Détection d’anticorps antiglycanes circulants à l’aide d’une matrice de glycanes imprimée

Commencez avec une glycopuce fonctionnalisée avec des sous-réseaux de glycanes imprimés organisés en blocs de réseaux.

Chaque tache du sous-réseau représente un glycane distinct - un polymère à base de glucides avec des variations dans la composition monosaccharide, la longueur de la chaîne et le motif de ramification.

Traitez la glycopuce avec un tampon de blocage pour bloquer les sites d’interaction non spécifiques.

Transférez la glycopuce et introduisez du sérum de souris dilué dans un tampon supplémenté en surfactant pour minimiser l’agrégation d’anticorps. Incuber sous agitation.

L’agitation favorise une distribution uniforme du sérum, facilitant la liaison sélective des anticorps anti-glycanes à des glycanes spécifiques en fonction de caractéristiques moléculaires distinctes.

Laver avec des concentrations décroissantes d’un tampon contenant un tensioactif pour perturber la liaison non spécifique et rincer.

Superposez la glycopuce avec des anticorps secondaires conjugués à la biotine anti-souris, interagissez avec des anticorps anti-glycanes pré-liés et lavez.

streptavidine marquée au fluorophore, se liant à des anticorps secondaires biotinylés. Lavez et enlevez l’excès de solution.

Scannez la glycopuce et observez les taches de fluorescence distinctes à diverses positions, suggérant des anticorps circulants spécifiques des glycanes dans le sérum.

Préparez le tampon #1 à travers le tampon #4 comme décrit dans le protocole texte. Pour préparer les glycopuces et les échantillons, placez la boîte de stockage avec les lames sur la table jusqu’à ce qu’elles atteignent la température ambiante. Ouvrez la boîte et transférez la glycopuce dans la chambre d’incubation, qui doit déjà être conditionnée avec du papier filtre humide pour maintenir l’humidité constante à l’intérieur de la chambre.

Pendant ce temps, diluez le sérum de souris avec le tampon 1 dans des tubes de 1,5 millilitre. Homogénéiser la solution sérique pendant 5 secondes à l’aide d’un mélangeur vortex. Après l’homogénéisation, incubez le sérum dilué à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un bain-marie pour éviter l’agrégation d’immunoglobulines. Ensuite, centrifugez les tubes pendant 3 minutes à 10 000 fois g et 25 degrés Celsius.

Recueillir le surnageant et jeter toute matière précipitée. Placez soigneusement la glycopuce dans la chambre d’incubation. Incuber avec 1 millilitre de tampon #3 pour éliminer toute matière résiduelle à la surface de la glycopuce. Pendant 15 minutes, à 25 degrés Celsius, tenez la glycopuce en position verticale et lavez-la à nouveau avec quelques gouttes de tampon #3 à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.

Ensuite, retirez soigneusement le tampon de la surface de la glycopuce à l’aide de papier filtre. Remettez le glycochip dans la chambre d’incubation. Étalez l’échantillon de sérum dilué sur la surface de la glycopuce à l’aide d’une micropipette. Assurez-vous que toutes les zones sèches de la surface de la glycopuce sont couvertes par l’échantillon de sérum dilué à l’aide de la pointe de la pipette.

Incuber avec une agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant 1 heure et demie. Après l’incubation, retirez tout échantillon en excès et plongez la glycopuce pendant 5 minutes dans le tampon #3 à 25 degrés Celsius. Passez la glycopuce dans un récipient avec le tampon #4, et enfin, lavez la glycopuce avec de l’eau ultra-pure.

Centrifugez le glycochip pendant 1 minute à 175 fois g et 25 degrés Celsius pour éliminer le liquide. Après avoir remis la glycopuce dans la chambre d’incubation, étalez une solution d’anti-souris de chèvre conjuguée à de la biotine sur la surface de la glycopuce. Incuber avec une agitation orbitale à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez la fraction non liée et répétez les étapes de lavage.

Après la centrifugation, incubez la glycopuce dans l’obscurité à 25 degrés Celsius pendant 45 minutes avec 2 microgrammes par millilitre de la solution de streptavidine correspondante marquée au fluorochrome dans le tampon #2. Après avoir travaillé dans l’obscurité pour éliminer la fraction non liée et répété les étapes de lavage, séchez la glycopuce à l’air.

Pour scanner le réseau, laissez la glycopuce sur la table jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante dans l’obscurité. En même temps, allumez le scanner de diapositives et le laser. En tenant la puce à microréseau, glissez la glycopuce dans la fente jusqu’à ce qu’elle touche le dos. Scannez la glycopuce à l’aide d’Easy Scan et enregistrez-la en tant que fichier .tiff.