Un test cellulaire pour évaluer l’absorption de la protéine tau par la microglie

Commencez avec une plaque multipuits à fond plat contenant des cellules microgliales murines adhérentes – des cellules phagocytaires dans le cerveau.

Introduire un milieu sans sérum contenant des immunocomplexes. Ces complexes sont constitués d’anticorps attachés à des agrégats de protéines Tau phosphorylées, qui se forment lors de certaines maladies neurodégénératives.

Les agrégats Tau sont marqués avec un colorant fluorescent vert sensible au pH.

Au cours de l’incubation, ces immunocomplexes interagissent avec les récepteurs Fc des cellules microgliales, facilitant ainsi leur engloutissement.

Cet endosome contenant un immunocomplexe fusionne avec un lysosome, formant un endolysosome. L’environnement acide de l’endolysosome rend les molécules de colorant fluorescentes.

Laver pour éliminer les immunocomplexes non internalisés.

Traiter avec une solution de trypsine-EDTA pour détacher les cellules.

Transférez la suspension cellulaire sur une plaque à fond en U positionnée sur la glace pour stabiliser l’endolysosome. Granulez les cellules et jetez le surnageant.

Lavez et remettez en suspension les cellules avec le tampon FACS.

À l’aide de FACS, identifiez les cellules vivantes uniques et quantifiez l’intensité de la fluorescence verte pour évaluer l’absorption de Tau par la microglie.

Le premier jour de l’expérience, préparez les cellules BV-2 en les lavant d’abord avec 1x PBS dans le flacon dans lequel elles ont été cultivées. Ensuite, incubez-les avec 0,05 % de trypsine EDTA à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’ils se détachent du ballon. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de culture en pipetant de haut en bas 3 à 5 fois.

Compter les cellules et préparer une suspension cellulaire avec une concentration finale de 100 000 cellules par millilitre dans un milieu de culture contenant 200 microgrammes par millilitre d’héparine. Ajoutez 250 microlitres de cette suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond plat de culture tissulaire de 96 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂ pendant la nuit.

Après avoir décongelé des agrégats de colorant au pH Tau préalablement préparés sur de la glace, diluez-les dans 65 microlitres par condition de milieu sans sérum pour obtenir une solution de 500 nanomolaires. Diluez les anticorps dans 65 microlitres de milieu sans sérum pour obtenir le double de la concentration souhaitée. Mélangez le pH, les agrégats de colorant-Tau et les anticorps dans une plaque à fond en U de 96 puits. Fermez cette plaque de dilution et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, retirez le milieu de la plaque à 96 puits avec les cellules BV-2. Lavez les cellules de chaque puits avec 100 microlitres de température ambiante 1x PBS. Retirez le PBS de la plaque cellulaire BV-2. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 125 microlitres d’immunocomplexes de la plaque de dilution vers chaque puits d’une plaque cellulaire BV-2 de 96 puits, et incubez pendant deux heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂.

Après l’incubation, retirez les immunocomplexes des cellules et lavez les cellules dans chaque puits avec 100 microlitres de température ambiante 1x PBS. Après avoir retiré le 1x PBS, ajoutez 50 microlitres de trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO₂. Après cela, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture et remettez le puits en suspension en pipetant de haut en bas pour détacher les cellules.

Transférez les cellules sur une plaque à fond en U de 96 puits et centrifugez-la à 400 fois g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Placez l’assiette sur de la glace et retirez le fluide. Ajoutez 150 microlitres de PBS glacé et centrifugez à nouveau à 400 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Placez la plaque sur de la glace et lavez-la à nouveau en retirant 1x PBS précédemment ajouté et en ajoutant 150 microlitres de PBS glacé par puits. Centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions.

Placez la plaque sur de la glace et lavez les cellules en retirant le PBS précédemment ajouté et en ajoutant 150 microlitres de tampon FACS par puits. Centrifuger à nouveau à 400 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Placez la plaque sur de la glace, retirez le tampon FACS précédemment ajouté, puis remettez les cellules en suspension dans un tampon FACS de 200 microlitres par puits. Procéder immédiatement à l’analyse par FACS pour acquérir 20 000 événements dans la porte de la cellule active.