Name: Microdissection laser des tissus de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 34 s
Description: Découvrez la microdissection laser de tissus de mammifères avec le microscope Leica A-S-L-M-D. Cette technique permet d'isoler précisément des échantillons tissulaires pour l'analyse en neurosciences et biologie.

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microdissection laser des tissus de mammifères

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Microscopie à capture laser, également connu sous le nom de microdissection laser (LMD), permet à l&#39;utilisateur d&#39;isoler un petit nombre de cellules ou de tissus congelés ou fixés au formol, des coupes de tissus inclus en paraffine. Techniques LMD compter sur une membrane thermo labiles soit placé sur le dessus de, ou en dessous, la section de tissu. Dans une méthode, l&#39;énergie laser focalisé est utilisé pour faire fondre la membrane sur les cellules sous-jacentes, qui peuvent ensuite être sortis de la section des tissus. Dans l&#39;autre, l&#39;énergie du laser vaporise la feuille long d&#39;un chemin &quot;tiré&quot; sur le tissu, ce qui permet aux cellules sélectionnées pour tomber dans un dispositif de collecte. Chaque technique permet la sélection de cellules avec une résolution minimale de quelques microns. ADN, ARN, protéines, lipides et les échantillons peuvent être isolées et analysées à partir des micro-disséqués échantillons. Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;utilisation du Leica AS-LMD instrument de microdissection laser en sept segments, y compris une introduction aux principes du LMD, l&#39;initialisation de l&#39;instrument pour l&#39;utilisation, les considérations générales pour la préparation des échantillons, l&#39;échantillon de montage et mise en place des tubes de capture , en alignant le microscope, en ajustant les commandes de capture, et la capture des spécimens de tissus. Laser-capture microdissection permet à l&#39;enquêteur d&#39;isoler des échantillons de populations de cellules pures aussi petit qu&#39;une cellule peu d&#39;équivalents. Cela permet l&#39;analyse de cellules d&#39;intérêt qui sont exemptes de contaminants voisins, qui pourrait fausser les résultats expérimentaux.

Microdissection laser des tissus de mammifères

La microscopie par capture laser, également connue sous le nom de microdissection laser (LMD), permet à l'utilisateur d'isoler un petit nombre de cellules ou de tissus à partir de coupes congelées ou...

Bonjour, je m'appelle Rob Edwards. Je suis directeur de la plateforme de microscopie par capture au laser de l'Université de Californie à Irvine. Je vais vous décrire l'utilisation du microscope par capture au laser que nous avons ici.Notre instrument est un Leica A-S-L-M-D, que nous avons acheté il y a environ trois ans. Il existe deux types différents de systèmes de capture laser. L'un peut être comparé à un point de soudure, dans lequel un fragment de tissu est placé sur une lame de verre recouverte d'une membrane plastique, qui recouvre le tissu.Une source laser est ensuite utilisée pour fondre la membrane, créant en effet une soudure ponctuelle du tissu sur la membrane, puis cette membrane est retirée, emportant avec elle le tissu capturé. Pour commencer, nous allons allumer plusieurs instruments en séquence afin de démarrer le système de microdissection par capture laser. Nous commencerons par la boîte de commande A-S-L-M-D, que nous allumons ici.Nous allumons ensuite l'ordinateur, ce qui est assez simple. Si vous avez un échantillon nécessitant des optiques de fluorescence pour identifier les cellules à capturer, vous allumerez la lampe au mercure pour l'illumination en fluorescence. Nous n'allons pas utiliser cette fonctionnalité pour cette démonstration.Si vous souhaitez capturer des images de haute qualité des spécimens avant et après, vous pouvez allumer séparément la caméra spot juste ici, une fois la boîte logique et l'ordinateur allumés. Ensuite, on allume l'unité de commande de puissance du laser ici, qui est en réalité activée par une clé située à l'arrière, en bas de l'instrument. Enfin, on allume l'écran de l'ordinateur. Un certain nombre de commandes présentes à l'écran doivent vous être familières.Vous les utiliserez assez régulièrement. Il s'agit d'un programme classique basé sur Microsoft Windows, et il existe donc plusieurs menus que nous allons aborder. Mais d'abord, permettez-moi de parler du bureau ici.Une fenêtre en direct vous montrera ce que le microscope observe réellement. En haut, dans la barre de menu, vous pouvez voir un bouton pour les images en direct, ainsi qu’un bouton de pause que vous pouvez activer, puis utiliser le menu fichier pour capturer des images fixes d'une partie du tissu, par exemple avant et après la capture, afin de documenter le tissu que vous avez isolé. Le microscope peut fonctionner en mode champ clair ou en mode fluorescence, selon que vous capturez un tissu contre-coloré à l'hématine ou un tissu coloré par fluorescence.Les deux boutons suivants incluent le mode spécimen, qui se concentre sur le plan de la platine du microscope, puis un mode collecteur qui déplace la lame de verre et vous permet de visualiser le tissu capturé au sommet du tube de collecte. Ce paramètre sert au contrôle qualité. Ensuite, dans la barre de menu, se trouvent plusieurs outils de dessin que vous utiliserez pour identifier les parties du tissu ou des cellules que vous souhaitez capturer.Ensuite, sur le côté droit de l'écran, se trouvent quelques outils supplémentaires de dessin et de capture, incluant des options de formes à dessiner, des options de découpe, ainsi que les boutons de commande de la découpe. Sur le panneau de contrôle situé ici en bas se trouve également le dispositif de collecte, qui correspond à la partie du microscope située sous la platine et qui maintient les tubes einor dans lesquels votre tissu est capturé. Ces quatre boutons marqués A, B, C et D permettent de contrôler quel tube doit être déplacé directement sous l'échantillon en cours de capture.Il s'agit d'un exemple de tissu typique en coupe congelée qui a été préparé pour la microdissection par capture laser. Ce sont des sections coronales de la tête d'un embryon de souris qui ont été capturées sur une lame en feuille de stylo. Il s'agissait de coupes congelées de huit micromètres qui ont ensuite été séchées et contre-colorées à l'hématine, puis stockées à moins 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.Ainsi, pour monter ces lames sur le microscope, le microscope est fourni avec un support spécial, et rappelez-vous que le tissu sera capturé dans un tube einor situé sous le plan de la platine. Le tissu se trouve donc de ce côté de la lame. Il sera en réalité monté dans le porte-lame, côté tissu vers le bas, comme ceci.La lame se met en place et est maintenue par pression du ressort. Et puis cet orifice intact. Le porte-lame est placé sur la platine du microscope entre ces deux guides.Vous remarquerez qu'il y a un petit cran qui s'insère sous une pince à l'arrière de la platine, maintenant ainsi l'échantillon en place. Lorsque cela est inséré, vous sentez un déclic net. Ensuite, il faut installer les tubes einor, qui permettront effectivement de capturer le tissu.On a le choix d'utiliser des tubes einor de 0,2 ou 0,5 millilitre, qui s'insèrent dans ces petits supports eux-mêmes placés dans ce plateau, lequel se glisse dans un emplacement spécial sous la platine. Ainsi, le tissu sera effectivement capturé à l'intérieur du bouchon du tube einor. Le tube einor, que j'utilise ici à titre illustratif, est un tube de 0,5 millilitre.Ainsi, le capuchon s'insère en le faisant glisser par en dessous, puis les rebords du capuchon sont maintenus en place par ces dents, et ensuite le capuchon se fixe en dessous comme ceci, puis l'ensemble du capuchon est placé dans le support. Maintenant, lorsqu'on isole des acides nucléiques, en particulier pour l'isolement d'ARN, on peut déposer directement dans le capuchon une goutte de solution de triol de plusieurs centaines de microlitres. Il est important de ne pas en renverser dans l'appareil, bien sûr, en raison du phénol et d'autres produits chimiques caustiques présents dans le réactif de triol.Il s'agit du contrôleur du microscope, comme je l'ai indiqué précédemment ; les objectifs ainsi que l'éclairage et la mise au point sont entièrement motorisés sur cet instrument. Le bouton de mise au point se trouve ici en haut. Le contrôle de translation en Y de la platine est ce bouton.Le contrôle de translation X se trouve ici. En bas à gauche se trouve le diaphragme, qui modifie l'illumination ; le microscope mémorise le niveau d'illumination défini pour chaque grossissement. Ainsi, lorsque vous passez d'un objectif à un autre, l'illumination est automatiquement ajustée.Enfin, sur le côté droit du contrôleur, se trouve la commande de la tourelle d'objectifs, qui permet de passer d'un objectif à l'autre. Cet instrument est équipé de cinq objectifs : un objectif 4 x, un 10 x, un 20 x, un 40 x et un objectif 63 x. La première étape pour capturer effectivement un tissu consiste à aligner le microscope de manière à ce que ce que vous voyez à l'écran corresponde exactement à ce que vous allez capturer, afin d'aligner correctement le microscope.Nous passons à l'option de menu laser et nous sélectionnons « calibrer », puis nous acceptons en cliquant sur « continuer ». Maintenant, je suis sur le réglage 4 x et vous pouvez voir qu'il y a ici une zone relativement grande de membrane. Remarquez qu'il n'y a aucun tissu.Nous effectuons l'alignement sur un coin de la lame. Le laser a découpé une croix en quadrillage dans le coin supérieur droit de l'écran, et j'utiliserai la souris pour la centrer sur cet écran, puis cliquer sur la croix en quadrillage. L'ordinateur découpe alors une autre croix en quadrillage. Je m'aligne avec celle-ci et je clique ; ensuite, il découpe une troisième croix en quadrillage et nous nous alignons à cet endroit.L'étalonnage pour l'objectif x4 est désormais terminé pour le microscope, qui est maintenant aligné et prêt à capturer effectivement le tissu. Vous avez peut-être remarqué pendant le processus d'alignement que les hachures croisées qui étaient découpées étaient assez épaisses. Cela est en réalité dû au fait que la puissance de contrôle du laser était réglée sur une valeur très élevée.Nous n'avons probablement pas besoin d'un tel niveau de puissance de découpe. Je vais donc montrer comment régler la puissance du laser en découpant une ligne. Si je dessine à main levée une ligne diagonale à l'écran, puis que je sélectionne un couvercle et que je clique ensuite sur « démarrer la découpe », l'ordinateur découpera le long de la ligne que j'ai définie.Et vous pouvez voir à quel point cette ligne est large. Je dois réduire la puissance du laser. Faites donc cela.J'accède au menu du laser, puis à la commande, et vous remarquerez que l'intensité a été portée à son maximum. Je vais réduire l'intensité du laser à environ 30 et j'accepterai ce réglage. Maintenant, si je trace une nouvelle ligne et que je la coupe, vous verrez que la largeur du tissu brûlé ou de la membrane brûlée est nettement plus faible.Et donc, selon un principe général, on souhaite régler la puissance de commande du laser au niveau le plus bas possible afin de minimiser la quantité de tissu qui est vaporisée. Je vais maintenant démontrer la capture effective d'un échantillon de tissu à l'aide de cet œil miroir. J'utilise actuellement l'objectif Forex et vais tenter de capturer une portion relativement importante de tissu.Nous allons isoler entièrement le cristallin au centre de cet œil. Pour ce faire, je vais découper à main levée. En utilisant le contrôle de dessin situé en haut de l'écran, je vais effectuer la découpe.Je vais tracer une ligne autour de l'échantillon à capturer. Et je fais cela avec un grossissement très faible. Si l'on s'intéresse à des coupes plus précises ou à des zones de tissu plus petites, on peut évidemment effectuer la capture à un grossissement plus élevé.J'ai donc sélectionné la zone à découper et je vais maintenant dans le menu de dessin de formes ; je laisse généralement l'option de lignes fermées activée. L'option de lignes fermées permet, lorsqu'on dessine une forme irrégulière autour d'un élément sans totalement enfermer l'objet à capturer, de tracer automatiquement une ligne droite entre les extrémités ouvertes de la forme. Ainsi, une fois la zone à découper identifiée, nous allons démarrer le processus de découpe et vous verrez que la boîte de contrôle focalise le laser à travers les zones, découpant presque entièrement la forme.On observe souvent un lambeau suspendu lors de la capture de grands morceaux de tissu. On n'obtient pas une séparation complète du tissu. La première chose à essayer consiste donc à couper à nouveau, et le laser suivra alors le contour du tissu.Parfois, vous pouvez aussi simplement dessiner un petit espace là où il pend, couper cela et laisser tomber le fragment. Nous avons donc prélevé cette portion de tissu. Comme mentionné précédemment, nous pouvons passer en mode collecteur et vérifier que ce morceau de tissu se trouve effectivement dans le collecteur ou dans le bouchon du tube einor.Je vais donc passer ici au bouton de contrôle du collecteur, l'activer, et vous verrez que le microscope changera maintenant la vue. Nous observons désormais la surface interne du tube einor, et il y a le fragment de tissu capturé dans la partie inférieure droite de l'écran ; en effectuant la mise au point, on peut voir les cellules individuelles. Nous avons donc vérifié que nous avons effectivement capturé le tissu sélectionné.À présent, le processus de capture ne se produit pas avec une efficacité de cent pour cent, car ces tissus qui sont capturés sont essentiellement comparables à des feuilles tombantes. Un faible pourcentage de fragments de tissu capturés ne tombera pas à l’intérieur du bouchon du tube einor, mais le taux de perte est très faible une fois que la capture du tissu souhaité est terminée. L’étape suivante consiste, bien sûr, à retirer le tube einor contenant le tissu capturé de l’instrument et à le boucher soigneusement.Pour ce faire, nous tirons très doucement tout droit sur le support comme ceci. En gardant à l'esprit que vous souhaitez que le bouchon du tube reste orienté vers le haut, retirez le support du plateau, puis tirez très délicatement le tube. Faites-le glisser ainsi, sortez-le du support, puis déplacez l'einor, pas le couvercle, comme ceci.Maintenant, si l'on a déjà déposé une goutte de triol dans le couvercle, votre tissu commencera déjà le processus de solubilisation et vous pourrez retourner dans votre laboratoire pour terminer l'isolement de l'ARN. Plusieurs fabricants proposent des kits d'isolement d'ARN à échelle microscopique, comme Amon, qui est le fabricant que nous préférons. Et c'est tout ce qu'il y a à faire.Aujourd'hui, je vous ai présenté la plateforme de microdissection au laser ici à l'université de Californie à Irvine. Nous avons démontré comment capturer des tissus en coupes congelées à partir de lames recouvertes de feuille de papier d'aluminium, en vue de l'isolement d'ARN à partir de ces tissus. Merci pour votre attention et bonne chance dans vos propres expériences de microdissection au laser.

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Biologie

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Une nouvelle approche microdissection de la récupération<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Transcriptions spécifiques de formol paraffine fixe embarqué poumon granulomes

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