Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

L’objectif général de l’expérience suivante est de quantifier le réapprovisionnement et la mobilisation des pools de vésicules synaptiques spécifiques dans les terminaisons nerveuses centrales à l’aide de techniques d’imagerie par fluorescence en direct. Ceci est réalisé en surveillant deux cycles de recyclage des vésicules synaptiques, en utilisant des colorants FM dans les mêmes terminaisons nerveuses pour fournir des contrôles internes valides. Dans un deuxième temps, le pool facilement libérable et le pool de réserve sont appauvris séquentiellement à l’aide de protocoles de déchargement spécifiques, qui permettent de quantifier les tailles relatives des pools.

Ensuite, modifiez les conditions de charge ou de décharge afin d’étudier l’effet de la variation choisie sur la vésicule synaptique, le réapprovisionnement du bassin ou la mobilisation. Les résultats montrent que la charge FM d de différents pools physiques synaptiques est reproductible sur la base de la quantification et de l’analyse de la décharge du colorant évoqué. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la famille fluente des rapporteurs génétiques, est qu’elle suit la reconstitution des pools spécifiquement par les vésicules synaptiques, qui ont subi une endocytose.

Il permet également une quantification précise. Étant donné que ce protocole est effectué deux fois dans les mêmes terminaisons nerveuses, fournissant un contrôle interne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des synaptiques, des CLE, de l’endocytose et de l’exocytose, telles que la façon dont la manipulation dans des modes d’endocytose spécifiques peut affecter la reconstitution à la fois du pool de recyclage total et des pools CLE synaptiques qu’il contient, tels que le pool facilement réutilisable et le pool de réserve.

Le dispositif expérimental de base doit comprendre un microscope à épifluorescence inversée, une caméra CCD refroidie, une source de lumière fluorescente, un appareil de perfusion par gravité, une chambre d’imagerie avec des électrodes de platine parallèles et un stimulateur électrique et un ordinateur. Effectuez les expériences dans l’obscurité ou sous une lumière rouge avec un éclairage fluorescent minimal de l’échantillon pour éviter le blanchiment par colorant FM. Commencez cette procédure en utilisant des petits rats spra dolly âgés de sept jours pour préparer les cultures primaires de neurones granulaires cérébelleux.

Une fois les cultures préparées, plaquez les neurones au centre d’une lamelle de 25 millimètres recouverte de poly D lysine en une gouttelette, ne dépassant pas sept millimètres de diamètre après une heure, ajoutez deux millilitres de milieu de culture aux neurones après sept jours. Placez une seule lamelle dans la solution saline à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre la stabilisation dans le nouveau milieu. Après cela, retirez la lamelle, séchez son dessous et la zone entourant les cellules attachées avec un petit morceau d’essuie-tout ou de papier absorbant.

Ensuite, utilisez la graisse silicone pour coller la lamelle au fond de la chambre d’imagerie. Les cellules doivent se trouver entre les deux fils parallèles. Utilisez suffisamment de graisse silicone pour sceller complètement la chambre sans empiéter sur le centre de la chambre de bain.

Ensuite, remplissez doucement la chambre du bain avec environ 260 microlitres de solution saline. Remplissez ensuite les tubes d’entrée et de sortie avec la même solution. Scellez la chambre en collant une lamelle propre avec de la graisse silicone sur le dessus.

Après cela, retirez toutes les bulles d’air emprisonnées dans la chambre avec les tubes d’entrée et de sortie. Ensuite, immobilisez la chambre d’imagerie dans une plate-forme en acier inoxydable. Vérifiez s’il y a des fuites en faisant circuler doucement une solution saline à travers le tube d’entrée.

L’étape suivante consiste à monter la chambre assemblée sur la platine d’un microscope inversé. Amorcez l’entrée du système de perfusion par gravité avec une solution saline et connectez la chambre à l’entrée. Fixez ensuite les fils de connexion de la chambre au stimulateur électrique.

Perfuser les neurones avec 1,5 millilitre de colorant fm dilué. Stimulez ensuite les neurones à l’aide du stimulateur attaché pour évoquer l’absorption de colorant Après la stimulation, perfuser les neurones avec une solution saline fraîche pendant deux minutes pour éliminer l’excès de colorant FM. Conservez ensuite les neurones dans la solution saline pendant huit minutes.

Pendant ce temps, localisez les réseaux axonaux où les terminaisons nerveuses chargées de FM D sont visibles. Utilisation des longueurs d’onde de la fluorescéine. Évitez les zones avec des amas de cellules.

Ensuite, remettez l’image au point immédiatement avant l’acquisition de l’image, car une légère dérive peut s’être produite pendant la période de repos. Lancez l’acquisition d’images en accéléré à raison d’une image toutes les quatre secondes. Après avoir acquis cinq à dix images de base, évoquez l’exocytose du pool facilement libérable en délivrant une stimulation de 30 hertz pendant deux secondes.

Après avoir acquis 10 autres images, évoquer la vésicule synaptique, l’exocytose du pool de réserve à l’aide de trois stimulations de 40 hertz pendant 10 secondes avec un intervalle de 40 secondes entre les stimulations, acquérir cinq à 10 autres images. Mettez ensuite en pause l’acquisition de l’image. Laissez les neurones récupérer pendant au moins 20 minutes, et répétez à nouveau ce protocole S monophasé en S deux phases pour l’expérience de contrôle.

Pour l’analyse des données, convertissez les images en pile. À l’aide d’une fonction intégrée d’image J, ajustez ensuite la luminosité et le contraste de la pile pour maximiser la plage dynamique si une dérive horizontale significative s’est produite. Pendant l’expérience, exécutez les plugins stack reg et turbo reg sur l’image J pour aligner la pile d’images.

Puis plugin d’analyseur de série d’exécution. Ensuite, définissez les régions d’intérêt sur au moins 90 terminaisons nerveuses. Il est utile de basculer entre les images avant et après le déchargement de la matrice pour révéler les terminaisons nerveuses actives.

La taille idéale d’une région d’intérêt est légèrement plus grande qu’une terminaison nerveuse typique. Obtenez ensuite l’intensité totale de fluorescence de chaque région d’intérêt au fil du temps. Après cela, exportez vers Microsoft Excel.

Voici un organigramme d’une expérience de contrôle où des neurones granulaires cérébelleux ont été chargés de 10 micromolaires FM 1 43 à l’aide d’une stimulation de 80 hertz en 10 secondes. Voici une image montrant des terminaisons nerveuses chargées de FM 1 43. Voici la même image montrant 90 régions d’intérêt numérotées sélectionnées pour l’analyse après l’identification des terminaisons nerveuses actives, et ce sont les images des terminaisons nerveuses à des points temporels sélectionnés.

Ces images sont présentées en pseudo couleur pour illustrer les changements de fluorescence à mesure que les différents bassins de vésicules synaptiques étaient épuisés. Enfin, on voit ici les unités fluorescentes normalisées de ces 90 terminaisons nerveuses. Dans les phases S un et S deux, la chute de fluorescence de chaque stimulation séquentielle peut être mesurée et comparée entre les phases S un et S deux.

Dans cette expérience de contrôle, S un et S deux ont donné les mêmes tailles de bassins facilement libérables et de réserve. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la reconstitution et la mobilisation de bassins de vésicules synaptiques spécifiques dans les terminaisons nerveuses centrales à l’aide de techniques d’imagerie par fluorescence de vie. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer la viabilité et la réactivité de la cellule en effectuant les expériences de contrôle S un avant de faire varier les conditions expérimentales S deux.