Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l'ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d'expression génique

L’objectif global de cette procédure est de collecter l’ARN total à partir de noyaux cérébraux discrets de manière reproductible, cohérente, rentable et sans ARN. Ceci est accompli en préparant d’abord un environnement de travail sans RN et en retirant tout le cerveau d’une souris décapitée. Ensuite, un hachoir à tissus actionné par micromètre est utilisé pour couper des sections de tissus en série de taille uniforme.

Ensuite, les régions cérébrales d’intérêt sont micro-disséquées à l’aide d’un noyau de tissu de diamètre défini tout en maintenant le tissu dans un environnement de milieu sans ARN. Enfin, l’ARN total est isolé des noyaux cérébraux excisés. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent un rendement et une qualité d’ARN totaux suffisants pour la préparation de banques d’ARNC en aval et le profilage du transcriptome par des tests photométriques de spectres ou fluorométriques.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’anatomie macroscopique ou l’excision assistée par microscopie laser, est que plusieurs régions cérébrales discrètes d’intérêt peuvent être collectées à partir du cerveau d’une souris individuelle de manière reproductible et suffisamment coûteuse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la corrélation entre des profils d’expression de transcrits distincts dans des régions cérébrales associées à l’absence de circuits neuronaux, à certains traits comportementaux, à des réponses environnementales et/ou à un état pathologique. Pour vous préparer à la microdissection, complétez 100 millilitres de solution saline équilibrée d’Earl ou EBSS avec 0,44 gramme de bicarbonate de sodium et 0,884 gramme de glucose.

Traitez l’EBSS avec 0,1 millilitre de DEPC dans une bouteille autoclavable ou une fiole avec un bouchon à vis pendant au moins 12 heures. À 37 degrés Celsius. Placez des pipettes en verre de cinq pouces et trois quarts dans un bécher en verre d’un litre et placez les pinceaux d’artiste avec les poils vers le haut dans un cylindre en verre gradué de 100 millilitres.

Ajouter suffisamment de solution d’eau traitée au DEPC pour couvrir les pipettes et les brosses. Couvrir le bécher et le cylindre gradué avec du papier d’aluminium et incuber pendant au moins 12 heures à 37 degrés Celsius après l’incubation de 12 heures avec du DEPC, chauffer tous les matériaux traités au DEPC à une température supérieure à 100 degrés Celsius pendant au moins 15 minutes. Refroidir. L’EBSS à température ambiante avant d’être stocké à quatre degrés Celsius.

Versez le DD H2O hors du bécher et du cylindre gradué et continuez à les incuber à plus de 100 degrés Celsius jusqu’à ce que les matériaux soient secs. Retirez-les de l’incubateur, refroidissez-les à température ambiante et conservez-les pour une utilisation ultérieure. Le jour de l’expérience, traitez toutes les surfaces de travail pour éliminer la contamination par les ARN et maintenez l’EBSS dans un bain-marie réglé à 40 degrés Celsius pour tamponner et oxygéner.

Les EBSS l’infiltrent avec 5 % de CO2 et 95 % d’oxygène en plaçant un tube de gaz dans une pipette de pâturage sans ARN. Et l’insertion de la pipette dans l’EBSS couvre l’ouverture du récipient EBSS. Installez un coupe-tissus pour la section en série du tissu cérébral.

Traitez les surfaces supérieure et inférieure de la trancheuse à tissus. Pour éliminer la contamination par les ARN, fixez un morceau rectangulaire de papier filtre watman Number four à la surface en plexiglas du hachoir à tissus. Fixez une lame de rasoir à double tranchant au bras du hachoir.

Réglez le micromètre à zéro et ajustez la hauteur minimale du bras du hachoir pour permettre à la lame de rasoir de couper le papier filtre, mais pas la plaque de plexiglas. Rassemblez tout le matériel supplémentaire nécessaire à la microdissection, y compris des boîtes de culture cellulaire sans ARN de 60 x 15 millimètres, des pointes de micro-pipette sans ARN de 200 microlitres, des ciseaux incurvés, de la glace sèche et des tubes pour le prélèvement de tissus. Placez les tubes sur de la glace sèche après avoir décapité une souris à l’aide d’une guillotine de rongeur et retiré tout le cerveau avec le cerveau postérieur et les nerfs optiques intacts.

Placez le cerveau dans le haut d’une boîte de culture cellulaire sans ARN de 60 x 15 millimètres. Transférez-le ensuite sur la surface de travail de l’échantillonnage de tissus. À l’aide d’une pipette sans ARN, humidifiez de manière conservatrice le papier filtre fixé au hachoir à tissus avec EBSS.

Mouillez le tissu cérébral avec EBSS. Transférez le cerveau dans le hachoir à tissus et positionnez-le avec la surface ventrale reposant sur le papier filtre. La ligne médiane perpendiculaire à la pale de l’hélicoptère et le bord rostral du cerveau attenant à la pale.

Utilisez un pinceau d’artiste traité A-D-E-P-C pour maintenir le cerveau immobile en appliquant une légère pression sur la surface dorsale du cerveau tout en maintenant le cerveau immobile. Soulevez le levier du porte-lame à environ quatre à cinq centimètres au-dessus de la surface du tissu dorsal et maintenez-le dans cette position. Retirez la brosse de la surface du cerveau et composez 750 micromètres.

Utilisation du micromètre. Laissez le levier tomber, hachant le tissu et créant une section coronale de 750 micromètres pendant que la lame du hachoir reste immobile. Utilisez un mouvement de roulement avec le pinceau d’artiste pour balayer doucement la section de tissu loin de la surface de la lame.

Placez immédiatement la section de tissu dans l’EBSS oxygéné dans la boîte de Pétri. Cette tranche est maintenant prête pour la micro-dissection. Répétez la procédure de tranchage jusqu’à ce que des sections de cerveau en série aient été obtenues sur tout le plan codal rost pour effectuer une micro-dissection.

Tout d’abord, vérifiez l’éclairage pour vous assurer que l’éclairage de l’échantillon ne sera pas obstrué. Ajustez la position et le débit du mélange O2 CO2 pour maintenir un environnement oxygéné tamponné pour les tissus. Au cours de la procédure, identifiez la section coronale du cerveau qui comprend la région d’intérêt et, à l’aide d’un pinceau d’artiste, orientez-la à plat sur le fond de la boîte de Pétri.

Sélectionnez la carotte de tissu avec le diamètre approprié. Maintenez la section de tissu coronal en place avec le pinceau d’artiste et amenez la pointe de coupe du noyau de tissu vers le bas sur la surface de la section de tissu. Tout en appliquant une pression, appuyez fermement sur l’extrémité de la carotte de tissu à travers la section de tissu et vers le bas de la boîte de Pétri.

Utilisez un mouvement circulaire de roulement pour vous assurer que la région d’intérêt a été dissociée du tissu environnant. Soulevez avec précaution le noyau de tissu de la section de tissu et libérez le micro-poinçon pour lui permettre de flotter dans l’EBSS à l’aide d’un pinceau d’artiste. Déposez immédiatement le micro-poinçon de tissu dans un tube de stockage stable à moins 80 degrés Celsius conservé sur de la glace sèche.

Le tissu doit facilement adhérer au côté du tube. Remettez le tube contenant l’échantillon de micros dans la glace sèche. Répétez cette microdissection pour chaque région cérébrale d’intérêt.

Une fois la microdissection terminée, notez l’étiquette ou les codes-barres respectifs pour chaque échantillon contenant un tube. Placez les échantillons de tissus dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction de l’ARN pour extraire l’ARN des échantillons de tissus. Tout d’abord, préparez un espace de travail sans ARN.

Préparez une quantité suffisante de mélange de billes magnétiques et de solution de liaison à la lyse, comme décrit dans le manuel du kit d’isolement de l’ARN total. Retirez les échantillons de tissus du congélateur à moins 80 degrés Celsius et placez les tubes directement sur de la glace sèche. Ajoutez 100 microlitres de la solution de liaison à la lyse dans un tube d’échantillon.

Fixez un pilon de la taille d’un tube de 0,5 millilitre sans nucléase au mélangeur de granulés et homogénéisez le tissu à l’aide d’une pointe de pipette sans nucléase à faible rétention. Transférez immédiatement l’échantillon homogénéisé dans un puits sur une plaque de culture tissulaire à fond rond de 96 puits en utilisant le même type de pointe. Ajoutez 60 microlitres d’isopropanol à 100 % à l’échantillon.

Ajoutez 20 microlitres de mélange de billes à l’échantillon et mélangez en pipetant de haut en bas trois à quatre fois. Suivez le protocole du kit d’isolement de l’ARN total Étapes pour terminer l’extraction de l’ARN total. Enfin, mesurez la pureté et la concentration de l’ARN total résultant Les données des micro-coups de poing de diverses régions du cerveau sont présentées dans ce tableau.

échantillons d’ARN auxquels il est fait allusion avec 30 microlitres d’evolution Buffer ont fourni suffisamment d’ARN total pour une utilisation avec des produits de préparation de CD NA disponibles dans le commerce pour les applications de séquençage de l’ARN. De plus, le rendement en ARN et deux rapports de 60 à deux 80 sont des valeurs uniques obtenues à partir d’échantillons de microdissection respectifs pour démontrer les lectures obtenues de chaque région du cerveau et ils confirment une grande pureté de l’échantillon Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en huit à 10 minutes si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de minimiser le risque de contamination par l’ARN des surfaces de travail ou des échantillons de tissus en n’utilisant que des matériaux sans ARN ou traités au dsy.