Détection par puce peptidique d’allo-anticorps HLA anti-donneur chez les receveurs d’organes

Prenons l’exemple d’un réseau de peptides dérivé de la séquence HLA d’un antigène leucocytaire humain ou HLA d’un donneur d’organe, comprenant différents peptides sur une membrane cellulosique.

Chaque peptide porte au moins une discordance d’acide aminé entre la séquence HLA du donneur et du receveur, représentant un épitope potentiel pour le rejet d’organe médié par les anticorps.

Traiter avec un tampon bloquant pour éviter l’interaction non spécifique des anticorps.

Ajouter le sérum du receveur prélevé après la transplantation d’organe, contenant des allo-anticorps.

Ces anticorps, formés contre le HLA du donneur, se lient à leur épitope cible.

Ajoutez un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase qui se lie à l’alloanticorps.

Ajouter un substrat chimiluminescent et du peroxyde d’hydrogène. La peroxydase utilise du peroxyde d’hydrogène pour oxyder le substrat, émettant de la lumière.

Scannez la membrane pour obtenir une image.

Ajoutez un tampon pour éliminer les anticorps liés. Sondez avec du sérum receveur pré-transplantation et obtenez une image.

Par rapport à l’image pré-transplantation, les taches sombres sur l’image post-transplantation indiquent des épitopes HLA spécifiques au donneur qui incitent à la réactivité des allo-anticorps.

Lorsque les puces ont été synthétisées, bloquez les membranes avec 20 millilitres de lait écrémé à 5 % dissous dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,1 % de Tween 20 ou de TBST pendant la période d’incubation appropriée avec balancement. Ensuite, lavez la membrane trois fois avec 20 millilitres de TBST frais pendant 5 minutes par lavage, suivie d’une incubation avec 20 microlitres de sérum receveur brut dans du lait à 2,5 % dans du TBST pendant 2 à 3 heures à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver la membrane trois fois pendant 10 minutes par lavage et incuber les membranes avec un anticorps secondaire IgG conjugué à la peroxydase de raifort de chèvre pendant deux heures.

Retirez l’anticorps secondaire non lié avec trois lavages de 10 minutes dans du TBST et développez les membranes dans 5 millilitres de solution de luminol fraîchement préparée plus 5 millilitres de solution de peroxyde. Au bout d’une minute, visualisez les signaux de chimiluminescence améliorés sur un imageur approprié.

Après avoir enregistré les images développées, incubez les membranes avec 20 millilitres de tampon de décapage commercial à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes, suivi de trois lavages de 10 minutes dans du TBST. Ensuite, bloquez, sondez et visualisez les membranes comme cela vient d’être démontré avec un échantillon de sérum du même patient obtenu à un moment différent.