Un test pour mesurer l’accumulation d’une sonde antibiotique fluorescente dans des cellules bactériennes

Prélever des tubes d’analyse contenant des échantillons bactériens.

Dans l’échantillon de test, ajoutez des molécules inhibitrices pour bloquer la pompe d’efflux d’antibiotiques de la bactérie.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Ajoutez des sondes antibiotiques conjuguées au fluorophore qui pénètrent dans les cellules bactériennes.

Dans l’échantillon de contrôle, la pompe d’efflux extrude les sondes dans le milieu extracellulaire.

Dans l’échantillon traité par inhibiteur, la pompe d’efflux bloquée ne peut pas expulser les sondes, provoquant leur accumulation.

Centrifuger les échantillons. Jetez le surnageant contenant les sondes extracellulaires.

Ajouter un tampon de lyse suivi de lysozyme pour affaiblir la paroi cellulaire bactérienne.

Effectuez des cycles de gel-dégel, de sonication et d’exposition à haute température pour lyser les cellules.

centrifugeuse. Transférez le surnageant dans une membrane filtrante.

Laver et recueillir le filtrat contenant les sondes.

Mesurer l’intensité de fluorescence du filtrat.

Une intensité de fluorescence plus élevée dans les échantillons bactériens traités par inhibiteur suggère une perte de la fonction d’efflux, conduisant à une accumulation d