Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier le réapprovisionnement et la mobilisation des pools spécifiques de vésicules synaptiques dans les terminaisons nerveuses centrales à l'aide de techniques d'imagerie de fluorescence en temps réel. Cela est réalisé en surveillant deux cycles de recyclage des vésicules synaptiques, en utilisant des colorants FM sur les mêmes terminaisons nerveuses afin d'obtenir des contrôles internes valides. Dans un deuxième temps, le pool facilement libérable et le pool de réserve sont épuisés séquentiellement à l'aide de protocoles de déchargement spécifiques, ce qui permet de quantifier les tailles relatives des pools.

Ensuite, modifiez soit les conditions de chargement soit celles de déchargement afin d'étudier l'effet de la variation choisie sur le recyclage ou la mobilisation du pool de vésicules synaptiques. Les résultats montrent que le chargement par FM d des différents pools physiques synaptiques est reproductible, sur la base de la quantification et de l'analyse du déchargement évoqué du colorant. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la famille fluente des capteurs génétiques, est qu'elle suit spécifiquement le recyclage des pools par des vésicules synaptiques ayant subi une endocytose.

Il permet également une quantification précise. Étant donné que ce protocole est réalisé deux fois sur les mêmes terminaisons nerveuses, offrant ainsi un témoin interne. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la synapse, du CLE, de l'endocytose et de l'exocytose, telles que la manière dont la manipulation de modes spécifiques d'endocytose peut influencer le réapprovisionnement à la fois du pool de recyclage total et des pools synaptiques de CLE qu'il contient, comme le pool facilement réutilisable et le pool de réserve.

L'installation expérimentale de base doit comprendre un microscope à épifluorescence inversé, une caméra CCD refroidie, une source de lumière fluorescente, un dispositif de perfusion par gravité, une chambre d'imagerie équipée d'électrodes en platine parallèles et d'un stimulateur électrique, ainsi qu'un ordinateur. Réalisez les expériences à l'obscurité ou sous lumière rouge, en utilisant un éclairement fluorescent minimal pour éviter la décoloration des colorants FM. Commencez cette procédure en utilisant des rats nouveau-nés Spra Dolly âgés de sept jours pour préparer les cultures primaires de neurones granulaires cérébelleux.

Une fois les cultures préparées, ensemencez les neurones au centre d’un coverslip de 25 millimètres recouvert de poly-D-lysine en utilisant une gouttelette ne dépassant pas sept millimètres de diamètre. Après une heure, ajoutez deux millilitres de milieu de culture aux neurones au bout de sept jours. Placez un seul coverslip dans une solution saline à température ambiante pendant 10 minutes afin de permettre la stabilisation dans le nouveau milieu. Ensuite, retirez le coverslip, séchez sa face inférieure ainsi que la zone entourant les cellules fixées à l’aide d’un petit morceau de papier essuie-tout ou de papier absorbant.

Ensuite, utilisez la graisse de silicone pour coller la lame couvre-objet au fond de la chambre d'imagerie. Les cellules doivent se trouver entre les deux fils parallèles. Utilisez suffisamment de graisse de silicone pour sceller complètement la chambre sans empiéter sur le centre de la chambre du bain.

Ensuite, remplir délicatement la chambre du bain avec environ 260 microlitres de solution saline. Puis remplir les tubulures d'entrée et de sortie avec la même solution. Sceller la chambre en collant une lame de couverture propre avec de la graisse silicone sur le dessus.

Ensuite, éliminez toute bulle d'air piégée dans la chambre à l'aide des tubulures d'entrée et de sortie. Immobilisez ensuite la chambre d'imagerie sur une plateforme en acier inoxydable. Vérifiez les fuites en faisant circuler doucement une solution saline à travers la tubulure d'entrée.

L'étape suivante consiste à monter la chambre assemblée sur la platine d'un microscope inversé. Amorcez l'entrée du système de perfusion par gravité avec une solution saline et reliez la chambre à l'entrée. Ensuite, fixez les fils de connexion de la chambre au stimulateur électrique.

Perfuser les neurones avec 1,5 millilitre de colorant FM dilué. Ensuite, stimuler les neurones à l’aide du stimulateur attaché afin d’induire la prise du colorant. Après la stimulation, perfuser les neurones avec une solution saline fraîche pendant deux minutes pour éliminer l’excès de colorant FM. Puis maintenir les neurones dans la solution saline pendant huit minutes.

Entre-temps, localisez les réseaux axonaux où les terminaisons nerveuses individuelles chargées de FM D sont visibles. Utilisez les longueurs d'onde de la fluorescéine. Évitez les zones présentant des agrégats de cellules.

Refoquez ensuite immédiatement l'image avant l'acquisition, car une légère dérive peut s'être produite pendant la période de repos. Commencez l'acquisition d'images en laps de temps à raison d'une image toutes les quatre secondes. Après avoir acquis cinq à dix images de base, déclenchez l'exocytose du pool facilement libérable en appliquant une stimulation de 30 hertz pendant deux secondes.

Après avoir acquis 10 autres images, déclencher l’exocytose des vésicules synaptiques du pool de réserve en utilisant trois stimulations de 10 secondes à 40 hertz, avec un intervalle de 40 secondes entre chaque stimulation, puis acquérir encore cinq à 10 images. Ensuite, interrompre l’acquisition d’images. Laisser les neurones se récupérer pendant au moins 20 minutes, puis répéter ce protocole de phase S1 dans la phase S2 pour l’expérience témoin.

Pour l'analyse des données, convertir les images en une pile. À l'aide d'une fonction intégrée d'ImageJ, ajuster ensuite la luminosité et le contraste de la pile afin de maximiser la plage dynamique si une dérive horizontale importante s'est produite. Pendant l'expérience, exécuter les greffons StackReg et TurboReg sur ImageJ pour aligner la pile d'images.

Ensuite, le plugin d'analyse des séries temporelles. Définissez ensuite les régions d'intérêt sur au moins 90 terminaisons nerveuses. Il est utile de basculer entre les images avant et après le relâchement du colorant afin de révéler les terminaisons nerveuses actives.

Une taille idéale de région d’intérêt est légèrement supérieure à celle d’un terminal nerveux typique. Ensuite, obtenez l’intensité de fluorescence totale de chaque région d’intérêt au fil du temps. Puis, exportez vers Microsoft Excel.

Voici un organigramme d'une expérience témoin dans laquelle des neurones granulaires cérébelleux ont été chargés avec 10 micromolaire de FM 1 43 à l'aide d'une stimulation de 80 hertz pendant 10 secondes. Voici une image montrant des terminaisons nerveuses chargées avec le FM 1 43. Voici la même image avec 90 régions d'intérêt numérotées sélectionnées pour l'analyse après identification des terminaisons nerveuses actives, ainsi que les images des terminaisons nerveuses aux points temporels sélectionnés.

Ces images sont présentées en fausses couleurs afin d'illustrer les changements de fluorescence lorsque les différents pools de vésicules synaptiques ont été épuisés. Enfin, voici les unités de fluorescence normalisées de ces 90 terminaisons nerveuses. Lors des phases S un et S deux, la diminution de la fluorescence à chaque stimulation successive peut être mesurée et comparée entre les phases S un et S deux.

Dans cette expérience témoin, S un et S deux ont donné des tailles identiques pour les pools facilement libérables et de réserve. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier le réapprovisionnement et la mobilisation de pools spécifiques de vésicules synaptiques dans les terminaisons nerveuses centrales à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence en temps réel. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de confirmer la viabilité et la réactivité des cellules en effectuant les expériences témoins S un avant de modifier les conditions expérimentales S deux.