Détection d’auto-anticorps d’îlots humains à l’aide d’un test d’électrochimiluminescence

Pour détecter les auto-anticorps des îlots de Langerhans – un biomarqueur du diabète de type 1 – prélevez des échantillons de sérum humain et ajoutez de l’acide acétique pour inhiber les composants interférents.

Incuber puis ajouter un tampon alcalin pour neutraliser l’acide.

Transférez le sérum traité dans une plaque multipuits contenant un mélange d’auto-antigènes d’îlots humains, y compris des antigènes de capture biotinylés et des antigènes conjugués au ruthénium, chacun à une concentration optimale pour le dosage.

L’auto-anticorps des îlots de Langerhans dans l’échantillon positif fait le lien entre l’antigène conjugué au ruthénium et l’antigène de capture biotinylé, formant un complexe antigène-anticorps.

Transvaser le mélange dans une plaque d’électrochimiluminescence enrobée de streptavidine prétraitée avec un agent bloquant et équipée d’électrodes de travail et de contre-électrodes.

Incuber pour permettre des interactions complexes biotinylées avec la streptavidine liée, puis laver.

Ajoutez un tampon contenant de la tripropylamine ou du TPA.

Dans un instrument d’électrochimiluminescence, l’application de tension entre les électrodes initie l’oxydation du ruthénium et du TPA, générant des radicaux TPA.

Les radicaux TPA excitent les complexes de ruthénium, qui émettent des photons tout en revenant à leur état fondamental.

Une chimiluminescence élevée dans l’échantillon positif indique la présence d’auto-anticorps d’îlots.

Mélangez l’auto-antigène de l’îlot humain avec de la biotine ou du sulfo-tag dans un rapport molaire de 1:5 dans un tube, et couvrez le tube d’une feuille d’aluminium car les deux marqueurs sont sensibles à la lumière. Ensuite, incubez le tube pendant une heure à température ambiante. Pendant ce temps, lorsque l’incubation est en cours, amorcez la colonne de spin avec une solution saline tamponnée deux fois au phosphate.

Ensuite, centrifugez la colonne à 1 000 fois g pendant deux minutes à chaque fois. Ensuite, centrifugez le mélange d’auto-marqueurs dans la colonne de spin à 1 000 fois g pendant 2 minutes. Ensuite, aliquote et stockez cet antigène marqué à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué au sulfo-tag de biotine basée sur le test en damier pour le tampon d’antigène afin de préparer 3 millilitres de solution d’antigène par plaque de 96 puits.

Ensuite, dans chaque puits, ajoutez 4 microlitres de sérum et ajustez le volume final à 20 microlitres avec une solution saline tamponnée 1 fois au phosphate. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de solution d’antigène étiquetée dans chaque puits et couvrez la plaque d’une feuille d’étanchéité pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant 2 heures.

Une fois que le shaker s’arrête, laissez la plaque à 4 degrés Celsius au réfrigérateur pendant 18 à 24 heures. Maintenant, mélangez 15 microlitres de sérum avec 18 microlitres d’acide acétique 0,5 molaire pour chaque échantillon, et incubez le même à température ambiante pendant 45 minutes.

Sur la base du test en damier, utilisez la concentration rationnelle de l’antigène marqué au sulfo-tag de biotine pour préparer la solution d’antigène.

Ensuite, aliquote 35 microlitres du tampon antigénique dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR. Juste avant la fin de l’incubation du mélange de sérum, ajoutez 3,8 microlitres de tampon Tris à 1 molaire à pH neuf sur le côté de chaque puits sur la plaque d’antigène.

Une fois l’incubation terminée, transférez rapidement 25 microlitres de sérum traité à l’acide acétique dans chaque puits de la plaque d’antigène et agitez la solution. Ensuite, couvrez la plaque PCR d’un film d’étanchéité pour éviter la lumière et placez-la sur un agitateur à température ambiante pendant 2 heures. Une fois cela fait, transférez la plaque à 4 degrés Celsius au réfrigérateur et incubez pendant 18 à 24 heures.

Sortez la plaque de streptavidine du réfrigérateur à 4 degrés Celsius et laissez-la atteindre la température ambiante. Une fois que la plaque de streptavidine a atteint la température ambiante, ajoutez 150 microlitres de bloqueur A à 3 % dans chaque puits, couvrez la plaque PCR d’une feuille d’étanchéité et incubez au réfrigérateur pendant la nuit.

Le lendemain, retirez la plaque de streptavidine du réfrigérateur et expulsez le tampon des puits. Ensuite, séchez l’assiette en la plaçant à l’envers sur du papier absorbant sec pour que le tampon restant puisse tremper. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon PBST 1 fois pour laver le puits pendant trois lavages consécutifs.

Ensuite, transférez 30 microlitres d’incubation de l’antigène sérique dans chaque puits de la plaque de streptavidine et couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour éviter la lumière. Ensuite, transférez la plaque sur un shaker à température ambiante pendant une heure. Au bout d’une heure, jetez l’incubation de l’antigène sérique de la plaque et ajoutez 150 microlitres de tampon PBST 1 fois pour laver le puits trois fois. Une fois le lavage terminé, ajoutez 150 microlitres de tampon de lecture dans chaque puits pour lire sur un lecteur de plaques.