Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Bonjour, je suis Victor Chi et je suis étudiant diplômé au laboratoire Chandy, dans le département de physiologie et de biophysique à l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais démontrer comment colorer des sections incluses dans la paraffine en utilisant le kit A b, C de Vector Laboratories. Cette procédure comprend le déparaffinage et l'hydratation des sections incluses dans la paraffine, la récupération des antigènes induite par la chaleur afin de révéler les antigènes, le blocage de la peroxydase et des liaisons protéiques non spécifiques, l'incubation avec les anticorps primaires CD4 et la tyrosine hydroxylase ainsi qu'avec les anticorps secondaires, puis le développement et le montage de la lame.

Commençons. Étant donné que les lames sont enrobées de paraffine, la première étape consiste à les déparaffiner. Cette opération s'effectue généralement sous une hotte à l'aide de trois bains de xylène, après trois lavages de cinq minutes chacun.

Les lames sont ensuite placées dans de l'éthanol à cent pour cent. Vous remarquerez que la paraffine a disparu des lames, mais faites attention de ne pas manipuler les lames avec des gants, car le xylène dissout le caoutchouc des gants. Ensuite, vous transférez les lames dans l'éthanol à cent pour cent vers le laboratoire, où elles subiront un gradient d'hydratation.

Ici, je vais vous parler du gradient d'hydratation que nous allons appliquer à nos lames. Il commence d'abord par deux bains d'éthanol à cent pour cent. Ensuite, nous transférons nos lames vers deux bains composés d'éthanol à 95 %.

Ensuite, nous transférons nos lames dans un bain d'éthanol à 70 %, puis nous transférons nos lames dans un bain d'éthanol à 50 %. Après cela, nous transférons nos lames dans de l'éthanol à 30 %, et deux minutes plus tard, nous transférons nos lames dans de l'eau doublement distillée. Une fois traitées avec de l'eau doublement distillée, nous laissons nos lames séjourner dans du PBS.

Je vais maintenant vous montrer comment transporter les lames d'un bain à l'autre à l'aide des supports. La première étape consiste, à l'aide de votre support porte-lames, à retirer les lames et à gratter délicatement afin d'éliminer le liquide excédentaire, de sorte que vous n'emportiez pas trop de liquide vers le bain suivant. Ensuite, immergez-les et attendez deux minutes jusqu'au changement suivant du gradient.

Très souvent, lorsque les tissus sont fixés, l'antigène devient masqué de sorte que l'anticorps ne peut pas s'y lier. Ce que je vais faire maintenant est de vous montrer une méthode de récupération des antigènes induite par la chaleur, en utilisant du citrate de sodium. Nous voici maintenant au micro-ondes, où je vais démasquer mon antigène CD8 que j'essaierai de détecter par immunohistochimie.

Ici, je vais verser ma solution et la faire chauffer au micro-ondes pendant 15 minutes. Nous allons donc faire bouillir du citrate de sodium avec nos lames pendant 15 minutes afin de s'assurer que celles-ci ne s'assèchent pas. Nous surveillerons attentivement nos lames pour, en cas de débordement, les recharger avec du citrate de sodium afin de garantir qu'elles restent hydratées.

Ainsi, avant de placer mes lames dans le citrate de sodium, j'ai déjà préchauffé ma solution pendant 45 secondes. Ensuite, j'ai placé mes lames dans le citrate de sodium, et maintenant je chauffe le citrate de sodium pendant 15 minutes, avec les lames à l'intérieur. Habituellement, la solution commence à déborder entre deux et deux minutes et demie après le début de l'ébullition.

À ce stade, j'arrêterai le processus et remplacerai le citrate de sodium perdu par du citrate de sodium frais. Après avoir fait bouillir le citrate de sodium pendant 15 minutes, nous voulons retirer nos lames et la solution et les refroidir. La meilleure façon de procéder consiste à boucher le porte-lames, verser le liquide excédentaire, puis le rincer sous un filet d'eau froide jusqu'à ce que la solution à l'intérieur du bocal ait refroidi à la température ambiante.

Et cela prend généralement environ 10 à 15 minutes. Après avoir retiré nos lames du lavabo, nous devons bloquer l'activité peroxydasique endogène des tissus. Pour ce faire, nous allons préparer une solution de peroxyde d'hydrogène en utilisant du peroxyde d'hydrogène à 30 % afin d'obtenir une solution de peroxyde d'hydrogène à 1 %.

Et à partir de là, je transfère directement les lames dans la solution de peroxyde d'hydrogène. Nous allons maintenant incuber nos lames dans le peroxyde d'hydrogène pendant 20 minutes. Une fois les 20 minutes écoulées, après avoir bloqué la peroxydase endogène, je vais maintenant rincer le peroxyde d'hydrogène des lames à l'aide de lavages au PBS.

Je vais donc transférer mes lames sur le porte-lame et les laver avec trois rinçages de cinq minutes chacun. Ces lames ont été placées dos à dos afin d'éviter tout contact avec les autres lames, ce qui pourrait endommager le tissu. Je retire donc simplement les lames et je les dispose de manière à ce que le tissu ne puisse en aucun cas entrer en contact avec le verre.

Ici, nous transférons nos lames dans du PBS. Après avoir lavé nos lames avec du PBS, je vais maintenant bloquer les liaisons non spécifiques des protéines à l’aide d’une solution contenant 5 % de BSA, 5 % de sérum de chèvre et 0,1 % d’azoture de sodium. Vous devez donc remplacer le sérum de chèvre par celui d’une autre espèce si vous travaillez avec des anticorps de chèvre.

Donc, pour l'instant, je vais simplement placer les lames dans notre support à lames et le remplir avec notre solution. Normalement, je le remplis à moitié, afin que le volume des lames garantisse que les tissus soient bien immergés. Une chose à vérifier lors de la mise en place des lames dans le récipient est d'éviter que ces tissus ne touchent les parois du récipient.

Ainsi, pour la dernière lame, faites-la pivoter vers l'intérieur afin que le tissu n'entre pas en contact avec le récipient. Maintenant que j'ai bloqué mes lames pendant toute la nuit, je vais éliminer l'excès de solution de blocage par trois lavages de cinq minutes chacun dans du PBS. À ce stade, nous souhaitons tracer un cercle autour de notre tissu à l'aide d'un répulsif liquide afin de minimiser la quantité d'anticorps utilisée.

Si vous ne vous souciez pas de la conservation de l'anticorps, vous pouvez toujours incuber les lames dans les mêmes récipients utilisés pour l'étape de blocage. À partir de maintenant, je vais vous montrer comment nous traçons avec le bloqueur liquide autour de notre tissu. Tout d'abord, nous éliminons le sang et l'excès de liquide, en prenant soin de ne pas toucher le tissu.

Essuyez donc les coins pour éliminer le liquide excédentaire. Soyez à nouveau très, très prudent pour ne pas toucher le tissu. Prenez la pointe de blocage du liquide, appuyez doucement pour amorcer l'écoulement, puis entourez le tissu avec votre stylo.

Laissez sécher le bloqueur liquide pendant environ 15 secondes. À ce stade, nous devons ajouter l'anticorps primaire. À l’aide d’une pipette, assurez-vous de recouvrir le tissu avec votre anticorps primaire, puis transférez-le dans votre boîte contrôlée en humidité.

Nous utilisons donc une serviette Kim. Elle a été humidifiée avec de l’eau DI dans cette boîte afin d’empêcher la lame de sécher pendant l’incubation avec l’anticorps primaire. Maintenant que notre anticorps primaire a incubé pendant une heure, nous allons retirer nos lames et rincer l’excès d’anticorps avec du PBS.

Encore une fois, laissez simplement le liquide s’écouler et plongez dans votre lavage au PBS. Répétez ensuite le lavage trois fois pendant cinq minutes. Après ces trois lavages de cinq minutes, nous allons ajouter notre anticorps secondaire au tissu de la même manière que nous avons ajouté l’anticorps primaire.

Donc, en utilisant simplement un volume suffisant pour recouvrir vos tissus, ajoutez votre anticorps secondaire, que nous utilisons sous forme d’anticorps de chèvre anti-lapin, puis replacez votre lame dans la chambre contrôlée en humidité. Nous utilisons donc un anticorps secondaire biotinylé de chèvre anti-lapin, ce qui est essentiel lorsque vous employez la méthode ABC. Nous transférons donc notre lame dans la chambre contrôlée en humidité et laissons incuber pendant une heure.

Donc, pendant l'incubation de l'anticorps secondaire, nous devons préparer le réactif A B C. Nous utilisons le réactif A, B, C des laboratoires Vector, provenant du kit de coloration Vector. Retirez donc le réactif a prime et laissez-en tomber trois gouttes dans 15 millilitres de PBS, en prenant soin de ne pas presser le tube, car les gouttes doivent être dosées précisément et avoir une taille spécifique.

Après environ une heure d'incubation avec l'anticorps secondaire, prenez vos lames et lavez-les à nouveau dans du PBS, comme vous l'avez fait avec votre anticorps primaire. Après trois lavages de cinq minutes chacun, transférez vos lames dans ce récipient où vous ajoutez le réactif A, B, C, que vous avez préparé entre 30 et 45 minutes auparavant. Ajoutez simplement le réactif A, B, C ici, recouvrez complètement les lames et laissez incuber encore 30 à 45 minutes.

Après avoir laissé vos lames dans la solution A, B, C pendant environ 3 à 5 minutes, nous voulons rincer l'excès de solution A, B, C. Retirez simplement vos lames et placez-les dans la solution de PBS. Nous devons répéter cette procédure de lavage trois fois dans du PBS, chaque lavage durant cinq minutes.

Pendant que les lames sont en cours de lavage, je prépare le substrat peroxydase DAB provenant de Vector Laboratories. Je prends le tampon pH 7,5 et j'ajoute deux gouttes. Après le tampon pH 7,5, je prends le réactif substrat DAB et j'ajoute deux gouttes de celui-ci.

Encore une fois, la taille des gouttes est critique, donc ne serrez pas le flacon et laissez simplement les gouttes tomber. Deux gouttes pour le tampon pH 7,5. Vous devez donc ajouter quatre gouttes du réactif substrat DAB, en le laissant également tomber goutte à goutte.

Vous souhaitez également ajouter, à la fin, deux gouttes du réactif substrat peroxyde d'hydrogène. Voici donc à quoi doit ressembler le mélange de réactif substrat DAB. Il est maintenant prêt à être ajouté sur les lames ; retirez vos lames et laissez le PBS s'écouler complètement.

Ainsi, au fil du temps, le réactif DAB devient de plus en plus brun. Nous voulons donc l'ajouter à nos lames à ce stade. Prélevez un volume suffisant pour recouvrir les tissus et ajoutez-le directement sur les échantillons de tissu.

Prélève donc le volume approprié et ajoute-le directement au-dessus de tes échantillons de tissu, puis laisse la solution réagir ; tes échantillons de tissu doivent progressivement devenir plus bruns. Après l'ajout de la solution DAB, on peut observer sur cette coupe cérébrale où le tissu devient brun ici et ici. La coloration brune au DAB met en évidence la région contenant les neurones dopaminergiques du mésencéphale.

Après avoir développé vos lames pendant une durée comprise entre deux et dix minutes, vous devez ajouter vos lames dans l'eau glacée pour arrêter la réaction. Laissez simplement la solution s'écouler et placez directement vos lames dans l'eau glacée. Après avoir immergé vos lames dans l'eau glacée, emportez votre récipient vers l'évier et faites couler de l'eau froide dedans pendant environ cinq minutes afin de vous assurer que toute la solution de DAB a été évacuée de ce récipient.

Ainsi, lorsque vous ajoutez de l'eau dans l'évier, faites attention à ne pas laisser le filet d'eau toucher le tissu ; dirigez-le plutôt vers l'un des coins et laissez simplement l'eau déborder, de sorte que vos tissus ne soient pas perturbés par le courant d'eau. Après avoir retiré vos lames du rinçage, vous devez effectuer une contre-coloration. Mais pourquoi souhaiteriez-vous effectuer une contre-coloration ?

Eh bien, l'une des raisons est que vous souhaitiez observer la structure de votre tissu. Une autre est de visualiser toutes les cellules. Ainsi, pour nos besoins, nous allons effectuer une contre-coloration avec de l'hématoxyline, qui marque les noyaux.

Nous voulons donc simplement prendre nos lames, éliminer le liquide en excès, puis les plonger une fois dans la solution d'hématine. Une fois retirées, ajoutez-les directement dans l'eau. Après avoir placé vos lames dans l'eau du robinet, vous devez les prendre et les rincer à l'eau courante, comme vous l'avez fait précédemment avec le bain d'eau glacée.

Ainsi, pour le lavage de l'hématoxyline, laissez simplement couler l'eau courante jusqu'à ce que l'eau à l'intérieur du bocal devienne claire. Après avoir retiré nos lames contrecolorées de l'eau, nous devons déshydrater à nouveau nos lames. Nous devons donc les faire passer de nouveau par notre gradient d'éthanol, mais en ordre inverse.

Cela correspondrait donc à un lavage avec de l’eau déionisée, un lavage avec de l’éthanol à 30 %, un lavage avec de l’éthanol à 50 %, un lavage avec de l’éthanol à 70 %, deux lavages avec de l’éthanol à 95 % et deux lavages avec de l’éthanol à 100 %, chacun d’une durée de deux minutes. Retirez donc vos lames, essuyez le liquide en excès et plongez-les directement dans l’éthanol à 30 %, puis laissez agir pendant deux minutes. Après le dernier lavage à l’éthanol à 100 %, nous devons replacer les lames dans le xylène.

Reprenez alors vos lames en raclant l'excès de liquide, placez les lames dans le premier xylène pendant cinq minutes. Effectuez ainsi trois lavages consécutifs au xylène de cinq minutes chacun. Nous sommes maintenant prêts à monter nos lames.

Ce que je fais habituellement est de prendre mon pipette Pasteur une minute avant que les lames ne soient prêtes, puis d'aspirer la solution de montage définitif et de la laisser environ une minute avant que les lames ne soient prêtes à être retirées. Après le dernier lavage au xylène, en prenant soin de ne pas immerger vos gants ni les mouiller avec du xylène, retirez les lames à l’aide d’une pince, en faisant attention au côté portant le tissu. Essuyez délicatement l’excès de xylène avec un papier essuie-tout, en prenant garde de ne pas toucher le tissu ; essuyez soigneusement uniquement les coins et les bords, afin de permettre à la majeure partie du xylène de s’évaporer. Vous pouvez probablement travailler sur deux lames avant que l’une d’elles ne s’assèche.

Ainsi, lorsque vous avez terminé de sécher une lame, l'autre lame doit être prête à être manipulée. Vous devez maintenant travailler avec elles avant qu'elles ne sèchent complètement. Vous devez donc prendre votre perimount et tracer une ligne fine à côté de votre tissu, en prenant soin de ne pas toucher le tissu.

Retirez le Perimount en prenant votre lame couvre-objet. Appliquez-la selon un angle de 45 degrés et laissez-la s'incliner vers le bas. Ensuite, faites glisser la lame couvre-objet en veillant à ce que le Perimount recouvre tous les tissus.

Ensuite, posez-le et appuyez doucement au centre pour éliminer toutes les bulles d'air excédentaires. Laissez sécher pendant que vous travaillez sur votre deuxième échantillon ; ce n'est pas le moment d'examiner nos lames. Nous devons donc laisser le milieu de montage permanent sécher toute la nuit avant d'observer nos lames.

Sinon, à la lumière du microscope, le montage définitif présentera des bulles et vous abîmerez alors votre échantillon. Voici un aperçu de nos sections cérébrales après coloration chimique à l’aide d’un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la tyrosine hydroxylase. Là encore, la coloration brune au DAB indique l'emplacement des neurones dopaminergiques du mésencéphale.

La contre-coloration à l'hématoïne colore en bleu tous les noyaux de ce tissu. Je viens donc de vous montrer comment colorer des sections incluses dans la paraffine en utilisant le kit ABC de Vector Laboratories. Vous devrez maintenant ajuster les conditions en fonction des types de tissus que vous allez colorer et des anticorps que vous utiliserez.

Bonne chance dans vos expériences.