Name: Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Découvrez une méthode de dilution en bouillon en microplaque pour tester la sensibilité de Mycobacterium tuberculosis à 12 antimicrobiens simultanément. Cette technique permet de déterminer les CMI rapidement.

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Nous tenons à remercier les technologues de laboratoire du Laboratoire de la Clinique Mayo Mycobactériologie pour leur aide pendant l&#39;étude.

Chaque laboratoire doit effectuer une évaluation des risques en collaboration avec leur agent de sécurité institutionnel biologique pour déterminer le niveau approprié de biosécurité pour la préparation de l'inoculum et pour le pipetage de l'inoculum dans la plaque. Dans notre laboratoire, nous utilisons de biosécurité de niveau 3 en laboratoire (BSL3) jusqu'à ce que les pratiques des plaques de microtitration sont inoculés, et scellé avec un sceau plastique adhésif. Ces plaques sont ensuite placés dans un sac en plastique, qui est également scellé à la chaleur. La lecture et l'interprétation d'incubation de la microplaque est menée dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 (BSL2). 1. L'étiquetage des matériaux <ol><li> Etiquette une gélose au sang, trois plaques 7H10, le bouillon Middlebrook 7H9, une solution saline entre billes de verre du tube et une plaque de microtitration AST avec les identifiants appropriés (par exemple, le nom du patient, numéro de dossier médical) dans la BSL2. </li><li> Étiquette de la gélose sang et 7H10 plaqués comme «vérification de la pureté". Nombre de colonies périodique de l'inoculum est recommandé de s'assurer que la concentration appropriée des organismes est utilisé dans le test. Nombre de colonies lorsqu'elles sont effectuées aurez besoin d'avoir deux des plaques 7H10 étiquetés avec "compter 1 / 1 colonie» et «compter 1 / 50 colonie». </li></ol> 2. Technologue des préparations d'aller dans le BSL3 <ol><li> Équipement protecteur personnel approprié est nécessaire pour travailler dans le BSL3 et comprend solide devant robe, se couvrir la tête, des gants, des couvre-chaussures, et un respirateur. Chaque établissement devrait établir son propre plan de protection respiratoire, en collaboration avec l'agent de leur institution d'hygiène industrielle. Dans notre laboratoire, nous avons plusieurs respirateurs disponibles, y compris appareils respiratoires d'épuration d'air (PAPR) et équipé filtre HEPA, N95 demi-masque respiratoire. </li></ol> 3. Préparation de l'enceinte de sécurité biologique <ol><li> Dans le BSL3, préparer l'enceinte de sécurité biologique (BSC) par la désinfection de la surface et placer une serviette en papier imbibée de désinfectant environ 6 pouces à partir du panneau de ventilation d'air. </li><li> Placer un conteneur à déchets sur la gauche, et nephlometer petites et Vortexer sur la droite. </li><li> Boucles d'inoculation, pipetors et des conseils sont placés à côté de la serviette en papier. </li><li> Placer une grille avec l'organisme (en bouillon ou sur milieu solide) et le standard McFarland 0,5 sur la serviette en papier. </li></ol> 4. Calibrage de la néphélomètre <ol><li> Placer un tube de verre entre salins billes dans le néphélomètre et régler l'instrument à zéro en utilisant le blanc salines interpolation. </li><li> Placez le standard McFarland 0,5 dans le néphélomètre et calibrer selon les instructions du fabricant. </li></ol> 5. Préparation de l'inoculum <ol><li> Travailler dans des colonies de la BSC gratter, de milieu solide à l'aide d'une anse stérile dans le tube entre correctement étiquetés salines de billes de verre jusqu'à ce qu'un ≥ 0,5 McFarland standard est obtenue. </li><li> Inspecter visuellement l'échantillon, et de comparer à la norme McFarland. </li><li> Échantillons Vortex pendant 30-60 secondes. </li><li> Laisser l'inoculum se contenter de 15 minutes (régler une minuterie). </li></ol> 6. L'inoculation de la plaque de microtitration <ol><li> Ajustez l'inoculum avec le bouillon entre saline à l'aide du néphélomètre calibré pour le McFarland 0,5 par pas de 4.1 et 4.2. Ceci doit être complété dans les 30 minutes (les spécifications du fabricant par personne). </li><li> Utiliser une pipette 200 ul et une pointe d'aérosol LONG pipette résistant à enlever 100 ul d'inoculum de la RD TOP 1 / 3 du tube salines perles interpolation. Inoculer le bouillon Middlebrook 7H9. Lentement vortex le bouillon inoculé 7H9 pendant 20 secondes. </li><li> Retirer la plaque de microtitration AST de l'emballage du fabricant. Ne pas utiliser si le déshydratant est le bleu ou si l'emballage d'aluminium est endommagé. </li><li> Préparer un tube dilution 1:50 pour une utilisation ultérieure dans la préparation de la dilution 1:50 par pipetage 50 pl d'eau stérile dans un tube stérile. </li><li> Versez délicatement l'inoculum bouillon 7H9 dans une auge. Éviter de générer des aérosols. </li><li> Placer la plaque de microtitration AST avec l'étiquette face à vous. </li><li> Utiliser une pipette à 12 canaux d'ajouter 100 ml de l'inoculum à chaque puits. </li><li> Préparer des dilutions pour les décomptes de colonies: <ol type="a"><li> La dilution 1 / 1 est préparé à partir du contrôle positif et (H12) en stries une boucle ul sur la plaque de 7H10 étiqueté "1 / 1". </li><li> La dilution au 1 / 50 est préparé par inoculation d'une boucle de 1 pl du contrôle positif et (H12) et il tourbillonnant dans le tube avec 50 ul de tubes d'eau préparé ci-dessus. Streak 1 ul de cette dilution à la plaque portant la mention «1 / 50". </li></ol></li><li> Inoculer les plaques pureté de l'auge par pipetage 50 ul sur une gélose au sang convenablement étiquetés et la plaque de 7H10 et à balayage pour l'isolement. </li><li> Placerun joint d'adhésif sur la plaque de microtitration AST. Appuyez fermement sur chaque puits afin d'assurer une étanchéité adéquate en utilisant le dos blanc du phoque. Éviter les plis. </li><li> Désinfectez la plaque de microtitration en l'essuyant avec une serviette en papier imbibée d'un désinfectant et tuberculocide microplaque placer dans un sac en plastique et fermer avec un sceau de la chaleur ou du ruban adhésif. <ol type="a"><li> Le sac en plastique sert de récipient secondaire pour s'assurer que tous bouillon est contenue devrait y avoir une fuite ou un déversement de la plaque principale. </li></ol></li></ol> 7. Désinfection des matériaux et des enceintes de sécurité biologique <ol><li> Pour éviter de produire des aérosols, placez un autre bac sur le dessus de la cuvette inoculé avant de le placer délicatement dans le récipient jeter. </li><li> Désinfecter tout le matériel dont nephlometer, Vortexer, plaques, tubes, etc par les essuyer avec un désinfectant tuberculocide et attendre le moment approprié pour assurer la désinfection conformément aux instructions du fabricant avant de retirer du BSC. Par exemple, Prospray, le désinfectant tuberculocide que nous utilisons, il faut 15 minutes pour tuer les mycobactéries. </li><li> Placez le récipient jeter dans un sac de Biohazard et sceller avant l'autoclavage. </li></ol> 8. D'incubation <ol><li> Les plaques doivent être incubés avec les médias vers le bas et les soins devraient être prises pour éviter de renverser ou à des éclaboussures de liquide. </li><li> Incuber la plaque AST plaque de microtitration, 7H10 et une gélose au sang dans un incubateur à 35-37 ° C avec 5-10% de CO 2 avec 5-10% de CO 2 dans le laboratoire de BSL2. <ol class="lalpha"><li> Dans notre laboratoire, ce qui est acceptable parce que la plaque est bien fermé et à l'intérieur d'un sac plastique scellé. </li></ol></li><li> Pas plus de 2 plaques de microtitration AST doivent être empilés dans l'incubateur selon les instructions du fabricant. </li></ol> 9. Les résultats représentatifs Interprétation des résultats: Scellé AST microplaques peuvent être lus manuellement à l'aide d'un miroir comme une aide ou avec un lecteur de plaque automatisés tels que l'Vizion (Diagnostics TREK). Les plaques peuvent être examinés dès que 7 jours après l'inoculation. Examiner les puits de contrôle de croissance dans des postes H11 et H12 pour déterminer si elles sont positives (ie., ont un dépôt de cellules sur le fond du puits). Si les puits de contrôle de croissance ne sont pas positifs, réincuber la plaque et réexaminer périodiquement (par exemple, le jour 10, jour 14) jusqu'à ce que le puits de contrôle de croissance sont positifs. <ol type="a"><li> Miroir lire: <ol type="i"><li> Placez scellés AST plaque de microtitration sur la plateforme; </li><li> Lire puits contrôle de la croissance après 7 jours d'incubation; si cela est négatif, réincuber AST plaque de microtitration; </li><li> Si les contrôles de croissance sont acceptables, alors lisez les puits contenant un médicament. Pour chaque médicament, d'enregistrer la première dilution qui n'a pas de croissance en comparant les puits de drogue avec le contrôle de la croissance. </li><li> La croissance apparaît comme la turbidité ou comme un dépôt de cellules au fond d'un puits. </li></ol></li><li> Instrument Lire: suivez les instructions des fabricants; les instructions ci-dessous sont un exemple de comment la lecture serait faite avec la plate-forme Vizion: <ol type="i"><li> Log in </li><li> Utilisez "MYCOTB" logiciel plaque AST. </li><li> Placer la plaque scellée avec le code-barres face à l'utilisateur. La croissance apparaît comme la turbidité ou comme un dépôt de cellules au fond d'un puits. </li><li> Lire contrôle la croissance, si ce n'est négatif, réincuber AST plaque de microtitration; si elle est positive lire la plaque en touchant l'écran avec le premier puits de chaque médicament qui ne montrent pas de croissance. </li></ol></li></ol> Lire les plaques pureté. La plaque de gélose au sang devrait montrer une croissance nulle après 48 heures et la plaque de la pureté 7H10 devrait avoir une croissance confluente d'un type d'organisme. S'il est contaminé, le test AST microtitration doit être répété à partir d'une culture pure. Calculer le nombre de colonies à partir du contrôle positif et en utilisant le tableau ci-dessous: Principales nombre de colonies <table border="1"><tbody><tr><td> # Colonies compté sur la plaque portant la mention «1 / 1" </td><td> # Colonies compté sur la plaque portant la mention «1 / 50" </td><td> Le nombre de colonies d'inoculum (UFC / ml) </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 x 10 4 </td></tr><tr><td> 50-100 </td><td> 0-2 </td><td> 5 x 10 4 à 1 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤ 10 </td><td> 1 x 10 5 à 5 X 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 x 10 5 </td></tr></tbody></table> Il peut y avoir de fuite d'acide para-aminosalicylique chez certaines souches de Mycobacterium tuberculoseSIS. Cela peut être interprété en regardant tous les puits qui ont granulés et en utilisant le premier puits qui a la même taille que le pellet dilution suivante comme point de fin. La résistance est rare avec ce médicament. <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Les résultats représentatifs en utilisant la plaque MYCOTB. <table border="1"><tbody><tr><td> Abréviation de drogue </td><td> Drogues </td><td> Μ MIC / ml </td></tr><tr><td> OFL </td><td> ofloxacine </td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td> moxifloxacine </td><td> 8 </td></tr><tr><td> FRR </td><td> rifampine </td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> IAM </td><td> amikacine </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td> streptomycine </td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td> rifabutine </td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td> acide p-aminosalicylique </td><td> ≤ 0,5 </td></tr><tr><td> EPF </td><td> éthionamide </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td> cyclosérine </td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td> isoniazide </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td> kanamycine </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td> éthambutol </td><td> 4,0 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).</li>
<li>HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22U.S.+Department+of+Health+and+Human+Services+Centers+for+Disease+and+Preventions%22">U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions</a>. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).</li>
<li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tuberc+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li>
<li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+Evaluation+of+the+MB%2FBACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li>
<li>SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Product+Insert%22">Product Insert</a>. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Susceptiblity+Testing+of+Mycobacteria%2C+Nocardia%2C+and+Other+Aerobic+Actinomycetes%3B+Approved+Standard.+Document+M24-A%22">Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A</a>. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).</li>
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<li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Tubercl+Lung+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li>
<li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+GL+%22Manual+of+Clinical+Microbiology%22">Manual of Clinical Microbiology</a>. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).</li>
<li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li>
</ol>

Un exemple d&#39;une plaque de microtitration AST qui a des contrôles de croissance positif est montré dans la figure 1 et le MIC critère (pg / ml) pour chaque médicament est encerclé. Une étude menée dans notre laboratoire ont indiqué que la méthode AST plaque de microtitration est équivalente à la méthode standard de l&#39;or agar proportion pour les tests de sensibilité de Mycobacterium tuberculosis. Plus rapide présentation des résultats a été obtenue avec microtitration AST plaque de microtitration par rapport à la méthode des proportions agar traditionnelle avec l&#39;interprétation finale pour AST plaque de microtitration et la méthode de la proportion de gélose à 14 et 21 jours, respectivement à AST plaque de microtitration a l&#39;avantage de tester d&#39;abord et médicaments de seconde ligne simultanément ce qui peut aider à prévenir les retards excessifs avec des souches résistantes. La plaque de microtitration AST est aussi beaucoup plus facile à configurer et à lire que l&#39;APM et la fois un miroir manuelle et d&#39;un système semi-automatisé comme la VIZION peut être utilisé pour lire les plaques. La disponibilité d&#39;une valeur de CMI pour les tests résistance aux antituberculeux peuvent fournir de précieuses informations aux médecins de nouvelles par rapport à la valeur critique de concentration traditionnels, en particulier pour ceux des isolats avec «limite» de susceptibilité.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> AST plaques de microtitration et joint adhésif </td><td> Diagnostics TREK, Cleveland, Ohio </td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td> Standard McFarland 0,5 </td><td> Diagnostics TREK, Cleveland, Ohio </td><td> E1041 </td></tr><tr><td> Middlebrook 7H10 plaques </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Gélose au sang </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Stérile boucles 1 uL </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Boucles stériles 10 uL </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Sensititre Saline-Tween billes de verre de bouillon </td><td> Diagnostics TREK, Cleveland, Ohio </td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADC Bouillon </td><td> Diagnostics TREK, Cleveland, Ohio </td><td> T3440 </td></tr><tr><td> Conseils Pipet longue </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Auges stérile </td><td> Diagnostics TREK, Cleveland, Ohio </td><td></td></tr><tr><td> M. tuberculosis </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters: 1000, 200, 20 pi </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Conseils 1000, 20, 20 pl </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Pipetteur multicanaux </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Incubateur CO% 5 au 10 fév </td><td> Fisher </td><td></td></tr><tr><td> Les sacs en plastique, les petits, le CO 2 perméables </td><td> Poly Plastic, Delano, PA </td><td></td></tr><tr><td> Désinfectants tuberculose (tels que ProSpray C-60) </td><td> Certol international, Commerce City, CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td> Boîte Miroir lecteur </td><td> Fisher </td><td></td></tr></tbody></table>

test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

La détection rapide de la résistance antimicrobienne est important dans l&#39;effort pour contrôler l&#39;augmentation de la résistance de Mycobacterium tuberculosis (MTB). Tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) de Vtt a traditionnellement été effectuée par la méthode de la proportion d&#39;agar ou par des essais macrobroth sur un instrument comme le BACTEC (société Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (Diagnostics TREK, Cleveland, OH) ou BacT / ALERTE (bioMérieux, Hazelwood, MO). La méthode des proportions agar-agar, bien que considérées comme &quot;l&#39;or&quot; standard de l&#39;AST, est laborieuse et nécessite le calcul de la résistance en effectuant nombre de colonies sur les médicaments contenant de l&#39;agar par rapport à la drogue sans agar. Si la croissance est ≥ 1% sur le support contenant un médicament par rapport à la drogue sans support, l&#39;organisme est considéré comme résistant à ce médicament. Les méthodes macrobroth besoin d&#39;instrumentation et de test de point de rupture («critique») des concentrations de médicament pour les médicaments de première ligne (isoniazide, éthambutol, la rifampicine, pyrazinamide et l&#39;). La méthode décrite ici est disponible commercialement dans un format 96 plaques de microtitration ainsi [MYCOTB (Diagnostics TREK)] et contient des concentrations croissantes de 12 antimicrobiens utilisés pour le traitement de la tuberculose, y compris à la fois première (isoniazide, rifampicine, éthambutol) et des médicaments de deuxième ligne (amikacine, cyclosérine, éthionamide, kanamycine, la moxifloxacine, ofloxacine, acide para-aminosalicylique, la rifabutine et streptomycine). Pyrazinamide, un médicament de première ligne, n&#39;est pas inclus dans la plaque de microtitration en raison de son besoin de conditions d&#39;essai acide. Avantages du système de microtitration comprennent à la fois facilité d&#39;installation et plus rapidement tourner autour du temps (14 jours) par rapport à la proportion d&#39;agar traditionnelle (21 jours). En outre, la plaque peut être mis en place à partir inoculum préparé en utilisant soit un bouillon ou un milieu solide. Comme le format microplaque est nouveau et depuis Vtt présente des défis uniques de la sécurité dans le laboratoire, ce protocole va décrire de façon sécuritaire l&#39;installation, incuber et de lire la plaque de microtitration.

Antibiogramme de Mycobacterium tuberculosis est difficile mais essentiel pour les soins aux patients. Ce format microplaque offre des tests de 12 antimycobactériens et fournit la concentration minimale inhibitrice (CMI), qui aidera à un traitement approprié.

Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

La détection rapide de la résistance aux antimicrobiens est importante dans l'effort visant à contrôler l'augmentation de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) résistant. ...

Il existe relativement peu de médicaments disponibles pour traiter le mycobactérium tuberculeux, de sorte que la résistance à un médicament quelconque est une préoccupation. Cet article vidéo décrit une procédure permettant de tester simultanément la résistance aux antibiotiques de M. tuberculosis à 12 médicaments antimicrobiens différents. Ainsi, la capacité de détecter rapidement la résistance antimicrobienne de M. tuberculosis revêt une grande importance dans les efforts visant à contrôler l'augmentation des souches résistantes. Ici, pour tester la sensibilité aux antibiotiques.M. tuberculosis est d'abord cultivé sur milieu solide ou en milieu liquide, afin d'obtenir une suspension bactérienne. L'inoculum est préparé et ajouté dans une plaque de microdilution contenant différentes concentrations de 12 médicaments, incluant des agents de première et de deuxième ligne. Après incubation, l'importance de la croissance dans chaque puits est déterminée soit manuellement à l'aide d'une boîte-miroir, soit à l'aide d'un lecteur de plaque semi-automatisé.Les données obtenues indiquent la concentration minimale inhibitrice pour chaque médicament testé et montrent quels antibiotiques la souche de tuberculose testée résiste. Ces résultats aident à choisir le médicament approprié pour le traitement de la tuberculose. Bonjour, je m'appelle Nancy Ek et je suis directrice du laboratoire de bactériologie mycobactérienne à la clinique Mayo à Rochester, Minnesota.Aujourd'hui, nous allons décrire une méthode de test de sensibilité aux antibiotiques pour Mycobacterium tuberculosis. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la dilution en bouillon macroscopique, est qu'une CMI est déterminée pour chaque antibiotique, et que 12 antibiotiques sont testés simultanément. La procédure sera démontrée par Kurt Jude, spécialiste de la qualité dans mon laboratoire, travaillant sur un plan de travail de laboratoire.Préparez cette procédure en étiquetant une boîte de gélose au sang, trois boîtes de gélose Middlebrooks sept H 10, un tube en verre contenant des billes de verre dans une solution saline Tween, et une plaque de microtitration avec le nom du patient et le numéro d'identification de l'échantillon. En outre, étiquetez la gélose au sang et les géloses sept H 10 comme étant destinées au contrôle de pureté. Indiquez sur l'une de ces géloses sept H 10 « dénombrement de colonies 1:1 » et sur l'autre « dénombrement de colonies 1:50 ».Ensuite, placez le plateau dans le sas de passage. Préparez-vous ensuite à travailler dans l'installation de biosécurité de niveau trois (BSL-3) en portant une blouse à fermeture frontale, une coiffe, des gants, des surchaussures et un respirateur. Ici, un respirateur PAPR est utilisé.Ensuite, retirez le plateau du sas de passage. Puis, dans l'installation de niveau de sécurité biologique 3, désinfectez la surface de la hotte de sécurité biologique. Placez ensuite une serviette en papier imbibée de désinfectant à l'intérieur de la hotte, à environ quinze centimètres du panneau de ventilation d'air, à côté de la serviette en papier.Placer des boucles de prélèvement, des pipettes et des embouts, un contenant approprié pour l'élimination des déchets, un néphi, un TER et un vortex. Une fois la hotte préparée, placer l'organisme sur la serviette en papier, ainsi qu'un porte-tubes contenant un étalon McFarland 0,5, un bouillon sept H neuf avec OADC et un tube de billes salines. Ce montage est réalisé à partir d'un milieu solide.Préparer l'inoculum à partir d'une culture sur milieu solide provenant d'un prélèvement du patient. Utiliser une anse stérile pour prélever les colonies et les transférer dans le tube en verre contenant du sérum physiologique avec des billes de verre et du Tween. Vortexer la suspension pendant 30 à 60 secondes.Inspectez visuellement l'échantillon en le comparant à l'étalon de McFarland. La quantité transférée doit être égale ou supérieure à celle de l'étalon. Sinon, ajoutez davantage d'échantillon bactérien et vortexez à nouveau.Une fois l'étalon de McFarland ajusté, laisser l'inoculum se décanter pendant 15 minutes afin de permettre aux plus gros agrégats de bactéries de se déposer. Ensuite, utiliser un nefi TER pour mesurer la densité des bactéries en suspension et la régler à zéro. Le nephi ter.Placez d'abord un tube témoin contenant des billes salines Tween dans le Nephi ter. Appuyez sur le bouton d'étalonnage pour mettre l'appareil à zéro, puis insérez l'étalon McFarland 0,5 dans le Nephi ter et appuyez à nouveau sur le bouton d'étalonnage. Une fois l'appareil étalonné, retirez l'étalon McFarland et insérez l'inoculum.La lecture de l'inoculum doit être égale à celle de l'étalon de McFarland. Si la lecture est trop faible, retirez le tube et transférez davantage de bactéries depuis la boîte. Ensuite, vortexez et relisez l'échantillon.Si la lecture est trop élevée, ajoutez du Tween salin au tube et vortexez. Ensuite, relisez l'échantillon. Continuez à ajuster l'inoculum selon les besoins jusqu'à ce que la concentration des bactéries corresponde à l'étalon de McFarland.Ensuite, utilisez une pipette de 200 microlitres et une longue pointe de pipette résistante aux aérosols pour prélever 100 microlitres d'inoculum dans le tiers supérieur du tube. Pour éviter tout agrégat en cours de décantation vers le fond, inoculez lentement le bouillon Middlebrook 7H9, puis vortexez délicatement le bouillon inoculé pendant 20 secondes afin de préparer l'inoculation. Commencez par retirer la plaque microtitration de son emballage d'origine. Si l'agent desséchant est bleu ou si l'emballage en aluminium est endommagé, ne l'utilisez pas.La plaque contient déjà les 12 antimicrobiens à tester dans chaque puits, y compris les médicaments les plus efficaces ou de première intention ainsi que les médicaments de deuxième intention. Versez soigneusement l'inoculum de bouillon H neuf dans un tube en prenant soin de ne pas générer d'aérosols. Ensuite, placez la plaque de microtitration avec l'étiquette tournée vers l'extérieur comme indiqué ici, et utilisez une pipette à 12 canaux pour ajouter 100 microlitres d'inoculum dans chaque puits.Ensuite, préparez les boîtes pour effectuer le dénombrement des colonies. Commencez par préparer une boîte non diluée en transférant un inoculum d'un microlitre d'échantillon depuis le puits témoin positif vers la boîte H 10 étiquetée 1 à 1. Utilisez ensuite l'inoculateur pour tracer la stries sur la boîte comme indiqué ici.Ensuite, pour préparer une dilution au 1/50, transférez un bouillon de un microlitre depuis le puits témoin positif et mélangez-le dans le tube contenant 50 microlitres d'eau de rinçage. Déposez un microlitre de cette dilution sur la boîte marquée 1/50. Ensemencez les boîtes de contrôle de pureté en pipetant 50 microlitres de l'inoculum provenant du trth sur des boîtes d'agar sang et des boîtes 7H10 correctement étiquetées, puis réalisez un ensemencement en rayures pour isolation.Ensuite, superpose un autre trth sur le trth inoculé et les placer délicatement dans le récipient de rebut. Appliquer un scellé adhésif sur la plaque de microtitration. Puis, à l’aide du support blanc, appuyer fermement sur chaque puits pour assurer un scellement adéquat, en veillant à ce qu’il n’y ait aucune ride.Désinfectez la plaque de microtitration en l'essuyant avec une serviette en papier imbibée d'un désinfectant tuberculocide. Ensuite, placez la plaque de microtitration dans un sac en plastique et fermez-le à l'aide d'une soudure thermique. Enfin, désinfectez tous les matériaux, y compris le néphi, le vortex filtre, les plaques et les tubes, en les essuyant avec un désinfectant tuberculocide.Ici, le Pro Spray est utilisé après un temps suffisant écoulé pour assurer la désinfection. 15 minutes pour le Pro Spray. Les boîtes sont fermées avec du ruban adhésif transparent, placées dans des sacs en plastique, puis les fournitures scellées sont retirées de la cabine de sécurité biologique et placées dans le sas de passage.Le sac rouge de déchets est fermé et scellé avec une pince en ce moment, retirez la blouse, les surchaussures et les gants. Après être passé dans la salle d'antichambre et vous être lavé les mains, retirez le respirateur, désinfectez-le et rangez-le après vous être de nouveau lavé les mains, mettez une blouse propre et quittez la salle BSL-3. Ensuite, le contenant de déchets est stérilisé en autoclave.Incuber ensuite la plaque microtitration et les sept plaques H 10 et de prélèvement sanguin à l'endroit, dans une étuve à 35 à 37 degrés Celsius avec 5 à 10 % de CO2, en laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Cette procédure est acceptable car la plaque est bien scellée et placée dans un sac en plastique. Le temps de génération de Mycobacterium tuberculosis est d’environ 12 à 24 heures ; ainsi, il faudra au moins une semaine avant qu’une croissance soit visible sous forme de culot cellulaire au fond du puits témoin. Au jour 10, effectuer une lecture manuelle au miroir en plaçant la plaque scellée de microtitration AST sur la plateforme de la boîte à miroir.Utilisez une lampe de bureau pour faciliter la visualisation de la croissance et ajustez si nécessaire afin d'obtenir le meilleur contraste. Vérifiez les puits de contrôle de croissance dans ce cas, H 11 et H 12, en regardant dans le miroir. S'il y a croissance, le puits apparaîtra trouble ou semblera présenter un sédiment comme illustré ici.S'il n'y a aucune croissance, comme illustré dans cet exemple, le puits apparaîtra clair. Dans ce cas, remettez la plaque dans l'incubateur et poursuivez l'incubation jusqu'à 21 jours. Pour chaque condition, comparez la croissance au témoin.Alors, pour chaque médicament, la première dilution n'ayant aucune croissance correspond à la concentration minimale inhibitrice, ou CMI, du médicament. Pour analyser les résultats à l'aide d'un lecteur de plaques automatisé tel que le Vision, commencez par ouvrir le logiciel Myco TB a ST Plate et connectez-vous. Placez la plaque scellée avec le code-barres tourné vers l'extérieur. Comme indiqué ici, la croissance apparaît sous forme de turbidité ou de dépôt de cellules au fond d'un puits à l'écran de l'ordinateur.Tout d'abord, examiner les témoins de croissance. Comme précédemment. Si la croissance est négative, remettre la boîte de Pétri dans l'incubateur pendant un maximum de 21 jours.Si ce résultat est positif, enregistrez les résultats en touchant le premier puits qui ne présente pas de croissance à l'écran, pour chaque médicament. Dans certains cas, les bactéries, les sédiments ou les médicaments précipitent au fond du puits. Ce phénomène, appelé traînage, est indiqué par plusieurs puits présentant un culot de même taille et n'est pas considéré comme une croissance réellement positive.Ensuite, les sept boîtes de gélose H 10 et de gélose au sang sont examinées pour déterminer les concentrations bactériennes et évaluer la pureté. La boîte de gélose au sang ne doit montrer aucune croissance après 48 heures. Une croissance sur la gélose au sang indique une contamination par des bactéries à croissance rapide.S'il y a une croissance, le test en microplaque doit être répété. La plaque de pureté H 10 sept doit présenter la croissance d'un seul organisme. La souche EM de tuberculose doit apparaître de couleur beige, ridée, et rugueuse. En cas de contamination, le test en microplaque doit être répété à partir d'une culture pure.Pour évaluer la concentration bactérienne, comptez les colonies sur la plaque H 10 sept. Ensuite, à l'aide du tableau figurant dans le document écrit joint, calculez les nombres de colonies. Mycobacterium tuberculosis a été cultivé à partir d'un prélèvement de patient et la résistance aux antibiotiques a été évaluée comme décrit dans cette vidéo ; sur la plaque présentée ici, 12 antibiotiques différents sont présents à des concentrations croissantes, les concentrations les plus élevées se trouvant en haut et les plus faibles en bas.La concentration minimale inhibitrice, ou CMI du médicament, était indiquée par la plus faible concentration du médicament n'ayant montré aucune croissance et est entourée sur l'image présentée ici, en utilisant des seuils normalisés établis par l'Institut des normes cliniques et de laboratoire. Les données présentées ici suggèrent que cette souche de tuberculose sera résistante à l'Isid et à la rifampicine. In vitro, les hautes CMI observées pour plusieurs autres médicaments, notamment l'oin, la moxifloxacine, la streptomycine et la rifabutine, suggèrent la résistance de la souche de tuberculose multirésistante à ces agents.Les résultats de la CMI doivent être utilisés par un spécialiste des maladies infectieuses expérimenté dans le traitement de la tuberculose afin d'élaborer un plan de traitement individualisé. Une fois maîtrisée, cette technique prend environ 40 minutes pour mettre en place un isolat. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler qu'il s'agit d'un agent pathogène respiratoire et que la génération d'aérosols est possible. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la mise en œuvre du test de sensibilité aux antimicrobiens de Mycobacterium tuberculosis par la méthode de microdilution en bouillon. N'oubliez pas que le travail avec Mycobacterium tuberculosis peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que la protection respiratoire doivent toujours être prises là où elles sont requises.

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Immunologie et infection

L'observation microscopique-sensibilité aux médicaments (MODS) de dosage est un faible coût, faible technicité outil de haute performance de détection de la tuberculose (TB) et la tuberculose multirésistante (tuberculose à bacilles multirésistants). Cette vidéo décrit le liquide MODS la méthode de culture des médias.

La méthode MODS pour le diagnostic de la tuberculose et la tuberculose multirésistante

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

Source : Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In  Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobi. J. Vis. Exp. (2015).Cette vidéo montre la méthode de microdilution en bouillon pour déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) d’un antibiotique lipoglycopeptide contre les bactéries à Gram positif. Il couvre l’isolement des colonies bactériennes, la dilution, l’inoculation de puits de microplaques avec des concentrations variables...

Méthode de microdilution en bouillon pour l’antibiogramme de bactéries à Gram positif

Cette vidéo présente un test permettant d’évaluer l’efficacité des médicaments contre l’infection à Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Un modèle d’infection in vitro contenant des agrégats de Mtb/macrophages est généré qui imite l’infection in vivo. Lors de l’introduction d’antibiotiques appropriés, leur efficacité est testée par dosage de la résuzarine pour surveiller la survie des bactéries avec des concentrations de médicament croissantes.

Un test pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre un modèle d’infection à Mycobacterium tuberculosis

Cette vidéo montre un test en bouillon pour déterminer l’efficacité d’un antibiotique contre Mycobacterium tuberculosis. La culture bactérienne est incubée avec différentes concentrations d’un antibiotique bactéricide. L’efficacité bactéricide est mesurée en évaluant la présence de bactéries viables à l’aide d’un dosage de la résazurine.

Évaluation de l’efficacité d’un composé d’essai contre les mycobactéries dans un bouillon

Le charcoal agar resazurin assay (CARA) est une méthode semi-quantitative à débit moyen pour évaluer l’activité des agents d’essai contre les mycobactéries qui se répliquent, qui ne se répliquent pas ou qui sont les deux.  Le CARA permet d’évaluer rapidement l’activité dépendante du temps et de la concentration et de déterminer les paramètres à suivre à l’aide d’essais d’unités formant colonies (UFC).

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Nous avons mis au point un système modulaire de criblage à haut débit pour la découverte de nouveaux composés contre la tuberculose Mycobacterium, ciblant les bactéries à croissance intracellulaire et en bouillon ainsi que cytotoxicité contre la cellule hôte mammifère.

Système d&#39;efficacité et de dépistage des inhibiteurs Cytotoxicité ciblage intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

De nouveaux modèles et tests qui amélioreraient le processus de développement précoce des médicaments antituberculeux de nouvelle génération sont hautement souhaitables. Nous décrivons ici un test rapide, peu coûteux et compatible BSL-2 pour évaluer l’efficacité d’un médicament contre Mycobacterium tuberculosis qui peut être facilement adapté au criblage à haut débit.

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Une quantification rapide et efficace de la croissance intracellulaire de M. tuberculosis est cruciale pour poursuivre des thérapies améliorées contre la tuberculose (TB). Ce protocole décrit un test de détection colorimétrique à base de bouillon utilisant un système automatisé de culture liquide pour quantifier la croissance de Mtb dans les macrophages traités avec des thérapies candidates dirigées par l’hôte.

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Ici, nous présentons un protocole permettant d’identifier les candidats potentiels à la tuberculose par dépistage phénotypique, englobant la synthèse chimique d’un composé de 4-aminoquinoline, la détermination de sa concentration inhibitrice minimale contre Mycobacterium tuberculosis, et l’évaluation de sa cytotoxicité dans les lignées cellulaires de mammifères.

Identification des candidats potentiels contre la tuberculose : guide étape par étape pour la synthèse, la détermination de la CMI et l’évaluation de la cytotoxicité chez les cellules de mammifères

Découvrez une méthode de dilution en bouillon en microplaque pour tester la sensibilité de Mycobacterium tuberculosis à 12 antimicrobiens simultanément. Cette technique permet de déterminer les CMI rapidement.

Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque (Vidéo) | JoVE Journal

Test de sensibilité aux antimicrobiens du complexe Mycobacterium tuberculosis des drogues de première et deuxième par dilution en bouillon dans un format microplaque

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