Un dosage quantitatif de l'insuline exprimer formant colonie Progéniteurs

Ce vidéo montre une procédure permettant de générer des cultures tridimensionnelles qui permettent à des progéniteurs semblables à ceux du pancréas de se différencier en colonies exprimant l'insuline. Premièrement, des cellules différenciées provenant d'une lignée de cellules souches embryonnaires murines neurogènes en trois dimensions, avec un gène rapporteur EGFP inséré par recombinaison homologue, sont dissociées et triées selon l'expression d'EGFP afin d'enrichir en progéniteurs de type endocrinien. Les cellules uniques triées positives pour EGFP sont ensuite mises en culture dans un milieu semi-solide contenant du matrigel et des facteurs de croissance.

Cela limite le mouvement des cellules progénitrices individuelles tout en permettant leur survie, leur prolifération et leur différenciation in vitro. Ensuite, le nombre de colonies formées ayant une morphologie distinctive est décompté et évalué au microscope afin de calculer la fréquence des progéniteurs formant des colonies dans une population triée donnée. L'analyse des colonies individuelles par PCR en temps réel et par microscopie en immunofluorescence révèle une expression d'insuline dans les colonies issues de cellules positives pour ngn3, mais pas dans celles issues de cellules négatives pour NGN3.

Le principal avantage de l'utilisation de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les sphéroïdes pancréatiques en culture en suspension, est qu'elle permet d'examiner simultanément un plus grand nombre de cellules pour leur capacité intrinsèque à former des colonies progénitrices. Cette méthode peut aider à répondre à des questions relatives à la biologie des cellules souches et progénitrices pancréatiques, telles que les marqueurs exprimés par les cellules progénitrices, ainsi que les facteurs intrinsèques ou extrinsèques importants pour le maintien de l'auto-renouvellement et la différenciation de ces cellules. Les implications de cette technique pourraient s'étendre au traitement du diabète de type 1, car si les cellules progénitrices pancréatiques peuvent être identifiées et différenciées en cellules semblables à des cellules bêta, ces cellules pourraient alors être utilisées pour remplacer les cellules bêta endommagées chez les patients atteints d'un diabète de type 1 en stade terminal.

Il peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme l'étude des colonies formées par les cellules progénitrices du pancréas postnatale et adulte, de la moelle osseuse, du foie et de la rate. En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent des difficultés, car la dissociation des cellules en une suspension monocellulaire ainsi que la manipulation du matrigel et de la méthylcellulose lors des préparatifs de distribution peuvent s'avérer délicates. J'ai eu l'idée de cette méthode lorsque j'ai réalisé qu'il n'existait aucun test clonogénique permettant d'analyser les relations lignagères entre les cellules progénitrices et leurs progénitures différenciées provenant du pancréas.

Un tel test de colonies a été essentiel pour l'étude des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices par le passé. Je reconnais un besoin similaire pour l'étude de la biologie des cellules souches pancréatiques. La démonstration visuelle de cette méthode est cruciale, car la composante semi-solide du milieu est naturellement visqueuse, et les étapes de préparation et de distribution sont difficiles à maîtriser.

Les procédures seront démontrées par M. Michael Winkler, étudiant en master, Mlle Nancy, technicienne, et le Dr Lang Jing, chercheur postdoctoral d'un laboratoire, afin de produire un milieu conditionné pour le test de colonies qui sera réalisé ultérieurement. Les cellules souches neuronales ES sont différenciées in vitro en cellules de type pancréatique. Commencez cette procédure en examinant au microscope optique des embryons de six jours.

Au moins 30 à 40 % d'entre eux devraient avoir un diamètre d'au moins 150 microns. Le corps embryonnaire plus volumineux doit présenter des taches sombres suggérant une différenciation accrue. Transférez 80 à 100 corps embryonnaires dans chaque puits d'une plaque d'adhérence à six puits, puis agitez doucement la plaque pour regrouper les corps embryonnaires au centre des puits afin d'augmenter les contacts cellule-cellule.

Ces contacts conduisent à un meilleur développement de cellules semblables à celles du pancréas à partir des corps embryonnaires. Remettez délicatement les plaques dans l'incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone en culture. Un 13.

Remplacer le milieu par du milieu de culture d'attachement frais contenant de la nicotinamide à une concentration quatre fois supérieure et de l'actif recombinant humain en bêta B pour induire la différenciation des cellules endocrines. Puis remettre les cultures dans l'incubateur en conditions de culture. Au jour 16, récupérer le milieu et le filtrer à travers une membrane en polyéthersulfone de 0,2 micron afin d'éliminer tous les débris cellulaires.

À partir de ce moment, le milieu recueilli sera appelé milieu conditionné. Aliquoter les milieux conditionnés dans des tubes coniques en polypropylène de 15 millilitres et les conserver à moins 80 degrés Celsius jusqu'immédiatement avant utilisation. Neurogénine 3 est un facteur de transcription exprimé par les progéniteurs endocriniens pancréatiques au cours du développement. Les précurseurs endocriniens exprimant la neurogénine 3 se différencient finalement en cellules pancréatiques alpha, bêta, delta, epsilon et en cellules exprimant le polypeptide pancréatique. Afin de faciliter l'identification des cellules exprimant NGN3, un allèle du locus NGN3 a été remplacé par le gène rapporteur EGFP dans une lignée de cellules souches embryonnaires murines de type knockin. La lignée cellulaire obtenue a été désignée NGN3-EGFP. Pour obtenir des cellules différenciées NGN3-EGFP positives et NGN3-EGFP négatives.

Les cellules sont d'abord détachées des plaques de culture à l'aide de trypsine au jour 16 afin d'obtenir une suspension monocellulaire. Les agrégats cellulaires sont incubés avec de la collagénase B et de l'ADNase I, puis passés à travers un tamis de 40 ou 70 microns. Ensuite, le DPI est ajouté et les cellules sont triées à l’aide d’un cytomètre en flux pour séparer les cellules selon la diffusion avant et la diffusion latérale, qui indiquent respectivement la taille et la granularité cellulaire, et sont représentées graphiquement.

Une porte est ensuite définie pour éliminer les débris non cellulaires. Le DPI est utilisé pour discriminer les cellules mortes, qui seront marquées positivement. Lorsqu'elles sont excitées entre 405 et 413 nanomètres et que l'émission est détectée avec un filtre 454/40, l'analyse de la largeur de l'impulsion de diffusion avant révèle les doublets, qui doivent être éliminés avant de passer par la porte du trieur cellulaire activé par fluorescence, en comparant le canal EGFP FL1 à l'autofluorescence.

À l'aide de cellules du jour 16 issues d'une lignée cellulaire parentale témoin, comme celle illustrée dans le panneau gauche, on met en évidence la fluorescence réelle, permettant ainsi de visualiser la population de cellules NGN trois EEG FP positives, telle qu'elle apparaît dans le panneau droit. La porte de tri FACS des cellules NGN trois EGFP positives est intentionnellement déplacée vers la droite, comme indiqué ici par la flèche, afin de limiter la contamination par les cellules NGN trois EEG FP négatives durant le tri. Une fois les portes définies, les cellules NGN trois EEG FP positives et les cellules NGN trois EGFP négatives sont triées et conservées sur glace jusqu'à leur utilisation pour la mise en culture.

Placer le matri gel sur de la glace à quatre degrés Celsius la nuit précédant l'expérience. Le jour de l'expérience, placer les réactifs ou solutions suivants sur de la glace : D-M-E-M-F 12, solution de méthylcellulose, milieu conditionné, FCS, nicotinamide, XTEND dans quatre fois du VEGF A et de l'active in beta B recombinante humaine. Placer une boîte stérile de pointes de pipette de 200 microlitres à moins 20 degrés Celsius au moins une demi-heure avant utilisation. En prévision de la mise en place des cellules triées, les composants du milieu semi-solide doivent d'abord être ajoutés à un tube en polystyrène de cinq millilitres. Tout d'abord, utiliser une aiguille de calibre 16 et demi pour aspirer une petite quantité de solution de méthylcellulose à 3,3 % dans une seringue.

Ensuite, expulsez immédiatement la solution pour chasser l'air. Cela remplira l'espace mort de la seringue avec la solution et facilitera une mesure correcte du volume de la solution semi-solide. Ensuite, en évitant la formation de bulles d'air, aspirez et délivrez le volume prévu de solution de méthylcellulose dans un tube de cinq millilitres.

Ajoutez le milieu conditionné FCS nicotinamide prolongeant quatre facteurs actifs dans la bêta B, le VEGF A et le D-M-E-M-F 12. Ensuite, utilisez des embouts de pipette froids pour ajouter le matrigel. Enfin, ajoutez la quantité souhaitée de cellules triées dans le tube de cinq millilitres.

Ajouter toujours les cellules en dernier lieu afin d'éviter une stimulation prématurée des cellules. Ensuite, bien refermer le tube et agiter vigoureusement et soigneusement les tubes à la main. Comme l'agitation génère des bulles d'air, placer les tubes sur de la glace pendant cinq minutes ou jusqu'à ce que les petites bulles remontent en surface.

À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 18 et demi, aspirez une petite quantité du mélange cellulaire semi-solide, puis expulsez immédiatement l’air présent dans la seringue. Ensuite, délivrez lentement 500 microlitres du mélange cellulaire semi-solide directement au centre de chaque puits d’une plaque de culture à 24 puits à faible adhérence. Chaque échantillon doit être ensemencé en quadruplé, en utilisant uniquement les quatre colonnes internes de la plaque à 24 puits orientée horizontalement pour la culture.

Remplir les puits restants avec de l'eau stérile afin d'assurer l'humidification de la culture contenue dans la cellule. Observer les cellules au microscope optique immédiatement après la mise en place.

Les cellules individuelles sont réparties aléatoirement et uniformément dans les puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et dans un air contenant 5 % de dioxyde de carbone pendant huit à douze jours. Après une incubation de huit à douze jours, observer à nouveau les cellules au microscope.

Il s'agit d'un bon exemple de matrigel uniformément réparti en culture. Voici un exemple de répartition inégale du matrigel entraînant un cadre Apache. Les colonies ne se développent pas là où le matrigel est absent.

Il s'agit d'un exemple d'arrière-plan de puits où aucun matri gel n'a été ajouté au mélange de milieu semi-solide. Pour compter les colonies obtenues, fixez une grille sous la plaque. Ensuite, à l'aide d'un objectif de 10 fois, observez et comptez les colonies ; en raison de la nature tridimensionnelle du milieu, les colonies apparaîtront à différents plans de focalisation.

Ainsi, un ajustement de la mise au point pour chaque colonie peut être nécessaire lors de l'observation par microscopie optique. Des microphotographies représentatives de colonies exprimant l'insuline en culture semi-solide après huit à douze jours sont présentées ici ; les colonies indiquées par les flèches sont distribuées aléatoirement et apparaissent comme de petits agrégats sombres, non réfléchissants à la lumière, d’un diamètre d’environ 60 à 100 micromètres. Une analyse ultérieure par microfluidique et RT-PCR sur des colonies sélectionnées manuellement individuellement a révélé une expression de l’insuline deux et du glucagon, conforme à notre rapport précédent. Ces résultats démontrent la capacité de cellules individuelles NGN3-EGFP positives à se différencier en colonies contenant simultanément deux hormones des îlots, ressemblant à des cellules endocrines primitives de type première vague. L’expression protéique de C-peptide, un marqueur de la production *de novo* d’insuline, a été confirmée par coloration fluorescente sur montage entier.

En résumé, lorsque le test des unités formant des colonies exprimant l'insuline est réalisé comme illustré dans ce rapport, le nombre de progéniteurs individuels capables de former des colonies peut être facilement déterminé, comme démontré ici et dans notre rapport précédent. Les unités formant des colonies exprimant l'insuline peuvent être enrichies par tri à partir de cellules NGN3 EGFP positives, mais non à partir de cellules ngn3 EEG FP négatives, dérivées de cellules souches embryonnaires de rat in vitro. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à trois heures après le tri. Lors de la mise en œuvre de cette procédure, il est important de bien dissocier complètement les cellules en une suspension monocellulaire, de maintenir tous les composants de culture sur de la glace afin d'éviter la solidification du Matrigel, et d'ajouter les cellules en dernier dans les tubes afin d'éviter une stimulation prématurée des cellules. Suite à cette procédure, d'autres méthodes, telles que la manipulation de cellules uniques, peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme de savoir si une cellule unique est suffisante pour initier la formation de colonies après son développement.

Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie des cellules souches et progénitrices pancréatiques. Elle leur permet d'explorer la capacité d'auto-renouvellement et le potentiel de différenciation en cellules semblables aux cellules bêta. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer le test quantitatif de colonies pour les progéniteurs formant des colonies exprimant l'insuline.