Suivi des déformations des tissus morphogénétiques dans l'embryon de poulet Early

L'objectif général des techniques présentées ici est de marquer et de cultiver des tissus embryonnaires afin de mesurer les déformations morphogénétiques durant le développement précoce. Pour la culture de l'embryon de poulet précoce, commencez par extraire l'embryon de l'œuf à l'aide d'une méthode utilisant un support en papier filtre. Selon l'application expérimentale, marquez l'embryon extrait à l'aide de colorants lipophiles fluorescents délivrés par des particules de fer magnétiques ou par des microbilles de polystyrène. Ensuite, suivez les marquages durant la culture à l'aide de microscopie à fluorescence ou d'imagerie par tomographie par cohérence optique.

Les cartes de déformation morphogénétique issues de l'imagerie indiquent des régions d'allongement, de raccourcissement et de cisaillement tissulaires, en deux comme en trois dimensions. Bonjour, je m'appelle Ben Philis et je suis étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr Larry Tabor, du Département de génie biomédical de l'Université de Washington à St. Louis. Avant de commencer ce type d'expériences, il est important de prendre en compte les techniques de culture tissulaire pertinentes pour votre système modèle, les modalités d'imagerie auxquelles vous pourriez avoir accès, ainsi que le type de données que vous souhaitez obtenir de vos expériences.

Par exemple, êtes-vous intéressé par l'analyse des déformations tissulaires en deux ou trois dimensions ? Nous abordons certaines de ces questions ici aujourd'hui en présentant deux techniques d'étiquetage complémentaires dans l'embryon de poulet précoce. Bonjour, je m'appelle Victor Varner, et je travaille dans le laboratoire du Dr Larry Tabor à l'Université de Washington à St. Louis.

Dans ces deux techniques, nous marquons rapidement et simultanément des centaines de cellules dans l'embryon précoce de poulet. Le suivi du mouvement de ces marqueurs nous permet alors non seulement de déterminer les tissus dans lesquels ces cellules finissent par s'implanter, mais aussi de quantifier les déformations au niveau tissulaire qui façonnent l'embryon précoce. Incubez d'abord les œufs en orientation longitudinale jusqu'au stade souhaité, tel que défini par Hamburger et Hamilton.

Cassez le fond de l'œuf contre le bord d'une boîte de Pétri de 150 millimètres. Ouvrez la coquille par le bas, videz le contenu de l'œuf dans la boîte et, à l'aide de pinces contondantes, retirez l'albumen plus épais et visqueux du jaune. Percez maintenant des trous au centre d'un papier filtre circulaire.

Placer l'un des anneaux en papier filtre sur le jaune d'œuf de manière à ce que l'embryon soit visible à travers le trou central de l'anneau. Tailler autour du périmètre extérieur de l'anneau en papier filtre à l'aide de ciseaux microchirurgicaux. Puis retirer le papier avec l'embryon attaché du jaune d'œuf à l'aide de pinces fines et faire tremper délicatement l'embryon dans un bain de PBS. Pour éliminer les particules de jaune adhérentes, transférer l'ensemble en papier filtre dans une boîte de culture de 35 millimètres.

En le plaçant côté ventral vers le haut, transférez l'embryon à l'aide d'un deuxième anneau de papier filtre. Fixez-le avec un anneau métallique et immergez l'embryon dans le milieu de culture. Si l'embryon n'est pas complètement immergé, la géométrie tissulaire et la morphogenèse ultérieure peuvent être fortement altérées par des contraintes anormalement élevées de tension superficielle.

Pendant la culture, utilisez un microscope en champ clair pour vérifier la morphologie correcte et le stade embryonnaire. Commencez par prélever une petite quantité de poudre de fer, ajoutez quelques gouttes de colorant saturé et d'alcool, puis faites sécher à l'air à l'aide de l'extrémité d'une micro-pipette étirée. Dispersez les particules de fer agglomérées et transférez-les dans un tube de microcentrifugeuse.

Après plusieurs rinçages effectués en position recouverte d'eau ionisée, placer l'embryon récolté, côté dorsal vers le haut, dans une boîte de culture de 35 millimètres recouverte d'une couche généreuse de milieu de culture. Sous un microscope stéréoscopique, utiliser l'aiguille en verre pour retirer la membrane vitelline et exposer les cellules ectodermiques. Aspirer ensuite une colonne de particules de fer marquées dans une micropipette.

À l’aide du microscope stéréoscopique, plongez la pipette juste au-dessus de l’embryon. Faites rouler lentement la pipette d’avant en arrière entre les doigts pour répandre les particules sur l’embryon. Après une incubation de 10 minutes à 37 degrés Celsius, retirez les particules à l’aide d’un aimant puissant.

Si nécessaire, fixez l'aimant à une paire de pinces fines magnétiques et utilisez les pinces aimantées pour retirer soigneusement les particules de fer résiduelles. Procédez ensuite à l'acquisition d'images en champ clair et en fluorescence de l'embryon. À l'aide d'une aiguille de calibre 22.

Aspirez une solution de microbilles noires de 10 micromètres de diamètre dans du PBS dans une seringue de 10 cc. Ensuite, affinez les extrémités des aiguilles en verre tirées à l’aide d’un disque dur d’ordinateur et remplissez-les avec la solution de billes. Tapez légèrement sur la micropipette afin que la solution atteigne l’extrémité, à l’aide d’un micromanipulateur.

Placer l'aiguille en verre dans le même champ de vision que l'embryon. Vérifier l'écoulement des billes à l'extrémité de la pipette. Insérer maintenant l'extrémité de la pipette dans la lumière du tube neural.

Veiller à ne pas percer le plancher ventral du tissu. Observer le gonflement transitoire du tissu lorsque les billes et le liquide pénètrent dans la lumière. Retirer ensuite rapidement l'aiguille en verre.

Enfin, vérifiez une densité suffisante de billes dans la lumière interne du tube cérébral. À l’aide d’un microscope en champ clair, laissez les billes se déposer pendant 20 à 30 minutes avant d’acquérir des images en champ clair ou un jeu de données de tomographie par cohérence optique. Après avoir acquis les premières images, placez jusqu’à 7 boîtes de culture de 35 millimètres contenant les échantillons dans une boîte de Petri de 150 millimètres, puis mettez l’ensemble dans un petit sac en plastique.

Ajoutez des gouttes d'eau déionisée dans le sac pour l'humidification, puis remplissez le sac avec un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Placez les embryons dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu'au prochain point temporel d'imagerie ; placez ensuite les embryons marqués dans une boîte Delta T contenant 1,2 millilitre de milieu de culture et couvrez la boîte avec un couvercle en verre maintenu à 37 degrés Celsius. Superfusez l'embryon avec un mélange gazeux de 95 % O₂ et 5 % CO₂ fourni par un dispositif de pompe miniaturisé à débit variable. Configurez maintenant le logiciel pour acquérir automatiquement des images aux intervalles de temps souhaités.

Au cours de l'expérience, les étiquettes peuvent être suivies automatiquement ou manuellement, et des cartes de déformation morphogénétique peuvent être calculées pour les coordonnées des marqueurs. Ici, la technique des particules de fer a été utilisée pour marquer et suivre le mouvement des cellules électrodermiques durant la formation du bourrelet céphalique. Chez l'embryon de poulet précoce, des cellules marquées de façon fluorescente étaient réparties sur l'ensemble de l'embryon.

Des images en champ clair et en fluorescence de l'embryon ont été capturées à différents intervalles pendant la culture ex ovo. Pour surveiller les mouvements des marqueurs du tractus. Les données cumulatives permettent de calculer les distributions évolutives des contraintes morphogénétiques durant la formation du bourrelet céphalique.

De même, la technique des microsphères en polystyrène a été utilisée pour suivre les mouvements tissulaires à la limite médiane du métencéphale dans le cerveau précoce du poulet. Notez que cette méthode permet de prendre en compte des déformations nettement tridimensionnelles, car les billes ont tendance à adhérer à toutes les faces de la lumière interne du cerveau. Après suivi du mouvement des billes pendant six heures, les coordonnées des marqueurs permettent de calculer les déformations, caractérisant ainsi la déformation tissulaire dans les directions longitudinale et circonférentielle.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée des étapes expérimentales nécessaires pour mettre en œuvre votre propre culture tissulaire et marquage. Les techniques de protocole présentées ici présentent l'avantage d'être peu invasives pour les tissus natifs et d'impliquer des matériaux peu coûteux et facilement accessibles. Ces expériences sont particulièrement utiles pour les études sur la mécanique du développement embryonnaire.

Étant donné que les champs de déformation calculés à partir du mouvement suivi de cellules marquées peuvent servir à tester et à élaborer des modèles physiques de la morphogenèse.