Name: Une PCR pour lidentification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Apprenez une méthode de PCR multiplex pour identifier rapidement les sérovars Salmonella enterica (Enteritidis, Hadar, Heidelberg, Typhimurium) par allélotypage. Cette technique améliore la détection des pathogènes.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;USDA 1999-35212-8680 subventions, de 2005 à 01378, et 2010-04288-01, USDA fonds à formule et l&#39;État de Géorgie Subvention de recherche en médecine vétérinaire agricole. Le protocole décrit dans la présente publication a été développé pour une utilisation par les étudiants dans le cadre de cours de recherche dirigée: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L et 4960H BIOL à l&#39;Université de Géorgie et utilisés par les étudiants sur plusieurs projets de recherche en épidémiologie moléculaire dans l&#39;Maurer laboratoire. Nous tenons à remercier les nombreux étudiants de premier cycle qui ont effectué des recherches dans les laboratoires de Maurer et Lee, et notre chef de département, John Glisson pour soutenir nos efforts pour intégrer l&#39;enseignement de premier cycle à la recherche.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plupart disponibles dans le commerce des tests PCR pour la détection de gènes cibles Salmonella unique pour le genre (ex. invA). Cependant, tous les salmonelles sont égaux dans leur capacité à causer la maladie chez l&#39;homme ou de la prévalence dans les populations animales. La reconnaissance précoce des différences antigéniques de Salmonella LPS O-antigène et flagellinH1 et les antigènes H2 a conduit à la différenciation de Salmonella dans plus de 2500 sérovars en fonction de ces différences antigéniques. Il ya 46 différents antigènes O et 86 distinctes flagelline (H) des antigènes identifiés dans le genre Salmonella. Salmonella peuvent posséder un (H1) ou de deux différentes (H1 et H2) flagellines. La combinaison différente de O, H1 et H2 antigènes compte des sérotypes de Salmonella les 2500 aujourd&#39;hui reconnu. Un sérovar est attribué selon la formule antigénique dérivée de l&#39;identification de l&#39;individu antigènes O et H. La formule antigénique est écrit comme O: H1: H2, et où &quot;-&quot;, se réfère à l&#39;absence de H1 ou H2 flagelline et «NT» (non typables) pour Salmonella négatives pour l&#39;antigène O. Par exemple, le sérovar Typhimurium est attribué à un S. enterica isoler avec la formule antigénique B: i: 1,2 alors que Enteritidis est donnée à un isolat avec la D1 la formule: g, m: -. Cette variation antigénique dans la population de Salmonella est la manifestation extérieure de différences au niveau des nucléotides qui peuvent donc être facilement exploitée par PCR. Nous avons identifié les différences génétiques associés à des allèles O et H pour développer une PCR allélotypage pour identifier S. sérovars enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium (3). L&#39;attribution correcte et les rapports de Salmonella sérotype nécessite des tests pour tous les allèles associés à O: H1: formules antigéniques H2 pour Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), et Typhimurium (B: i: 1,2). Sans la connaissance de l&#39;allèle O ou antigène, la conclusion de la g H1, allèle m ne suffit pas nécessairement identifier les salmonelles isolat comme Enteritidis que d&#39;autres sérotypes de Salmonella les: Agona, en Californie, et à Montevideo, possèdent également cette même allèle. Alors que la PCR allélotypage a été initialement conçu pour détecter l&#39;avant mentionnés sérovars de Salmonella, ce test peut identifier 19 autres sérovars (tableau 3). Notre allélotypage PCR a été initialement conçu pour détecter les allèles O et H. En pratique, il est devenu plus pratique et rentable pour nous d&#39;identifier les O-antigène par agglutination sur lame, en utilisant O antisérum spécifique, plutôt que d&#39;effectuer l&#39;O allélotypage PCR lorsque l&#39;on travaille avec des cultures de Salmonella isolés. Cependant, nous ne recommandons d&#39;utiliser l&#39;O allélotypage PCR si votre laboratoire utilise cette PCR comme un écran (2) ou pour le typage des isolats de Salmonella soumis le FTA cartes (6), et comprennent une PCR Salmonella spécifique avec le premier écran d&#39;échantillons (4 ). Limiter le PCR allélotypage aux seuls échantillons qui sont identifiées comme Salmonella par PCR ou tests biochimiques / antigénique. Le protocole décrit dans cet article a été optimisé pour une utilisation avec le Rapidcycler Idaho Technology, un thermocycleur à air chaud qui permet de réduire les volumes de réaction et les conditions de réaction fonctionne en moins de temps que de nombreux thermocycleurs bloc de chauffage. Pour adapter ce protocole pour l&#39;utilisation avec un thermocycleur bloc chauffant peut exiger l&#39;optimisation des conditions de réaction empiriquement par l&#39;abaissement / élévation des températures de recuit; ajustant concentrations d&#39;amorces, ou ajuster les concentrations de MgCl 2. Par exemple, nous avons dû adapter le protocole pour le MJ Research PTC-200 thermocycleur comme suit. Travailler avec les volumes réaction décrite dans le tableau 1, le stock de travail concentrationof l&#39;ensemble d&#39;amorces i a été dilué à 2,5 uM, la température de recuit a été abaissé de 55 ° C à 45 ° C, temps d&#39;incubation et à la dénaturation, d&#39;hybridation et l&#39;extension des mesures a été allongée à 20 s pour la PCR i / g, m allélotypage. Ayant les contrôles positifs et négatifs appropriés sont essentiels dans le démarrage initial et d&#39;optimisation pour les PCR, y compris les protocoles publiés. Nous recommandons l&#39;acquisition de sérotypes de Salmonella les connus, spécifiquement anatum (E1: E, H: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) et Typhimurium (B: i: 1,2) et un laboratoire d&#39;Escherichia coli K12 (DH5a, LE393, JM109, etc ) comme contrôles positifs et négatifs, respectivement pour les tests de PCR allélotypage décrit dans cet article. Plusieurs de ces sérotypes de Salmonella les servira comme contrôles positifs ou négatifs, selon le allèle est testé. Certaines précautions et les directives doivent être suivies tout en effectuant ceci et tout autre diagnostic par PCR. Tout d&#39;abord, la séparation physiquede la préparation de modèles, PCR set-up, et électrophorèse sur gel est essentiel dans la prévention de possibles PCR report de contamination et de rapports erronés de faux positifs. En outre, l&#39;inclusion de contrôles appropriés sont nécessaires dans toute routine PCR comme ces contrôles d&#39;identifier les problèmes à mesure qu&#39;ils surviennent et d&#39;aider à l&#39;interprétation des résultats (5). Surtout, la cohérence est essentielle, notamment en ce qui concerne les conditions d&#39;électrophorèse pour les andestimation amplicon détection (produit PCR) de taille de l&#39;amplicon. Pour illustrer ce point, nous avons délibérément suspendu électrophorèse plus tôt que prévu à la figure 1A. Les standards de poids moléculaire (voies 1 et 13) et le contrôle positif (piste 2) ne sont pas suffisamment séparés pour estimer avec précision tailles ou d&#39;observer la séparation de fragments d&#39;ADN où il ya des petites différences (~ 50 pb) dans les tailles. Une séparation adéquate des fragments d&#39;ADN, en particulier les normes de poids moléculaire, est essentiel que les rapports positifs dépend de l&#39;estimation précise de la taille amplicon et de distinguer «vrai positif» de la non-spécifiques amplicons qui sont parfois observés dans le fonctionnement quotidien de toute la PCR (5 ). Par exemple, il ya un amplicon non spécifiques à la figure 1B, piste 7 (~ 700 pb de taille). Avaient été abandonnées par électrophorèse trop tôt, quand le front de colorant a été seulement au point à mi-chemin dans le gel d&#39;agarose, il y aurait peu de différenciation entre 500 pb et 700 pb des fragments d&#39;ADN. Par conséquent, l&#39;échantillon dans le couloir 7 aurait été indiqué à tort comme positive pour les deux i et g, m allèles. Enfin, on doit reconnaître les limites associées à toute épreuve. Plusieurs des PCR H1/H2 allélotypage n&#39;ont pas le pouvoir de discrimination subtile à discerner des différences génétiques dans allèles appartenant à l&#39;H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexe antigène; e, n, x / e , n, Z15 complexe antigène et le complexe antigène G H1, qui comprend le g, m allèle. Un ou deux changements d&#39;acides aminés représentent les épitopes différents présents dans ces antigènes flagellaires. Il était donc difficile pour nous de concevoir des amorces qui pourraient exploiter ces différences, parfois seule paire de base dans la séquence du gène flagelline (3). Par exemple, Salmonella sérovars Dublin (D1: g, p: -) et Berta (D1: f, g, t: -) sont également positifs par PCR avec nos g, mallelotyping amorces. Les amorces H2 allélotypage ne peut pas distinguer Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), ou Remo (B: r: 1,7), ou Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: E, N, Z15). Alors que la probabilité de rencontrer certains de ces sérotypes: Lagos, Bradford, Winneba, Remo ou Glustrup est distant, c&#39;est une possibilité et nécessite soit en fournissant disclaimer sur la limitation des essais »ou un autre test de confirmation. En conclusion, cette sérotypage basé sur la PCR identifie rapidement S. enterica sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium, et O, H1, H2 et allèles associés à 19 sérovars supplémentaires. Ce dosage est rapide, efficace alternative à l&#39;approche microbiologique traditionnelle à Salmonella sérotype.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du produit </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaire </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Tubes Microfuge </td><td> 1,5 ml de capacité </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> 200 la preuve </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Année de biologie moléculaire </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable; PCR uniquement) </td></tr><tr><td> 10 x tampon PCR: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Tampon est livré avec la BSA, Ficoll et tartrazine) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des amorces de PCR </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Taq ADN polymérase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Pipettes capillaires </td><td> Volume de 10 ul </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rapide Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Faible TEE; année de biologie moléculaire </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> 50 X tampon TAE ou TBE 5X Buffer </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Horizontale, la chambre submersible électrophorèse sur gel avec de la moisissure sur gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc système </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Matériaux

une pcr pour l&#39;identification allélotypage salmonella enterica sérovars enteritidis, hadar, heidelberg et typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Commerciale actuelle des tests PCR pour identifier les gènes cibles Salmonella unique de ce genre. Cependant, il ya deux espèces, six sous-espèces, et plus de 2500 sérotypes de Salmonella les différents, et tous ne sont pas égaux dans leur signification pour la santé publique. Par exemple, trouver S. enterica sous-espèce de l&#39;Arizona IIIa sur une ferme couche de table de l&#39;œuf est insignifiant comparé à l&#39;isolement de S. enterica sérotype Enteritidis, je sous-espèces, la principale cause de salmonellose liée à la consommation d&#39;œufs de table. Sérovars sont identifiés sur la base des différences antigéniques des lipopolysaccharides (LPS) (antigène O) et la flagelline (H1 et H2 antigènes). Ces différences antigéniques sont l&#39;aspect extérieur de la diversité des gènes et allèles du gène associé à ce phénotype. Nous avons développé une allélotypage, la PCR multiplex que les touches sur les différences génétiques entre les quatre principaux S. enterica sous-espèce de sérovars j&#39;ai trouvé dans la volaille et associés aux maladies humaines importantes aux États-Unis. Les paires d&#39;amorces de PCR ont été ciblées pour les principaux gènes ou des séquences uniques d&#39;un sérotype de Salmonella spécifique et destinée à produire un amplicon avec la taille spécifique pour ce gène ou allèle. Salmonella sérovar est attribué à un isolat basée sur la combinaison des résultats des tests PCR pour LPS spécifiques et allèles du gène flagelline. La PCR multiplex décrit dans cet article sont spécifiques pour la détection de S. enterica sous-espèce, je sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium. Ici, nous montrent comment utiliser les PCR multiplex pour identifier sérovar Salmonella pour un isolé.

Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l&#39;antigène O et la flagelline d&#39;un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l&#39;apparence des amplicons spécifiques de taille, (produit de PCR) correspondant à l&#39;allèle cible.

Une PCR pour l&#39;identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

Les tests PCR commerciaux actuels pour l'identification de Salmonella ciblent des gènes propres à ce genre. Cependant, il existe deux espèces, six sous-espèces et plus de...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier des allèles spécifiques d'antigènes de salmonelle. Cela est réalisé en ciblant une PCR afin de détecter des différences de séquence spécifiques associées à ces allèles. Un échantillon matrice est ajouté à un mélange de réaction PCR contenant des amorces spécifiques aux allèles et le typage des allèles OH1 et H2.Les PCR sont effectuées dans le thermocycleur. Ensuite, les échantillons de PCR sont séparés par taille à l'aide d'une électrophorèse sur gel afin de déterminer la taille de l'amplicon, s'il est présent pour chaque échantillon ou isolat. La taille de l'amplicon est ensuite comparée à la taille attendue pour chacun des jeux d'amorces utilisés, et les résultats de PCR obtenus permettent d'identifier un antigène spécifique de Salmonella.Les allèles par PCR, la désignation de sérovar est ensuite attribuée en fonction des résultats des tests PCR multiplex OH un et H deux. Le principal avantage du protocole décrit dans cette vidéo par rapport à SYP est qu'il est plus rapide, plus facile à interpréter et moins coûteux. Cette méthode peut aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine de l'épidémiologie, telles que la détermination de la distribution et de la persistance des souches de Salmonella dans ou entre des élevages avicoles ou laitiers.L'application de cette technique s'étend au diagnostic rapide de la salmonellose attribuée à Salmonella, aux sérovars, à Arius ou à Urian. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour comprendre comment utiliser cette technique basée sur la PCR afin de typer Salmonella au niveau du sérovar. Cette procédure sera démontrée par Adriana Pedroso et Yin Chang, chercheuses scientifiques au sein des laboratoires Lee Mauer à l'Université de Géorgie, pour préparer un modèle d'ADN à partir de cellules entières destiné à la réaction de PCR ultérieure.Primo, ensemencer un millilitre de bouillon LB avec Salmonella. Isoler à partir d'une colonie unique. Incuber la culture sous agitation à 200 à 250 tours par minute et à une température d'incubation de 37 degrés Celsius.Le lendemain, transférez la culture d'un millilitre dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et centrifugez la suspension pendant environ deux minutes à 4 500 ×g pour former un culot cellulaire. Aspirez ensuite le surnageant et resuspendez le culot bactérien dans un millilitre d'éthanol à 100 %. Incubez les cellules en suspension dans l'éthanol à température ambiante pendant 10 minutes, puis centrifugez les cellules comme précédemment. Resuspendez le culot dans un millilitre de PBS. Après la centrifugation, aspirez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre d'eau distillée stérile. Enfin, diluez la suspension cellulaire.Un sur 20 avec de l'eau distillée et conserver à moins 20 degrés Celsius pendant un mois maximum, jusqu'à ce que la préparation et la distribution du mélange de réaction PCR soient prêtes à être effectuées dans une pièce physiquement séparée et de préférence dans une station PCR dédiée équipée d'une lumière UV. Tout d'abord, décontaminer la surface de travail à l'aide de la lumière UV et en essuyant avec une solution d'eau de Javel à 10 %. Ensuite, à l'aide d'une pipette désignée exclusivement pour les travaux de PCR et équipée d'une pointe de pipette avec barrière.Préparez un stock maître d'amorces en diluant d'abord les amorces à cinq fois dix puissance moins quatre molaire avec de l'eau distillée. Ensuite, diluez ce stock au 1/20 avec de l'eau distillée afin d'obtenir une concentration de travail de 25 micromolaire. Récupérez les réactifs de PCR et le témoin cellulaire complet depuis le congélateur et décongelez-les sur de la glace.Laissez la polymérase ADN tac dans le congélateur jusqu'à ce qu'elle soit nécessaire. Mélangez les réactifs de PCR selon le tableau un du protocole écrit. Ensuite, pipetez neuf microlitres de la réaction de PCR.Mélanger dans les puits d'une plaque microtitration en polystyrène stérile de 96 puits, à fond rond. Commencer en haut de la première colonne, descendre la colonne, puis passer au haut de la colonne suivante. Ajouter un microlitre d'eau distillée dans le premier puit pour servir de contrôle négatif. Ensuite, distribuer 0,5 microlitre des gabarits de contrôle positif dans le mélange de PCR du deuxième puit et un microlitre d’E. coli K-12 DH5α dans le troisième.Ajoutez un microlitre du modèle du troisième échantillon dans les puits restants pour la PCR H1I et gyp Salmonella enterica ; CVaR, TYM et Enteritis serviront de témoins positifs pour les allèles i et GM respectivement. Salmonella CVaR, Heidelberg et Haar sont les témoins positifs qui seront utilisés dans la seconde PCR de typage de l'allèle H1 pour la détection des allèles r et z10 respectivement. Ensuite, insérez des capillaires en verre de capacité 10 microlitres dans les supports désignés pour la technologie Idaho.Une fois le cycler rapide fixé dans le support, chargez chaque capillaire en verre avec le mélange de réaction PCR en posant les capillaires au fond des puits. Inclinez le support pour permettre au liquide de descendre dans le tube et créer un espace entre les extrémités et le mélange PCR. Avant de sceller thermiquement les tubes en verre à l’aide d’un chalumeau au butane afin de fermer les deux extrémités des capillaires, placez les tubes capillaires et le support dans le cycler rapide Idaho Technology et utilisez les programmes du thermocycleur décrits dans le tableau 1 du protocole écrit pour les différents types ELO total en PCR.Une fois le programme du thermocycleur terminé, passez à l'étape d'électrophorèse sur gel pour un gel de 15 sur 10 centimètres, au 1,5 % de grade biologie moléculaire contenant du bromure d'éthidium, conformément aux procédures standard. Une fois le gel solidifié, transférez-le dans une chambre d'électrophorèse horizontale immergée contenant du tampon d'électrophorèse TAE 1× préparé avec 200 microlitres de 0,25 milligramme par millilitre.Des marqueurs de poids moléculaire de l'ADN avec une charge de 40 microlitres de colorant de charge six fois l'ADN, 4,8 microlitres du marqueur de poids moléculaire de l'ADN prémélangé dans les puits central, premier et dernier. Ensuite, retirez une capillaire en verre contenant une réaction d'échantillon PCR du support et égratignez les deux extrémités de la capillaire avec un coupe-verre. Puis placez le pouce et l'index des deux mains de chaque côté de la capillaire marquée par le coupe-verre et cassez la capillaire. Placez le distributeur de capillaire à l'extrémité opposée du mélange de réaction PCR et tournez lentement le piston dans le sens horaire jusqu'à ce que le liquide soit tout en bas du tube.Placez le capillaire dans le puits à charger et tournez lentement le piston dans le sens horaire pour délivrer l'échantillon pondéré dans le gel. Veillez à ne pas percer le puits avec le capillaire ni introduire de bulle d'air dans le puits en continuant de tourner le piston après que la dernière goutte de liquide ait quitté le capillaire. Une fois tous les échantillons et étalons chargés, réglez la tension constante de l'alimentation électrique sur 90 volts.Une fois l'électrophorèse terminée, transférez le gel sur un transilluminateur UV afin de visualiser les fragments d'ADN et les standards de poids moléculaire, puis capturez les images à l'aide d'un système gel dock XR. Enfin, placez les supports de capillaires dans une solution d'eau de Javel à 10 % pendant 15 à 30 minutes. Rincez-les trois fois avec de l'eau distillée, puis replacez-les dans la salle de préparation de PCR pour les laisser sécher à l'air.Ce premier gel coloré au bromure d'athérium montre les résultats d'une PCR multiplex pour l'allèle O associé à Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg.Antifa. Les pistes une et 13 contiennent un marqueur d'ADN de 100 paires de bases.La bande deux contient les contrôles de PCR multiplex pour les allèles O B, C un, C deux, D un et E. Les bandes restantes, de trois à douze, contiennent des isolats de salmonelle. Une désignation d'allèle est attribuée à chaque isolat de salmonelle en fonction de la correspondance de la taille de l'amplicon avec celle du contrôle de PCR et selon les prévisions des jeux d'amorces alléliques utilisés, de gauche à droite. Ces tailles d'amplicons sont les suivantes : D 1 620 paires de bases, C deux 400 paires de bases, E 1 280 paires de bases, C un 340 paires de bases et B 560 paires de bases.Ce gel coloré au bromure d'iridium montre les résultats d'une PCR multiplex d'allèle H un pour l'identification du gel FLA dans les allèles œil et gm. Le gel a été chargé dans le même ordre que précédemment indiqué. Là encore, un allèle H un est attribué à chaque isolat en fonction de la présence d'un amplicon correspondant en taille au témoin de PCR et tel que prédit pour les quatre jeux d'amorces d'allèle H un utilisés de gauche à droite.Les tailles des amplicons sont de 310 paires de bases pour GM et de 510 paires de bases pour I. Ce gel coloré au bromure d'éthidium spinal montre les résultats d'une PCR multiplex pour l'allèle H1 permettant d'identifier les allèles gellin r et z10. Là encore, le gel a été chargé de la même manière que précédemment indiqué, et un allèle H1 est attribué à chaque isolat en fonction de la présence d'un amplicon dont la taille correspond à celle du témoin de PCR. Comme prévu pour les quatre jeux d'amorces utilisés pour l'allèle H1, les tailles des amplicons sont de 170 paires de bases pour R et de 360 paires de bases pour Z10. Une fois maîtrisé.Cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est correctement effectuée. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à séparer physiquement la préparation du modèle, la mise en place de la PCR et l'électrophorèse sur gel afin de minimiser le risque de contamination par report de PCR.

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Une analyse qPCR est développé pour la détection de Escherichia coli O157: H7 de cibler un marqueur génétique unique, Z3276. La qPCR a été combiné avec propidium monoazide (PMA) de traitement pour la détection de cellules vivantes. Ce protocole a été modifié et adapté à un format de plaque à 96 puits pour une manipulation aisée et uniforme de nombreux échantillons...

Détection de Live<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 par les cellules PMA-qPCR

Ce manuscrit décrit un essai PCR duplex numérique qui peut être utilisé pour quantifier simultanément Enterococcus spp. , Et les marqueurs génétiques HF183 comme indicateurs de contamination fécale générale et humaine associée dans les eaux récréatives.

Un test PCR Duplex numérique pour simultanée Quantification de la<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Et le HF183 marqueur humain Fecal associé dans les eaux

Salmonella spp /Shigella spp sont pathogènes courants attribués à la diarrhée. Ici, nous décrivons une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp., à l’aide de la PCR en temps réel combinée avec la culture guidée.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Nous présentons ici un protocole pour préparer des échantillons d’ADN provenant des aliments et environnement microbiomes détection concertée et sous-typage des Salmonella par séquençage de quasimetagenomic. L’utilisation combinée de l’enrichissement de la culture, séparation immunomagnétique (IMS) et le déplacement de plusieurs amplification (MDA) permet une concentration efficace de l’ADN génomique de Salmonella provenant des aliments et les échantillons environnementaux.

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

L'analyse multilocus à répétition en tandem (MLVA) présentée ici permet un génotypage à haute résolution peu coûteux, robuste et portable de la bactérie poisson-pathogène Yersinia ruckeri. Partant de cultures pures, l'essai utilise le multiplex PCR et l'électrophoresis capillaire pour produire des profils MLVA à dix loci pour des applications en aval.

Multi-locus Nombre variable Tandem-répétition Analyse du Bacterium Yersinia ruckeri par Multiplex PCR et Capillary Electrophoresis

Cette approche moléculaire pour déterminer la forme physique bactérienne facilite la détection précise et précise des micro-organismes à l'aide de codes-barres d'ADN génomique uniques qui sont quantifiés par l'intermédiaire du PCR numérique. Le protocole décrit le calcul de  l'indice concurrentiel des souches de Salmonella; cependant, la technologie est facilement adaptable aux protocoles exigeant la quantification absolue de n'importe quel organisme génétiquement malléable.

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

L’amplification isothermale à base de boucle (LAMP) est un test isothermal d’amplification de l’acide nucléique (iNAAT) qui a suscité un grand intérêt dans le domaine de la détection des pathogènes. Ici, nous présentons un protocole Salmonella LAMP validé en laboratoire comme une méthode rapide, fiable et robuste pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de salmonella présumée de l’isolement culturel.

Amplification isothermale à médiatographie en boucle pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de Salmonella de l’isolement culturel

Cet article présente une série de méthodes consécutives pour l’expression et la purification de Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp ce protocole un système rapide pour purifier le complexe protéique en une journée. Les méthodes couvertes sont la mutagénèse dirigée par site, l’expression des protéines chez Escherichia coli,la chromatographie d’affinité, la chromatographie par filtration sur gel et la cristallisation.

Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

La faisabilité de stratégies de séquençage du génome entier (SGE) à l’aide d’instruments de paillasse a simplifié l’interrogation du génome de chaque microbe pertinent pour la santé publique en laboratoire. Une adaptation méthodologique du flux de travail pour le séquençage bactérien est décrite et un pipeline bioinformatique pour l’analyse est également présenté.

Caractérisation d’une souche pathogène d’Escherichia coli dérivée d’Oreochromis spp. Fermes utilisant le séquençage du génome entier

Apprenez une méthode de PCR multiplex pour identifier rapidement les sérovars Salmonella enterica (Enteritidis, Hadar, Heidelberg, Typhimurium) par allélotypage. Cette technique améliore la détection des pathogènes.

Une PCR pour l'identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

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