Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

Il existe relativement peu de médicaments pour traiter Mycobacterium tuberculosis, de sorte que la résistance à tout médicament est préoccupante. Cet article vidéo décrit une procédure permettant de tester la résistance aux antibiotiques de M tuberculosis à 12 médicaments microbiens différents simultanément. Ainsi, la capacité de détecter rapidement la résistance aux antimicrobiens de M tuberculosis est très importante dans les efforts visant à contrôler l’augmentation des souches résistantes ici pour tester la sensibilité aux antibiotiques.

M tuberculosis est d’abord cultivé sur un milieu solide ou dans un bouillon, une suspension bactérienne. L’inoculum est préparé et ajouté à une plaque de microtitration contenant différentes concentrations de 12 médicaments, y compris les médicaments de première et de deuxième intention après l’incubation. L’étendue de la croissance dans chaque puits est déterminée soit manuellement à l’aide d’une boîte miroir, soit à l’aide d’un lecteur de plaques semi-automatisé.

Les données qui en résultent indiquent la concentration inhibitrice minimale pour chaque médicament testé et montrent à quels antibiotiques la souche de tuberculose testée est résistante. Ces résultats aident à choisir le médicament approprié pour le traitement de la tuberculose. Bonjour, je m’appelle Nancy Ek et je suis directrice du laboratoire de bactériologie Myco à la Mayo Clinic à Rochester, dans le Minnesota.

Aujourd’hui, nous allons décrire une méthode pour effectuer des tests de sensibilité aux antibiotiques pour mycobacterium tuberculosis. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la dilution en macro-bouillon est qu’une CMI est déterminée pour chaque médicament et que 12 antibiotiques sont testés simultanément. La démonstration de la procédure sera assurée par Kurt Jude, un spécialiste de la qualité dans mon laboratoire, qui travaille sur une paillasse de laboratoire.

Préparez-vous à cette procédure en étiquetant une plaque de gélose au sang, trois plaques Middlebrooks sept plaques H 10, un tube de perle de verre saline pour entrejambe et une plaque de microtitration avec le nom du patient et le numéro d’identification de l’échantillon. De plus, étiquetez la gélose au sang et les sept plaques H 10 comme étant pures. Cochez l’étiquette de l’une de ces sept plaques H 10 comme une pour un compte de colonie et l’autre comme un pour 50 colonies.

Placez ensuite le plateau dans le passe-partout. Ensuite, préparez-vous à travailler dans l’installation de biosécurité BSL trois de niveau trois en enfilant une blouse solide sur le devant, des gants couvrant la tête, des couvre-chaussures et un respirateur. Ici, un respirateur pappa est utilisé.

Récupérez ensuite le plateau du passage. Ensuite, dans l’installation BSL trois, désinfectez la surface de l’enceinte de sécurité biologique. Placez ensuite une serviette en papier imbibée de désinfectant à l’intérieur de la hotte, à environ six pouces du panneau de ventilation à côté de la serviette en papier.

Placez des boucles d’inoculation, des pipettes et des pointes, un contenant d’élimination des déchets approprié, un néphi, un RET et un vortex. Une fois la hotte préparée, placez l’organisme sur l’essuie-tout avec une grille avec un bouillon McFarland 0.5 standard A seven H nine avec OADC et un tube de perles salines. Cette configuration se fait à partir de solide, moyen.

Préparez l’inoculum à partir d’un milieu solide, culture à partir de l’échantillon d’un patient. À l’aide d’une boucle stérile, grattez les colonies et transférez-les dans le tube de perles de verre salin pour entrezères. Vortex la suspension pendant 30 à 60 secondes.

Inspectez visuellement l’échantillon, en le comparant à la norme McFarland. Le montant transféré doit être égal ou supérieur à la norme. Sinon, ajoutez plus d’échantillon bactérien et vortex. Encore.

Une fois que la norme McFarland est respectée, laissez l’inoculum se décanter pendant 15 minutes pour permettre à de plus gros amas de bactéries de s’installer. Ensuite, utilisez un nefi TER pour mesurer la densité des bactéries en suspension jusqu’à zéro. Le néphi

Placez d’abord un tube d’entre-gouttes de sérum physiologique vierge dans le néphi ter. Appuyez sur le bouton d’étalonnage pour mettre l’instrument à zéro, puis placez l’étalon McFarland 0,5 dans le Nephi ter et appuyez de nouveau sur le bouton d’étalonnage. Une fois l’instrument étalonné, retirez l’étalon McFarland et insérez l’inoculum.

La lecture de l’inoculum doit être égale à la lecture standard de McFarland. Si la lecture est trop faible, retirez le tube et transférez plus de bactéries de la plaque. Ensuite, vortex et relisez l’échantillon.

Si la lecture est trop élevée, ajoutez du sérum physiologique au vortex du tube. Relisez ensuite l’échantillon. Continuez à ajuster l’inoculum au besoin jusqu’à ce que la concentration de la bactérie corresponde à la norme McFarland.

Ensuite, utilisez une pipette de 200 microlitres et une longue pointe de pipette résistante aux aérosols pour prélever 100 microlitres d’inoculum du tiers supérieur du tube. Pour éviter que des amas ne se déposent au fond, inoculez, le bouillon Middlebrook seven H nine vortex lentement le bouillon inoculé pendant 20 secondes pour plaquer l’inoculum Commencez par retirer la plaque de microtitration de l’emballage du fabricant. Si le déshydratant est bleu ou si l’emballage du film est endommagé, ne l’utilisez pas.

La plaque contient déjà les 12 antimicrobiens à tester dans chaque puits, y compris les médicaments les plus efficaces ou de première intention et les médicaments de deuxième intention. Versez soigneusement l’inoculum de bouillon sept H neuf dans un trth en prenant soin de ne pas générer d’aérosols. Placez ensuite la plaque de micro-titrage avec l’étiquette vers l’extérieur comme indiqué ici, et utilisez une pipette à 12 canaux pour ajouter 100 microlitres d’inoculum à chaque puits.

Ensuite, préparez des plaques pour effectuer le dénombrement des colonies. Tout d’abord, préparez une plaque non diluée en transférant une boucle d’un microlitre d’échantillon du puits de contrôle positif vers la plaque de sept H 10 étiquetée un à un. Utilisez ensuite la boucle pour strier la plaque comme indiqué ici.

Ensuite, pour préparer une dilution de un à 50, transférez une boucle d’un microlitre à partir du puits de contrôle positif et faites-la tourbillonner dans le tube avec 50 microlitres de traînée d’eau. Un microlitre de cette dilution sur la plaque étiquetée de un à 50. Inoculez les plaques de pureté en pipetant 50 microlitres de l’inoculum du TRTH sur une gélose au sang correctement étiquetée et sept plaques H 10 et une traînée pour l’isolement.

Ensuite, empilez un autre trth sur le trth inoculé et placez-les doucement dans le récipient de jet. Placez un joint adhésif sur la plaque de microtitration. Ensuite, à l’aide du support blanc, appuyez fermement sur chaque puits pour assurer un plafond adéquat, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de plis.

Désinfectez la plaque de micro titrage en l’essuyant avec une serviette en papier imbibée d’un désinfectant cide tuberculeux. Placez ensuite la plaque de microtitration dans un sac en plastique et fermez-la avec un thermoscellage. Enfin, désinfectez tous les matériaux, y compris le néphi, le vortex de terre, les plaques et les tubes en les essuyant avec un désinfectant cidal tuberculeux.

Ici, le spray pro est utilisé après un laps de temps suffisant pour assurer la désinfection. 15 minutes pour le spray pro. Les plaques sont collées avec du ruban adhésif placé dans des sacs en plastique et les fournitures scellées sont retirées de l’enceinte de biosécurité et placées dans le passage.

Le sac rouge abandonné est fermé et scellé avec une attache torsadée à ce stade, retirez la blouse, les bottillons et les gants. Après être allé à l’antichambre et s’être lavé les mains, retirez le respirateur, désinfectez-le et rangez-le après vous être lavé les mains à nouveau, mettez une blouse neuve et quittez la suite BSL trois. Ensuite, le récipient de mise au rebut est autoclave.

Ensuite, incubez la plaque de microtitration et les sept plaques H 10 et de vis de sang à l’endroit dans l’incubateur de 35 à 37 degrés Celsius avec cinq à 10 % de CO2 dans le laboratoire BSL deux. Ceci est acceptable parce que la plaque est bien scellée et dans un sac en plastique, le temps de génération de mycobacterium tuberculosis est d’environ 12 à 24 heures, il faudra donc au moins une semaine avant que la croissance puisse être considérée comme la formation d’une pastille cellulaire au fond du contrôle. Eh bien, le 10e jour, effectuez une lecture manuelle du miroir en plaçant la lame scellée une micro lame ST sur la plate-forme de la boîte à miroir.

Utilisez une lampe de bureau pour aider à visualiser la croissance, ajustez au besoin pour obtenir le meilleur contraste. Vérifiez les puits de contrôle de croissance dans ce cas, H 11 et H 12 en regardant le miroir. S’il y a de la croissance, le puits apparaîtra trouble ou semblera avoir des sédiments, comme indiqué ici.

S’il n’y a pas de croissance comme le montre cet exemple, le puits semblera clair. Dans ce cas, remettez la plaque dans l’incubateur et poursuivez l’incubation jusqu’à 21 jours. Pour chaque condition, comparez la croissance à celle du témoin.

Eh bien, pour chaque enregistrement de médicament, la première dilution qui n’a pas de croissance. Il s’agit de la concentration inhibitrice minimale ou CMI pour que le médicament examine les résultats à l’aide d’un lecteur de plaque automatisé tel que la vision, commencez par ouvrir le logiciel de plaque Myco TB a ST et enregistrez en place la plaque scellée avec le code-barres vers l’extérieur. Comme le montre ici, la croissance se manifeste par la turbidité ou par un dépôt de cellules au fond d’un puits sur l’écran de l’ordinateur.

Tout d’abord, examinez les contrôles de croissance. Comme avant. Si cela est négatif pour la croissance, remettez la plaque dans l’incubateur jusqu’à 21 jours.

Si cela est positif, notez les résultats en touchant le premier puits, qui ne montre pas la croissance à l’écran pour chaque médicament. Dans certains cas, des bactéries, des sédiments ou des médicaments précipitent au fond du puits. Ce phénomène, connu sous le nom de traînée, est indiqué par plusieurs puits avec des granulés de la même taille et n’est pas réellement considéré comme une croissance positive.

Ensuite, les sept plaques de gélose H10 et de gélose au sang sont examinées pour déterminer les concentrations bactériennes et évaluer la pureté. La plaque de gélose au sang ne devrait pas montrer de croissance après 48 heures. La croissance sur la plaque de gélose au sang indique une contamination par des bactéries à croissance rapide.

S’il y a croissance, le test de microtitration doit être répété. La plaque de pureté sept H 10 doit avoir la croissance d’un seul organisme. La tuberculose de type EM doit apparaître chamois, colorée, ridée et rugueuse Si elle est contaminée, le test de microtitration doit être répété à partir d’une culture pure.

Pour évaluer la concentration bactérienne, comptez les colonies sur la plaque des sept H 10. Ensuite, à l’aide du tableau du document écrit d’accompagnement, calculez le nombre de colonies. Mycobacterium tuberculosis a été cultivé à partir d’un échantillon de patient et la résistance aux antibiotiques a été évaluée comme décrit dans cette vidéo dans la plaque montrée ici, 12 médicaments différents sont présents à des concentrations croissantes avec les concentrations les plus élevées en haut et les concentrations les plus faibles en bas.

La concentration inhibitrice minimale, ou CMI, du médicament a été indiquée par la concentration la plus faible du médicament qui n’a montré aucune croissance et qui est encerclée dans l’image montrée ici à l’aide de points de rupture normalisés établis par le Clinical and Laboratory Standards Institute. Les données présentées ici suggèrent que cette souche de tuberculose sera résistante à l’Isid et à la rifampicine. In vitro, les micros élevés observés dans plusieurs autres médicaments, notamment l’oïne, la moxifloxacine, la streptomycine et la rifabutine, suggèrent la résistance de la souche EM tuberculosis à ces agents.

Les résultats de la CMI doivent être utilisés par un spécialiste des maladies infectieuses expérimenté dans le traitement de la tuberculose pour élaborer un plan de traitement individualisé Une fois maîtrisée, cette technique prend environ 40 minutes pour mettre en place un isolat. En essayant cette procédure, il est important de se rappeler qu’il s’agit d’un agent pathogène respiratoire et une fois que vous avez généré des aérosols, après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place mycobacterium tuberculosis, test de sensibilité aux antimicrobiens à l’aide de la méthode de dilution du micro bouillon. N’oubliez pas que travailler avec mycobacterium tuberculosis peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que la protection respiratoire doivent toujours être prises lorsque nous sommes nécessaires.