Name: Récepteur dimagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez la microscopie confocale avancée pour étudier la chimiotaxie chez Dictyostelium discoideum. Cette méthode permet de visualiser en temps réel la dynamique spatiotemporelle des événements de signalisation contrôlés par les RCPG.

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1. Préparation du chimiotactisme des cellules compétentes de Dictyostelium discoideum <ol><li> Pour générer des cellules D. discoideum qui sont chimiotactiques au camp chimiotactique, la récolte des cellules de plus en plus D3-t rich media à partir d'une culture en agitant à 22 ° C. </li><li> Laver les cellules deux fois en mémoire tampon non nutritifs développement (buffer DB contenant 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, MgCl2 2 mM, 0,1 mM CaCl et 2). </li><li> Re-suspendre les cellules dans un tampon de DB à une densité de 2x10 7 cellules / ml. </li><li> Agiter 10 ml de cellules dans un flacon de 250 ml à 100 rpm à 22 ° C pendant une heure. </li><li> Livrer 100 ul de 7,5 uM AMPc stocks aux 10 cellules par ml toutes les six minutes de plus de 6 heures pour obtenir une concentration finale de 75 nM d'AMPc, un processus désigné comme le traitement de l'AMPc pulsation. Après 5-6 heures de traitement pulsation AMPc, D. cellules discoideum deviennent compétents chimiotactiques envers gradient d'AMPc. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min puis remettre les cellules avec le tampon DB contenant 2,5 mM de caféine, et secouer à 200 rpm à 22 ° C pendant 20 min à basolate cellule à une situation chimiotactiques. </li></ol> 2. Imagerie cellules chemotaxing dans un gradient chimiotactique visible et manipulable <ol><li> Remblai d'une micropipette avec un fraîchement préparés solution à 30 pi de 1 uM AMPc et Alexa 594 au 0.1μg/μl dans le tampon de la DB. </li><li> Fixez le Femtotip à un titulaire de micropipette et raccorder le tuyau à un appareil d'alimentation de pression, Eppendorf FemtoJet système. </li><li> Fixez l'ensemble micropipette pour un micromanipulateur (Eppendorf TransferMan NK2) motorisé micromanipulateur pour fournir une pression constante en vue d'établir un gradient stable. </li><li> Monter une chambre d'un bien LabTek rempli de 6 ml de tampon DB sur une lentille d'huile 40X sur un microscope confocal et l'utilisation brillante optique de champ, le centre Femtotip dans le champ de vision. </li><li> Allumez l'alimentation de pression et régler la pression de compensation (PC) pour 70 hPa pour établir un gradient de l'AMPc / Alexa 594 mélange. </li><li> Visualisez gradient d'AMPc par la surveillance du mélange de concentration souhaitée de l'AMPc et Alexa 594 fluorescence à l'aide d'excitation avec une ligne de 543 nm du laser. </li><li> Utiliser l'auto-positionnement en fonction de la micromanipulateur pour mettre micropipette pour les positions souhaitées et de les définir comme la position 1, position 2, 3 et position de manipuler le gradient à laquelle la cellule sont exposés. </li></ol> 3. Immobile système cellulaire non polarisé facilite des événements de signalisation impliquées dans l'imagerie de l'AMPc gradient de détection <ol><li> Après le traitement de caféine, enlever une partie aliquote de cellules et centrifuger à 500 g pendant 3 min. </li><li> Retirer du tampon et de diluer les cellules à 5x10 5 cellules / ml avec le tampon DB frais contenant 2,5 mM de caféine. </li><li> Appliquer 1 ml de suspension cellulaire à une chambre simple bien ou 0,4 ml dans chaque puits d'une chambre de quatre puits. </li><li> Laisser les cellules adhèrent pendant 10 min, soigneusement la pipette hors du tampon pour enlever les cellules seules et remplacer par le même volume. </li><li> Repérez les cellules sous le microscope désirée et commencer l'imagerie. </li><li> Pour une expérience conçue pour surveiller la dynamique de la signalisation dans les cellules composantes exposer à un gradient constant, de traiter les cellules avec 5,0 uM (concentration finale) Latrunculin B pendant 10 min avant les expériences. </li></ol> 4. Simultanée hétérotrimériques surveillance protéine G activation et la production PIP 3 <ol><li> AMPc pulsation développer des cellules co-exprimant GαCFP et YFPGβ (cellules G) et des cellules exprimant le PIP 3 Indicateur PH-GFP (cellules PH) 7. </li><li> Mélanger ces deux types de cellules avec un rapport 1:1 et plaque eux dans les chambres d'un bien ou 4-même. </li><li> Créez et enregistrez des émissions de référence d'empreintes digitales courbe de CFP, YFP et la GFP en utilisant le mode d'acquisition Lambda Stack dans la gamme spectrale de 464 à 624 nm avec une largeur de 10 nm. </li><li> Simultanément activation de la protéine G d'image dans les cellules G et 3 PIP production dans des cellules en utilisant PH avec mode Lambda Acquisition même pile dans la gamme spectrale de 464 à 544 nm avec un incrément de 10 nm. </li><li> Appliquer la fonction linéaire de Déconvolution Zeiss 510META logiciels utilisant sauvé CFPand YFP et les empreintes digitales d'émission pour calculer mathématiquement la contribution de chaque fluorophore dans la pile lambda de se séparer de la PCP et de l'intensité YFP dans les canaux individuels dans G. </li><li> Avec la même stratégie, appliquer la fonction linéaire Déconvolution utilisant la GFP et les empreintes digitales enregistrées des émissions de fond pour calculer mathématiquement l'intensité de GFP dans les cellules PH. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <ol><li> Un excellent modèle de D. discoideum pour chimiotactisme GPCR médiation. Une amibe sociale, D. discoideum présente un chimiotactisme frappante durant le cycle de vie. En raison de ses avantages génétiques et biochimiques, D. D fournit une puissante système d'étudier le chimiotactisme. </li><li> Chimiotactisme des cellules sous un champs visible et manipulable chemoattract. Ici, nous montrons d'abord une méthode simple pour obtenir une relation linéaire entre la concentration d'AMPc et l'intensité d'un colorant fluorescent Alexa 594 par une série de dilution de 2 uM AMPc mélangé avec 10 ug / ml Alexa 594 (figure 2A). Ensuite, nous offrent un moyen facile de visualiser la pente, en outre, d'établir une mesure quantitative de la concentration d'AMPc d'un gradient de l'intensité des Alexa 594 (fig. Fig. 2B). </li><li> Motilité cellulaire est découplée de la polarisation cellulaire et la détection directionnelle. Un inhibiteur polymérisation de l'actine élimine pré-existantes de polarité morphologique et empêche également le mouvement des cellules tout en préservant la capacité des cellules de détection directionnel (figure 3A). Emploi de la stimulation de l'AMPc visible et manipulable garantit l'entrée, par exemple des stimulations appliquées uniformément ou avec un dégradé. Cette méthode permet une analyse quantitative de l'AMPc induite par la redistribution des principaux composants de signalisation dans les machines de détection de gradient. Mesuré dynamique spatio-temporelle de ces composants de signalisation nous permettent de comprendre comment le réseau de signalisation réalise l'adaptation aux stimulations uniforme tout en générant des réponses biochimiques polarisée aux gradients (figure 3B). </li><li> Mesures systémiques de la cinétique des chemosensing réseau de signalisation à l'exposition à un gradient constant. Il est essentiel de mesurer la dynamique / cinétique de la signalisation directionnelle de détection de composantes de comprendre comment chaque élément contribue à l'établissement de la polarisation intracellulaire lorsque les cellules d'expérience du premier gradient. Application de l'imagerie de cellules vivantes avec un tempo-spatiale haute résolution, nous montrons d'abord une biphasique PIP3 production de cellule qui est exposée à un gradient d'AMPc stable (Fig. 4A-C). Application imagerie des cellules vivantes, nous avons systématiquement mesuré dynamique de direction à détection de réseau de signalisation spécifiques de la stimulation de la production d'AMPc d'PIP3 (Fig. 4D, E). </li><li> Contrôle de l'activation simultanée des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 lors de la stimulation de production d'AMPc appliquées uniformément. Förster énergie de résonance de transfert (en abrégé FRET) fournit une approche efficace pour contrôler l'activation des protéines G hétérotrimériques (dissociation) lors de la stimulation de l'AMPc. Ici, nous avons décrit une pratique et facile d'adopter le système pour une mesure simultanée de l'activation des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 Production en surveillant le FRET changement et translocation membranaire de PIP 3 sonde, PH-GFP dans les cellules G et PH, respectivement (Fig. 5 ). Une stimulation de l'AMPc appliquée uniformément déclenche une activation de la protéine G persistante tout ce qui déclenche un PIP transitoires de production 3. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: un excellent modèle de D. discoideum de la chimiotaxie médiée GPCR. A. Schéma montre une voie de signalisation de détection brève directionnelle. B. AMPc induit le chimiotactisme gradient rapide de D. cellules discoideum. Cellules expriment PIP 3 sonde, PH-GFP (Green). Dégradé (rouge) est visualisée par Alexa 594. Barre d'échelle = 50 microns. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: chimiotactisme des cellules sous un champs visible et manipulable chemoattract. A. Le graphique montre une relation linéaire entre la concentration d'AMPc et l'intensité d'un colorant fluorescent Alexa 594 par une série de dilution de 2 uM AMPc mélangé avec 10 ug / ml Alexa 594. B. La mesure quantitative de la concentration d'AMPc d'un gradient par la relation linéaire de la concentration de l'AMPc et l'intensité des colorant fluorescent Alexa 594 dans A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: la motilité cellulaire est découplée de la polarisation cellulaire et la détection directionnelle. A. Image montre que les cellules immobile par le traitement de l'inhibiteur de la polymérisation de l'actine Latrunculin B maintenir la capacité de détection directionnel. Cellules expriment PIP 3 sonde, PH-GFP (Green). Dégradé (rouge) est visualisée par Alexa 594. B. AMPc cellulaire manipulable système de stimulation et immobile permet de répondre aux questions clés de la détection directionnelle. Barre d'échelle = 10 microns. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: mesures systémiques de la cinétique des chemosensing réseau de signalisation à l'exposition à un gradient constant. A. Montage montre un PIP biphasique de production 3 (verte) de la cellule qui est exposée à un gradient d'AMPc constante (rouge). B. image montre les régions d'intérêt (ROI) pour la mesure de la cinétique de PIP 3 de production présentées dans C. C . Kinetics oPIP F 3 la production dans les cellules exposées à un gradient constant. D. schéma montre le réseau de signalisation de détection directionnelle de la stimulation de l'AMPc à la PIP 3 de la production. Leur cinétique après exposition à un gradient d'équilibre est présenté dans les lignes de même couleur solide dans E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Figure 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: simultanée de surveillance multi-événements des réseaux de signalisation des RCPG. Schéma A. montre la mesure simultanée de l'activation des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 Production en surveillant le FRET changement et la translocation membranaire des PIP3 sonde, PH-GFP dans les cellules G et PH, respectivement. B. Montage d'images d'arc-en-G et les cellules PH montre qu'une stimulation de l'AMPc appliquée uniformément déclenche une activation de la protéine G persistante à la cellule périphérique, tout ce qui déclenche une passagère PIP3 production. Les points de temps sont avant (0s) et après stimulation par 4.9s, 10.2s et 20.4s. C. Cinétique de l'activation des protéines G et PIP3 production sur une stimulation de l'AMPc appliquées uniformément.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
<li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li>
<li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li>
<li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%2C+chemokine+receptors+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li>
<li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li>
<li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li>
<li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li>
<li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+phosphatidylinositol+3%27+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li>
<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le processus d&#39;atteindre l&#39;étape chimiotactiques compétentes des cellules Pour type sauvage D. cellules discoideum, il faut environ 5 ~ 6 heures pulsation de développement à la température ambiante pour les inciter à une étape bien chimiotactiques compétents au cours de laquelle les cellules présentent une morphologie bien polarisée cellulaire et la migration cellulaire rapide (Fig. 1). Plusieurs facteurs, tels que la concentration d&#39;AMPc d&#39;impulsions, de la te...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Médias croissance D3-T </td><td> KD médicale </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La caféine </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AMPc </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT minuterie programmable </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 pompe péristaltique </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Platform agitateur rotatif </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Approvisionnement FemtoJet pression microcapillaire </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Simple et quatre ainsi Lab-Tek II lamelle chambres </td><td> Nalge Nunc International </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META ou équivalent microscope à fluorescence </td><td> Zeiss </td><td></td><td> une 40X 60X 1,3 NA ou NA 1.4 du pétrole lentilles DIC objectif du Plan-Neofluar </td></tr><tr><td> Olympus X81 ou équivalent </td><td> Olympus </td><td></td><td> Nécessite un 100X 1,47 NA TIRF lentille d&#39;objectif </td></tr></tbody></table>

récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines g (rcpg) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Beaucoup de cellules eucaryotes peuvent détecter des gradients de signaux chimiques dans leur environnement et de migrer en conséquence 1. Cette migration cellulaire guidée est mentionné que le chimiotactisme, qui est essentiel pour différentes cellules pour mener à bien leurs fonctions telles que le trafic des cellules immunitaires et la structuration des cellules neuronales 2, 3. Une grande famille de G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) détecte la variable de petits peptides, connu sous le nom de chimiokines, de diriger la migration cellulaire in vivo 4. L&#39;objectif final de chimiotactisme de recherche est de comprendre comment un gradient de chimiokine GPCR machines et des commandes de signalisation sens des événements menant à la chimiotaxie. À cette fin, nous utilisons des techniques d&#39;imagerie pour suivre, en temps réel, les concentrations spatio-temporelle des mouvements chimiotactiques cellulaire, dans un gradient de chimiotactique, GPCR activation médiée par des protéines G hétérotrimériques, et les signaux intracellulaires impliqués dans le chimiotactisme des cellules eucaryotes 5-8 . L&#39;organisme simple eucaryotes, Dictyostelium discoideum, affiche des comportements chemotaxic qui sont similaires à celles des leucocytes, et D. discoideum est un système modèle pour l&#39;étude des principaux chimiotactisme eucaryotes. Comme amibes libres, D. discoideum cellules se divisent en milieu riche. Après la famine, les cellules entrer dans un programme de développement global dans lequel elles par le biais de l&#39;AMPc à médiation chimiotactisme pour former des structures multicullular. De nombreux composants impliqués dans le chimiotactisme au camp ont été identifiés dans D. discoideum. La liaison de l&#39;AMPc à un GPCR (CAR1) induit la dissociation des protéines G hétérotrimériques dans Gγ et 7 sous-unités Gßy, 9, 10. Sous-unités Gßy activer Ras, qui active à son tour la PI3K, la conversion PIP PIP 2 en 3 sur la membrane cellulaire de 11 à 13. PIP 3 servent de sites de liaison pour des protéines ayant une homologie avec pleckstrine (PH) domaines, recrutant ainsi ces protéines à la membrane 14, 15. L&#39;activation des récepteurs CAR1 contrôle également les associations de la membrane de PTEN, qui déphosphoryle PIP PIP 3 à 2 16, 17. Les mécanismes moléculaires sont évolutivement conservées dans des chimiokines GPCR médiée par le chimiotactisme des cellules humaines telles que les neutrophiles 18. Nous présentons des méthodes suivantes pour étudier le chimiotactisme des D. cellules discoideum. 1. Préparation des cellules composant chimiotactiques. 2. Imagerie chimiotactisme des cellules dans un gradient d&#39;AMPc. 3. Surveillance d&#39;une activation induite des RCPG G hétérotrimériques protéines dans des cellules vivantes simples. 4. Imagerie chimioattractive déclenché PIP dynamique 3 réponses simples cellules vivantes en temps réel. Nos méthodes d&#39;imagerie développée peut être appliquée à l&#39;étude du chimiotactisme des leucocytes humains.

Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules eucaryotes.

Récepteur d&#39;imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum</em

De nombreuses cellules eucaryotes peuvent détecter des gradients de signaux chimiques dans leur environnement et migrer en conséquence 1. Cette migration cellulaire guidée est appelée...

L'objectif général de cette procédure est d'appliquer une microscopie confocale à fluorescence avancée afin de surveiller la dynamique spatiotemporelle des événements de signalisation lors de la chimiosensation dans des cellules de Dictyostelium discoideum, d'abord rendues chimiotactiquement compétentes. Ensuite, un gradient contrôlé d'agent chimiotactique est imagé afin d'établir une relation linéaire entre la concentration de l'agent chimiotactique et l'intensité fluorescente de l'agent chimiotactique. La troisième étape consiste à obtenir un système de cellules immobiles pour l'imagerie des événements de signalisation impliqués dans la détection du gradient de AMP cyclique.La dernière étape consiste à surveiller simultanément deux événements de signalisation contrôlés par les RCPG, l'activation des protéines G hétérotrimériques et la production de PIP trois. En fin de compte, les changements spatiotemporels des intensités de fluorescence dans des cellules individuelles, stimulées par un chimioattractant, peuvent être visualisés par imagerie en temps réel sur cellules vivantes à l'aide d'une microscopie confocale avancée.L'avantage principal de cette technique est de nous permettre d'obtenir des informations spatiales et temporelles sur les événements de signalisation dans des cellules vivantes. Ces mesures en temps réel permettent une meilleure compréhension de la manière dont le réseau de signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (A-G-P-C-R) est capable de détecter un ingrédient chimiotactique et de générer des réponses appropriées. La procédure sera démontrée par le Dr Shu, expert en méthodes d'imagerie en temps réel. Pour générer des cellules de dsco dium chimiotactiques envers l'agent chimiotactique AMP cyclique, récoltez les cellules en croissance dans un milieu D trois trich à partir d'une culture agitée à 22 degrés Celsius.Laver les cellules deux fois dans un tampon de développement sans nutriments par centrifugation à 400 G pendant cinq minutes. À température ambiante, resuspendre les cellules dans le tampon DB à une densité de deux fois 10 à la puissance sept cellules par millilitre. Transférer 20 millions de cellules dans 10 millilitres de tampon de développement dans un flacon de 250 millilitres, puis agiter les cellules à 100 tr/min à 22 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution mère d'AMPc à 7,5 micromolaire aux 10 millilitres de cellules toutes les six minutes pendant les six heures suivantes afin d'obtenir une concentration finale de 75 nanomolaire d'AMPc. Récupérez maintenant les cellules compétentes chimiotactiques à l'AMPc par centrifugation, cette fois à 200 ×g, puis remettez en suspension les cellules dans du tampon DB contenant de la caféine à 2,5 millimolaire. Agitez à nouveau les cellules à 22 degrés Celsius pendant 20 minutes, cette fois à 200 tr/min, afin de préparer les cellules pour la chimiotaxie.Remplissez d’abord une micropipette avec une solution fraîchement préparée de 30 millilitres d’AMP cyclique à une concentration d’un micromolaire et d’Alexa 594 à 0,1 microgramme par microlitre dans du tampon DB. Ensuite, fixez une pointe Femto à un porte-pipette et reliez le tube à un appareil d’alimentation en pression. Pour établir un gradient stable, fixez l’ensemble de la micropipette à un micromanipulateur motorisé.Remplissez une chambre de laboratoire à une alvéole avec six millilitres de tampon DB, puis placez la chambre au-dessus d’un objectif à immersion huile 40 x sur un microscope confocal en utilisant l’optique Brightfield pour centrer la pointe Femto dans le champ de vision. Ensuite, activez l’alimentation en pression et réglez la pression de compensation à 70 hPa pour établir un gradient du mélange AMP cyclique Alexa 594. Visualisez le gradient d’AMP cyclique en surveillant le mélange à la concentration souhaitée d’AMP cyclique et la fluorescence d’Alexa 594 à l’aide d’une excitation par une ligne laser de 543 nanomètres.Enfin, utilisez la fonction de positionnement automatique du micro-manipulateur pour placer la micropipette aux positions souhaitées et définissez la position un, la position deux et la position trois afin de contrôler le gradient auquel les cellules sont exposées. Après le traitement à la caféine, prélèvez un aliquot de cellules et centrifugez les cellules à 500 G pendant trois minutes. À température ambiante, retirez le tampon et diluez les cellules à cinq fois 10 à la puissance cinq cellules par millilitre.Avec du tampon DB frais contenant de la caféine à 2,5 millimolaire. Appliquer ensuite un millilitre de la suspension cellulaire dans une chambre à un puits. Après avoir laissé les cellules adhérer pendant 10 minutes, pipeter délicatement le tampon pour éliminer les cellules non attachées, puis le remplacer par le même volume de tampon DB frais contenant de la caféine afin de commencer l'acquisition d'images, puis localiser les cellules souhaitées au microscope.Ensuite, pour surveiller la dynamique des composants de la signalisation dans des cellules exposées à un gradient stable. Incuber les cellules avec cinq micromolaires de LA truculent B pendant 10 minutes avant toute expérience. Ce schéma illustre brièvement la voie de signalisation impliquée dans la détection de direction dans ce film.On observe comment un gradient cyclique de AMP induit une chimiotaxie rapide des cellules de D. discost, des cellules exprimant la sonde PIP trois. P-H-G-F-P apparaît en vert. Le gradient, tel qu'il est visualisé par l'Alexa 594, apparaît en rouge. Ici.Une méthode simple permettant d'obtenir une relation linéaire entre la concentration en AMP cyclique et l'intensité d'un colorant fluorescent. On illustre ici une série de dilutions d'AMP cyclique à deux micromoles par litre, mélangée à 10 microgrammes par millilitre d'Alexa 594.Ensuite, un moyen simple d'établir une mesure quantitative de la concentration en AMP cyclique d'un gradient par l'intensité d'Alexa 594 est illustré graphiquement. Cette figure montre comment des cellules dont la motilité a été supprimée par la latrunculine B, un inhibiteur de la polymérisation de l'actine, conservent tout de même leur capacité de détection directionnelle. Les cellules expriment la sonde PIP3, P-H-G-F-P, et apparaissent en vert, tandis que le gradient en rouge est visualisé par Alexa 594.Dans cette vidéo, on peut observer comment l'utilisation d'un système cellulaire simplifié non polarisé et d'une stimulation cyclique de l'AMP modifiable permet d'aborder des questions fondamentales liées à la détection de direction. Afin de démontrer l'application de l'imagerie en temps réel avec une résolution spatiale élevée, une cellule colorée en vert présentant une expression biphasique du PIP trois est montrée ici, en réponse à une exposition à un gradient stable de l'AMP cyclique en rouge.Cette image montre les régions d'intérêt pour la mesure de la cinétique de production de PIP trois. La cinétique de production de PIP trois à l'avant et à l'arrière des cellules suite à une exposition à un gradient constant est présentée ici, la production de PIP trois à l'avant et à l'arrière étant représentée respectivement en noir et en gris. En appliquant l'imagerie de cellules vivantes, nous avons mesuré systématiquement la dynamique d'un réseau de signalisation spécifique à la détection de direction, allant de la stimulation par l'AMP cyclique à la production de PIP trois.Ce schéma montre le réseau de signalisation de la détection de direction à partir de la stimulation par l'AMP cyclique jusqu'à la production de PIP trois. La cinétique de chaque composant est présentée par une ligne de la même couleur. Sur cette première figure, la manière dont une stimulation uniforme par l'AMP cyclique déclenche une activation persistante de la protéine G, qui à son tour provoque une production transitoire de PIP trois, est illustrée dans ce film.Un éventail d'images de cellules G et pH montre qu'une stimulation cyclique par AMP appliquée de manière uniforme déclenche une activation persistante des protéines G au niveau de la périphérie cellulaire, ce qui induit simultanément une production transitoire de PIP trois. Ici, les cinétiques d'activation des protéines G et de production de PIP trois suite à une stimulation cyclique par AMP appliquée de manière uniforme sont présentées. Lors de la réalisation de ces expériences, il est important de garder à l'esprit que l'essentiel consiste à obtenir des cellules réactives, car différents fonds génétiques cellulaires et conditions environnementales peuvent influencer les résultats.Les conditions d'acquisition d'images modifient toutes la physiologie cellulaire et peuvent rendre la cellule moins réactive. Après cette procédure, la modélisation computationnelle peut être appliquée afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière dont les interactions dynamiques au sein d'un réseau de signalisation donnent naissance à un comportement cellulaire. Ces méthodes ouvrent la voie aux chercheurs dans le domaine de la chimiotaxie eucaryote.Nous pouvons élaborer un modèle computationnel de détection des chimioattractants. Ce modèle peut être utilisé pour simuler la dynamique d’un événement de signalisation. L’interaction entre l’affinement du modèle et la mesure des caractéristiques du mode de vie peut conduire à une compréhension plus approfondie des chimiotaxies.Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que vous avez une meilleure compréhension de la manière d'appliquer la microscopie confocale à fluorescence avancée pour surveiller les événements de signalisation dans des cellules vivantes. Nous espérons que vous pourrez appliquer cette méthode à votre étude.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

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C. elegans Chemotaxis Assay

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Récepteur dimagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum /em (Vidéo) | JoVE Journal

Récepteur d'imagerie couplés aux protéines G (RCPG) à médiation événements de signalisation qui contrôle chimiotactisme des Dictyostelium discoideum

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