Sélection des Plasmodium falciparum Parasites des Cytoadhesion aux cellules du cerveau endothéliales humaines

L'objectif général de cette procédure est de sélectionner les plasmodium, les fpar et les parasites capables de se lier aux cellules endothéliales cérébrales humaines. Cette sélection s'effectue en incubant d'abord une culture de plasmodium, de fpar et de parasites, contenant un mélange de globules rouges infectés et non infectés, avec une couche de cellules endothéliales cérébrales humaines. L'étape suivante consiste à éliminer par lavages répétés les globules rouges non infectés et non liés à l'aide du milieu de culture. Des globules rouges frais sont ensuite ajoutés pour permettre une croissance supplémentaire de la population parasitaire.

La dernière étape, quelques semaines plus tard, consiste à répéter la sélection globale dès qu'un nombre suffisant de parasites est atteint. En fin de compte, la microscopie est utilisée pour montrer une forte quantité de parasites liés aux HBE cinq i. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du paludisme cérébral, telles que l'identification de ligands parasitaires ou de molécules réceptrices de l'hôte impliquées dans le processus de cyto-adhérence.

Préparer des érythrocytes humains à partir de sang total de groupe O positif en séparant les érythrocytes des leucocytes par filtration à travers un filtre d'épuisement des leucocytes. Centrifuger les cellules à 1000 G pendant 10 minutes et resuspendre le culot dans tout le milieu PMI incomplet.

Répétez cette étape de lavage une fois de plus, puis resuspendez le culot. Dans notre milieu PMI incomplet à 50 % d'hématocrite, les globules rouges sont conservés à quatre degrés Celsius pendant une semaine. Mettez en culture les globules rouges infectés par Odium Valspar.

Avec le milieu RPMI complet à 2 % d'hématocrite, incuber à 37 degrés Celsius sous 3 % de dioxyde de carbone, 1 % d'oxygène et 96 % d'azote chaque jour. Réaliser une frottis pour évaluer le stade de développement des parasites. Changer le milieu chaque jour en centrifugeant la culture à 500 ×g pendant cinq minutes.

Aspirez le surnageant et ajoutez du milieu RPMI complet frais environ une fois par semaine. Synchronisez les parasites par traitement avec une solution aqueuse de sorbitol à 5 %. Le test de sélection peut être réalisé le lendemain d'une culture au stade anneau, lorsqu'au moins 5 à 10 % de parasitémie est observée.

En outre, il faut une quantité suffisante de culture parasitaire pour former un volume de cellules P de 30 microlitres par boîte de culture de 60 millimètres contenant des cellules HBE5i. Préparer une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres pour recevoir la lignée cellulaire d'endothélium microvasculaire cérébral humain ou HBE5i en ajoutant deux microgrammes par centimètre carré de fibronectine et du sérum physiologique stérile dans la boîte.

Incuber la boîte à 37 degrés Celsius pendant cinq à vingt minutes, puis aspirer la solution de fibronectine. Ensuite, récolter les cellules HBE cinq I à partir d’un flacon de tissu carré de 25 centimètres carrés par ionisation et centrifugation Reese, suspendre le culot cellulaire dans 10 millilitres de DMEM, milieu complet. Ajouter ensuite 1,5 millilitre de cette suspension cellulaire dans la boîte de culture tissulaire traitée à la fibronectine et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à ce que la culture atteigne une confluence de 50 à 100 %, et que les cultures de parasites soient prêtes pour la cyto aian le jour du test.

La culture HBE cinq I doit présenter une confluence de 50 à 100 %. La culture de parasites doit quant à elle se trouver au stade de trophozoïtes pigmentés, avec un taux de parasité d'au moins 5 à 10 % et un hématocrite de 2 %. Commencez par prélever 1,5 millilitre de la culture de parasites à l’aide d’une pipette depuis le flacon de culture, puis transférez-le dans un tube conique de 15 millilitres.

Centrifuger la culture à 500 G pendant cinq minutes et reprendre dans 10 millilitres d’un DMEM incomplet, milieu chaud fraîchement préparé. Répéter cette étape de lavage une deuxième fois après la centrifugation finale.

Réaspirer le DMEM incomplet, le milieu, et resuspendre le culot de 30 microlitres dans 1,5 millilitre de DMEM incomplet, supplémenté avec 1 % de BSA. Ensuite, récupérer la boîte de 60 millimètres de hvac.Five.

Les cellules oculaires aspirent le milieu de culture et lavent deux fois avec trois millilitres de DMEM. Milieu incomplet. Ajouter la solution de parasites, la boîte de cinq cellules oculaires HPE et incuber dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 75 minutes au total.

Pendant l'incubation, deux fois, resuspendre les parasites en agitant doucement et en faisant tournoyer le plat après l'incubation. Laver le plat cinq fois en aspirant le milieu à l’aide d’une pipette en plastique, puis en ajoutant trois millilitres de milieu DMEM incomplet tiède, et après le dernier lavage, agiter doucement la plaque, puis examiner le plat au microscope inversé. Si de nombreux globules rouges non infectés sont encore visibles, répéter la procédure de lavage décrite ci-dessus pour les éliminer.

Après avoir aspiré le milieu de la boîte, resuspendre 40 microlitres de volume cellulaire compacté de globules rouges frais dans du milieu RPMI complet préchauffé et ajouter la suspension cellulaire dans la boîte. Placer la boîte dans une chambre d'incubation hermétique à l'air. Ensuite, saturer la boîte avec un mélange gazeux composé de 3 % de dioxyde de carbone, 1 % d'oxygène et 96 % d'azote pendant trois minutes.

Et placer la chambre dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pendant cette incubation, les schizontes à stade avancé éclatent et les mérozoïtes réinfectent les globules rouges. Le lendemain, récolter les parasites au stade en anneau par lavage.

Avec du milieu RPMI incomplet, de manière similaire à précédemment, mais en pipetant plus vigoureusement le milieu et en agitant doucement la plaque. Conserver tout le milieu utilisé, qui contiendra les globules rouges en suspension, dans un tube conique de 15 millilitres. Examiner la plaque au microscope inversé afin de s'assurer que tous les globules rouges ont été retirés de la boîte avant la centrifugation.

Le tube contenant le milieu provenant de la plaque lavée permet de faire tomber les parasites en sédimentation par centrifugation ; jeter le surnageant, puis resuspendre dans cinq millilitres de milieu RPMI complet et placer le mélange dans un flacon carré de 25 centimètres carrés pour la culture. Les parasites sont cultivés pendant deux à quatre semaines jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de matériel et qu'un nouveau cycle de sélection puisse être effectué.

Les parasites HB trois non sélectionnés présentent un faible niveau de liaison aux cellules oculaires hbe cinq. Cette image montre des cellules oculaires hbe cinq fixées avec du glutaraldéhyde à 2 % et colorées à la Giemsa, observées au microscope avec un grossissement de 1000 fois. Les photographies ont été prises après avoir éliminé par lavage les globules rouges non infectés et les globules rouges infectés non liés. Après chaque cycle de sélection, un nombre croissant de parasites se lie aux cellules endothéliales, et les sélections peuvent être répétées à des intervalles de temps plus courts après cinq cycles de sélection.

Des populations de parasites à forte affinité sont obtenues, comme illustré ici avec les parasites HB trois HBE. Ce tableau présente un résumé des souches de plasmodium alspar qui ont été sélectionnées avec succès pour leur liaison à HE cinq. Je note que HB trois a également été sélectionné sur HE cinq activé par la TNF après cinq cycles de sélection.

La souche DD deux n'a montré aucune augmentation de liaison à HBE cinq I par rapport à la DD deux non sélectionnée. Cette image à un grossissement de 400 fois montre la liaison des parasites Plasmodium alspar HB trois à des cellules endothéliales dermiques HD MEK avant sélection. Ici, la liaison des parasites Plasmodium alspar HB trois à la même lignée cellulaire endothéliale dermique est illustrée après quatre cycles de sélection.

Cette figure montre la liaison des parasites plasmodium spar HB trois aux cellules endothéliales pulmonaires HP ME avant la sélection. La liaison des parasites plasmodium spar HB trois aux cellules HP ME est désormais augmentée après quatre cycles de sélection. Bien que le milieu de culture pour les hd e, C et les HP EC diffère légèrement, le protocole utilisé pour la sélection était identique à celui utilisé avec hbe cinq I. Après cette procédure, des méthodes telles que la R-T-P-C-R ou l'analyse microscopique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la caractérisation de la transcription de l'antigène de surface variant chez les parasites non sélectionnés et sélectionnés.