Un test pour mesurer l’accumulation d’une sonde antibiotique fluorescente dans des cellules bactériennes

Prélever des tubes d’analyse contenant des échantillons bactériens.

Dans l’échantillon de test, ajoutez des molécules inhibitrices pour bloquer la pompe d’efflux d’antibiotiques de la bactérie.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Ajoutez des sondes antibiotiques conjuguées au fluorophore qui pénètrent dans les cellules bactériennes.

Dans l’échantillon de contrôle, la pompe d’efflux extrude les sondes dans le milieu extracellulaire.

Dans l’échantillon traité par inhibiteur, la pompe d’efflux bloquée ne peut pas expulser les sondes, provoquant leur accumulation.

Centrifuger les échantillons. Jetez le surnageant contenant les sondes extracellulaires.

Ajouter un tampon de lyse suivi de lysozyme pour affaiblir la paroi cellulaire bactérienne.

Effectuez des cycles de gel-dégel, de sonication et d’exposition à haute température pour lyser les cellules.

centrifugeuse. Transférez le surnageant dans une membrane filtrante.

Laver et recueillir le filtrat contenant les sondes.

Mesurer l’intensité de fluorescence du filtrat.

Une intensité de fluorescence plus élevée dans les échantillons bactériens traités par inhibiteur suggère une perte de la fonction d’efflux, conduisant à une accumulation de sonde intracellulaire.

Pour l’analyse d’accumulation par sonde, striez les stocks de glycérol des souches bactériennes sur des plaques de gélose LB pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, choisissez une seule colonie dans l’assiette pour une culture de nuit dans un bouillon de lysogénie à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, diluez la culture de nuit environ 50 fois dans un milieu frais.

Lorsque la culture atteint la phase mi-logarithmique, granulez les bactéries par centrifugation et décantez le milieu. Remettez les bactéries en suspension dans 1 millilitre de PBS et centrifugez à nouveau les bactéries. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille lavée dans du PBS à une densité optique de 600 nanomètres de deux.

Ajoutez 10,1 microlitres de 10 millimolaires de CCCP dans du PBS à 1 millilitre de bactéries et incubez les bactéries à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, recueillir les bactéries par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de solution antibiotique fluorescente de 10 à 100 micromolaires dans du PBS.

Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius, laver les cellules par centrifugation quatre fois dans 1 millilitre de PBS froid par lavage. Après le lavage, lysez les bactéries avec 180 microlitres de tampon de lyse et 70 microlitres de lysozyme.

Après 30 minutes à 37 degrés Celsius, congelez-décongelez les bactéries trois fois à moins 78 degrés Celsius pendant 5 minutes et 34 degrés Celsius pendant 15 minutes respectivement. Après la dernière série de congélation-décongélation, faites soniser l’échantillon pendant 20 minutes, suivi d’une incubation de 30 minutes à 65 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, prélever l’échantillon lysé par centrifugation et filtrer le contenu du tube à travers une membrane filtrante de 10 kilodaltons. Lavez le filtre quatre fois avec 100 microlitres d’eau par lavage, et aliquote chaque lavage dans des puits individuels d’une plaque noire à fond plat de 96 puits. Mesurez ensuite l’intensité de fluorescence sur un lecteur de plaques avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées au fluorophore.