérique soit viscérale devrait être avantageux à cet égard. L'objectif de notre projet est d'étudier quantitativement certains aspects de l'angiogenèse de novo. Nous injectons donc un facteur pro-angiogénique établi ou une substance test par voie intrapéritonéale.

Nous injectons habituellement cinq millilitres à la fois chez des rats adultes non anesthésiés. Un tel volume expose rapidement l'ensemble du mésentère au liquide injecté. Toute solution injectée par voie intrapéritonéale, à condition que son volume ne soit pas minime, devrait affecter toutes les cellules du tissu étudié, d'autant que la couche mésothéliale de cellules recouvrant la fenêtre mésentérique extrêmement fine est hautement perméable aux solutés. Comme aucune intervention chirurgicale n'est nécessaire, l'angiogenèse observée dans la fenêtre mésentérique n'est pas influencée par une angiogenèse induite par cicatrisation, de sorte que le traitement angiogénique est administré sous forme d'injections intrapéritonéales.

Pour des raisons pratiques, nous utilisons un protocole de traitement comprenant deux injections quotidiennes pendant une période de cinq jours, du lundi matin au vendredi matin, comme c'est la norme lors de l'étude des effets angiogéniques de protéines définies telles que le VEGF 1 65, le VEGF 1 64 et le FGF basique, par exemple. Habituellement, la solution d'infusion Pharmacia est utilisée comme véhicule. Le nombre de traitements peut sembler élevé, mais il a été démontré qu'il n'est pas toujours possible d'induire une angiogenèse statistiquement significative, même en utilisant des facteurs pro-angiogéniques aussi puissants que le VEGF et le FGF basique lorsqu'ils sont administrés à des niveaux environ physiologiques en une seule dose ou en quelques doses espacées. Il convient de rappeler que de puissants inhibiteurs endogènes de l'angiogenèse sont actifs dans les tissus.

L'administration de modalités thérapeutiques modulant l'angiogenèse imite une situation thérapeutique clinique. Un ou plusieurs facteurs modulant l'angiogenèse peuvent être administrés par voie systémique, sous-cutanée, intraveineuse ou orale. Par exemple.

Cela imite une situation de traitement clinique dans laquelle on peut étudier non seulement l'effet de la molécule mère, mais aussi celui de ses métabolites. Le système permet un certain contrôle des effets toxiques des agents modulant l'angiogenèse administrés par voie systémique. Comme les rats adultes grandissent physiologiquement et peuvent augmenter de poids d'environ 40 % au cours d'une expérience de deux ou trois semaines, il est possible, en pesant les animaux, d'évaluer dans quelle mesure le traitement a ralenti l'augmentation du poids corporel, ce qui peut être considéré comme un indicateur des effets toxiques.

Cela permet d'éviter des doses toxiques lors des tests de substances modulant l'angiogenèse. Un avantage important, car il pourrait être impossible d'interpréter les résultats en termes d'effets anti-angiogéniques spécifiques si un effet toxique est intervenu. Étant donné que les rats adultes grandissent considérablement plus rapidement que les souris adultes, l'effet des agents toxiques sur le gain de poids corporel devrait constituer un indicateur plus sensible des effets toxiques généraux chez le rat que chez la souris.

Nous allons maintenant vous montrer comment préparer les échantillons de fenêtres mésentériques. Ces animaux ont été euthanasiés à l'aide de CO2. Les fenêtres mésentériques sont étalées sur des lames courtes ordinaires de trois par un pouce, en commençant par l'extrémité distale du mésentère.

L'angiogenèse ne peut pas être observée à l'œil nu dans la fenêtre mésentérique, en partant de la valve iléocæcale et en progressant dans un sens rétrograde. Les quatre fenêtres prélevées à partir de la partie la plus distale du mésentère sont utilisées. L'échantillon sur la lame est séché à température ambiante pendant 20 minutes.

Le moignon intestinal est sectionné. Les échantillons sont ensuite conservés dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. De cette manière, les échantillons peuvent être stockés pendant plusieurs mois, voire des années, sans détérioration marquée de la qualité.

La coloration est effectuée à l'aide d'un anticorps monoclonal dirigé contre l'endothélium de rat. Laissez l'échantillon sécher à l'air, ne pas monter avec une lame couvre-objet. La quantification des incidents de vaisseaux sanguins dans chaque fenêtre mésentérique est réalisée à l'aide d'une microscopie morphométrique assistée par ordinateur, en utilisant un microscope à dessin avec un grossissement optique total compris entre 14 et 34. L'ensemble de la fenêtre mésentérique est visualisé.

L'agrandissement est choisi par paliers fixes afin que la plus grande partie possible du champ de vision soit couverte par l'échantillon. Toute la surface de la fenêtre est facilement représentée, car la limite entre la fenêtre et le tissu adipeux environnant est nette. Toutes les parties vascularisées sont ensuite dessinées selon des critères soigneusement définis.

Même les plus petits vaisseaux sanguins nouvellement formés, dont le diamètre mesuré à des agrandissements plus élevés se situe aux alentours de 2,5 à 3,0 micromètres, peuvent être clairement discernés. Le fait que le diamètre moyen de l'érythrocyte du rat soit égal ou supérieur à 6,3 micromètres illustre à quel point ces vaisseaux sont petits. La surface de toutes les parties vascularisées dans une fenêtre, exprimée en pourcentage de la surface totale de la fenêtre, est appelée la surface vascularisée relative va.

Il s'agit, en pratique, d'une mesure de l'extension spatiale des vaisseaux, qui présentent essentiellement une extension bidimensionnelle ; la VA peut ainsi être facilement mesurée à l'aide de télémétrie assistée par ordinateur, par exemple. L'étape suivante consiste à enregistrer la densité des microvaisseaux et la formation des motifs dans trois régions centrales des zones vascularisées de chaque fenêtre. Ces régions sont choisies systématiquement au hasard à un grossissement optique de 80.

Chaque vaisseau est visualisé comme une ligne unique à l’aide d’un microscope de dessin. L’image de chaque champ de vision est transférée vers une image numérisée et un analyseur d’image, puis chaque vaisseau dans l’image numérisée est réduit à une épaisseur d’un pixel. Ensuite, l’appareil mesure le nombre de pixels, qui représente les vaisseaux et est exprimé comme une fraction de l’ensemble des pixels du champ de vision.

Ce pourcentage, la longueur microvasculaire ou MVL, représente la longueur des microvaisseaux par unité de surface vascularisée et constitue une mesure composite de la densité des microvaisseaux. En multipliant la moyenne de la surface vascularisée (VA) de quatre champs par animal par la MVL moyenne du groupe de traitement correspondant, on calcule la longueur totale des microvaisseaux par animal, ou TMVL. Nous avons en outre mis au point des techniques d'analyse quantitative détaillée de la densité et de la composition des microvaisseaux par analyse d'image.

Ces paramètres incluent la mesure de la distance réelle entre deux microvaisseaux successifs, des points de branchement, de l'IE, de la longueur des microvaisseaux individuels, des segments LEMS, du nombre de microvaisseaux, du nombre de segments par unité de volume tissulaire, du NOMS, ainsi que du nombre de points de branchement des microvaisseaux par unité de volume tissulaire, NOBP. Le degré de tortuosité des microvaisseaux, MVT, est déterminé par la différence entre la distance la plus courte et la distance réelle entre deux points de branchement successifs, par la présence de croisements de microvaisseaux exprimée par l'indice d'intersection INIS, et par la formation de boucles interconnectées. L'indice de formation de boucles, INLF, peut également être mesuré avec précision à l'aide de techniques similaires en périphérie du réseau de microvaisseaux.

Nous sommes également en mesure de quantifier les variables correspondantes pour les pousses, notamment la longueur des pousses, LESP, et le nombre de pousses par unité de volume tissulaire, NOSP, en concevant des essais car il peut exister des différences significatives entre les animaux d'un même groupe de traitement et même entre les fenêtres mésentériques d'un même animal. Nous avons constaté que la conception suivante peut s'avérer pratique : le nombre d'animaux par groupe de traitement au cours de l'observation, huit à douze ; le nombre de fenêtres par animal analysées en termes de VA ; le nombre de champs observés pour chaque fenêtre analysée en termes de longueur microvasculaire, MVL ; la longueur des microvaisseaux, segments, LEMS ; le nombre de segments de microvaisseaux, NOMS ; le nombre de microvaisseaux, points de ramification, NOBP ; la tortuosité des microvaisseaux, MVT ; l'indice d'intersection, I ; l'indice de formation de boucles, INF. Trois animaux traités avec un véhicule sont utilisés comme témoins. Le test d'angiogenèse sur fenêtre mésentérique est particulièrement adapté aux études d'effet dose-dépendant et aux analyses cinétiques de l'angiogenèse.

Cela peut être réalisé en traitant des groupes d'animaux avec différentes doses d'un facteur pro-angiogénique et en sacrifiant ces animaux à différents moments au cours de la réponse angiogénique. La phase expansive, le pic et la phase subséquente de régression angiogénique peuvent ainsi être discernées en termes quantitatifs. Des études de ce type ont révélé que la réponse angiogénique *de novo* à tout facteur de croissance ou cytokine testé est spécifiquement dépendante de la dose en ce qui concerne la vitesse, la puissance et la durée.

En outre, le motif des nouveaux vaisseaux, en ce qui concerne l'extension spatiale et les modifications des microvaisseaux, est souvent nettement dépendant de la dose et du temps, comparé à l'angiogenèse induite par le VEGF ou le FGF basique à des doses approximativement physiologiques. L'angiogenèse induite par les mastocytes, ou MCMA, provoquée par l'activation sélective des mastocytes in situ, présente une puissance nettement plus élevée et une durée remarquablement plus longue. En réalité, l'angiogenèse médiée par les mastocytes a été décrite pour la première fois à l'aide de cet essai, en raison de la possibilité de quantifier des variables objectives d'angiogenèse, du haut degré de pertinence biologique du système et de la possibilité de vérifier l'effet de traitements toxiques.

La méthodologie est particulièrement adaptée aux analyses de structure-activité et de réponse dose-dépendante. Le modèle de MWAA chez le rat constitue un système d'étude de l'angiogenèse dans un tissu viscéral vascularisé de façon native chez l'adulte, dans lequel l'angiogenèse physiologique est absente et qui n'est pas affecté par une intervention chirurgicale, excluant ainsi toute influence d'une angiogenèse induite par la cicatrisation. Le test est véritablement quantitatif et évalue avec précision plusieurs variables objectives biologiquement pertinentes décrivant l'extension spatiale, la densité et la formation du réseau des microvaisseaux.

Le test est très adapté à l'étude des effets systémiques de l'angiogenèse, des facteurs modulateurs, ainsi qu'aux études de structure-activité et de réponse dose-effet. La méthodologie décrite ici a été mise au point au laboratoire du Dr Kloss Carl Norby, au Département d'anatomie pathologique, Hôpital universitaire Reka, Université jute Borg de Göteborg en Suède. L'ensemble des études de ce projet a bénéficié du soutien du Conseil suédois de la recherche médicale, numéro de projet 5 9 4 2.

On tient à remercier chaleureusement l'assistance technique compétente de Mme Gun Effer, impliquée depuis le début du projet, de Mlle Monica Anderson, absente, et de Mme Ann Nemar Lindgren.

J'espère que cette brève présentation vous a donné une idée du potentiel de ce dosage. Si vous utilisez ce dosage dans votre laboratoire, je serais heureux de vous aider en cas de problème technique. J'apprécierais par ailleurs grandement toute suggestion que vous pourriez avoir.

Merci.