T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Bonjour, je m’appelle Richard Lin et je suis chercheur ici dans le groupe du professeur TI Mercy au sein de la division des sciences et de la technologie de la santé du MIT de Harvard. Le projet sur lequel je travaille consiste à quantifier et à capturer les lymphocytes T CD quatre positifs et C3 positifs. Le sang des patients doit être utilisé dans des contextes à ressources limitées.

Donc, juste devant moi, nous avons un appareil de microremplissage composé de PDMS, qui est du Polymethyl Sloane. L’appareil, le canal lui-même, l’aigu est de 50 micromètres de haut et le volume total de l’appareil est de 10 microlitres. Il s’agit donc d’un appareil extrêmement précis que nous allons utiliser pour capturer les lymphocytes T auxiliaires.

En gros, c’est la référence diagnostique pour les patients atteints du VIH. Ainsi, la surface du dispositif microfluidique a déjà été préparée avec des protéines et des anticorps positifs CD quatre dans la seringue. À l’heure actuelle, nous n’avons que du tampon biologique PBS à un pH de 7,4 et nous allons maintenant l’injecter dans le canal pour éliminer l’anticorps positif CD quatre supplémentaire.

À ce stade, il n’est pas nécessaire de contrôler le taux, car nous essayons simplement d’éliminer les éléments supplémentaires et notre taux n’a pas vraiment d’importance. Voilà, c’est là que se trouveront les entrées de l’appareil et ce seront les sorties à notre, à ma gauche et à votre droite ici. Alors maintenant, je vais rincer la solution d’anticorps supplémentaire et si vous pouvez remarquer depuis la sortie que vous avez le liquide qui sort, vous savez que c’est une quantité très infime, mais si vous regardez attentivement, vous pouvez voir que votre fluide d’air sort du canal à travers le tube.

Donc, maintenant que nous avons éliminé la solution d’anticorps supplémentaire, nous pouvons maintenant nous préparer à couler en injectant le sang. Je vais donc maintenant débrancher le tube de l’entrée. Alors maintenant, nous allons ouvrir une nouvelle seringue pour le sang, le sang humain, le sang total.

Il ne s’agit donc pas d’un échantillon de patient, mais d’un échantillon sain, d’un échantillon de sujet sain pendant que nous nous préparons à injecter le sang dans le dispositif microfluidique. Nous allons donc fixer la seringue sur le pousse-seringue. Maintenant, nous allons allumer et vous pouvez voir les débits de la seringue et nous l’avons réglé à cinq microlitres par minute.

Et nous allons maintenant nous préparer essentiellement à injecter dans le sang. Nous placerons l’exone-seringue verticalement parce que, comme nous le savons, les cellules sanguines sédimentent et nous voudrons que les cellules s’écoulent dans le canal. Il en va de même pour le sédiment cellulaire au fond, qui se trouve juste à côté de notre tube.

Alors maintenant, tout est prêt à partir. Le volume de mon appareil est de 10 microlitres par 10 microlitres. Et le volume que nous voulons écouler dans la paroi du canal est également de 10 microlitres.

Donc, je peux dire si je coule suffisamment de sang en regardant simplement la couleur du canal, s’il est tout rouge tout rempli, alors je sais que je coule dans 10 microlitres et je devrais arrêter le pare-chocs de la seringue. Alors maintenant, je vais appuyer sur un bouton de démarrage et ça va démarrer parfois, parfois cela prend un certain temps avant que le sang ne passe réellement dans un canal. Et cela est dû en grande partie à la pression.

Par exemple, lorsque nous y mettions la seringue, nous retirions ou injections parfois le liquide en conséquence pour ajuster le sang dans le tube. Cela peut donc prendre un certain temps, mais une fois qu’il commence à pomper dans un canal, le débit est fixé à ly par minute, ce que nous voulons. Donc, nous pourrions être un peu patients ici et attendre, parfois vous devez attendre deux minutes, trois minutes avant que le sang ne commence à couler.

En fait, vous pouvez voir en ce moment que le sang commence à circuler dans le canal. Vous pouvez donc dire à l’heure actuelle que l’appareil s’est presque complètement rempli. D’accord, maintenant nous allons repasser le tube en PBS pour évacuer le sang qui se trouve dans le canal.

Et pour ce faire, nous répéterons ce que nous avons déjà fait pour retirer le tube. Comme nous devons toujours contrôler le débit du PBS, nous avons toujours besoin de l’exhoce-seringue. Cependant, comme nous ne faisons plus circuler le sang, nous n’avons pas besoin de laisser l’autopompe à seringue en position verticale car il n’y a pas de cellules dans le PBS.

Alors maintenant, nous sommes prêts et nous allons maintenant rincer le sang de l’appareil et je vais appuyer à nouveau sur le bouton pointu ici. Comme vous pouvez le voir, l’appareil commence en quelque sorte à s’effacer. Les bords sont encore un peu de sang, mais ils disparaissent lentement.

Donc, une fois que tout le sang aura disparu, nous augmenterons le taux de cinq microlitres par minute à 20 microlitres par minute. Et la raison de ce changement est que dans le sang, il y a en fait deux types de cellules qui ont des antigènes C quatre positifs. L’un d’entre eux est ce que nous recherchions, les lymphocytes T auxiliaires.

L’autre est ce que nous appelons les monocytes. Nous voulons nous assurer que notre appareil capture spécifiquement uniquement les lymphocytes T auxiliaires plutôt que les lymphocytes T auxiliaires et les monocytes. Et la méthode que nous utilisons pour cela consiste à augmenter le débit parce que nous savons que les monocytes sont plus grands que les cellules T auxiliaires.

Ainsi, en augmentant les débits, les monocytes les plus gros subiront plus de pression pour quitter la surface que les quatre cellules T auxiliaires CD. Alors maintenant, c’est en environ 20 minutes. Donc, dans ma main en ce moment, c’est une solution.

C’est ce qu’on appelle la solution de licence de fax. Le but de celui-ci est de lyre les globules rouges. Ainsi, partout où les globules rouges restent dans le canal, cette solution le trouvera.

Celui-ci est dilué 10, 10 fois à partir de la solution mère. Alors maintenant, ce que nous allons faire, c’est arrêter l’auto-seringue, retirer le tube et remplacer essentiellement la solution par celle de cette seringue. Je vais donc maintenant arrêter la machine, retirer le tube, l’enlever, le prendre avec cette seringue, le remplacer par un nouveau.

D’accord, maintenant que j’ai tout configuré, nous allons réduire le taux à cinq microlitres par minute. Nous allons donc cliquer sur le tarif de 20, nous allons le réduire à cinq et maintenant nous allons intégrer la solution de licence de télécopie pendant 20 minutes. Et nous allons maintenant appuyer sur démarrer.

Donc, devant nous en ce moment se trouve une image optique de l’appareil prise à un grossissement de 10 x. Vous pouvez donc raconter tous ces points blancs ici nous-mêmes. Alors, comment pouvons-nous nous assurer que ces cellules sont celles que nous recherchons ?

Nous utilisons donc quelques colorants différents pour nous assurer que la première coloration que nous utilisons est ce que nous appelons dpi, tout cela, il tache en DPI colore le noyau. Donc, en gros, toutes les cellules avec un noyau, comme les globules blancs avec tous les colorants, tandis que les globules rouges qui n’ont pas de noyau ne seraient pas colorés et vous pouvez dire que c’est partout sur l’image. Ce sont tous ces points bleus et chacun avec du bleu.

est une cellule. La prochaine étape consiste donc à vérifier si les cellules ont ce que nous appelons l’antigène C quatre positif. C’est extrêmement important car le but de notre appareil est de capturer quatre cellules positives.

Donc, le suivant, l’anticorps fluorescent que nous utilisons est bien sûr spécifique au C quatre. Et passez à la diapositive suivante. Donc, dans cette image, les cellules sont beaucoup plus sombres parce que l’anticorps fluorescent que nous utilisons est généralement pour des faits.

La dilution est donc beaucoup plus élevée. Mais si vous regardez d’assez près, vous pouvez toujours dire qu’il y a encore des points qui jonchent cette vue de terrain. Ils sont assez sombres.

Mais en y regardant de plus près, nous pouvons dire que ces cellules sont en courant continu pour positif, ce qui est bien parce que c’est exactement ce que nous voulons. Et le test suivant est, comme je l’ai déjà mentionné, il existe deux types différents de cellules C quatre positives. L’un sont ceux que nous voulons les cellules T auxiliaires et l’autre sont ce que nous appelons les monocytes.

Nous avons donc à nouveau besoin d’un autre anticorps fluorescent pour différencier les deux cellules. Nous savons donc que dans les lymphocytes T auxiliaires, ils ont ce que nous appelons des antigènes CD trois positifs sur eux. Alors que pour les monocytes, ce n’est pas le cas.

Donc, le prochain anticorps que nous utilisons est spécifique au CD trois, que nous verrons sur cette image. Encore une fois, vous pouvez dire que leurs points jonchent l’appareil, les points semblent plus gros parce que parfois certaines cellules brillent plus fort, d’autres moins bien. Je veux dire ceci, beaucoup de choses sont dues au hasard dans ce cas, mais dans la plupart des cas, ces points en rouge vif sont tous des cellules.

Donc, encore une fois, nous nous contentons de ce que nous voulons, car premièrement, nous nous assurons que nos cellules sont positives pour le CD quatre et positives pour le CD trois. Donc, dans ce cas, vous pouvez dire que a, beaucoup de nos cellules sont en d CD trois positifs, ce qui est bien. Cela nous donne de la spécificité dans notre capture.

Les gros dos, ça peut être de la camelote, mais souvent, ce qui se passe, c’est que parfois une cellule vient de rassembler plus de CD trois fois, de CD trois sur elle-même. Donc, dans cette image, c’est l’une des données que nous avons collectées pour ce dispositif de micro-fluide et il s’agit essentiellement d’un professionnel de la capture de cellules. Donc, dans le précédent, vous savez, des diapositives, etc., vous pouvez dire qu’il y avait beaucoup, vous savez, des images avec des cellules dessus.

Mais à quoi s’accumulent-ils vraiment ? Eh bien, ils s’accumulent jusqu’à un profil de capture de cellule, auquel cas nous pouvons tracer dans l’axe X nous avons la distance de l’entrée et l’axe Y nous avons le disque de la cellule de capture. Et vous pouvez voir que dans l’ensemble de l’appareil, vous savez, votre, votre densité est initialement extrêmement élevée, puis diminue lentement, ce à quoi nous nous attendrions parce que nous capturons les cellules C quatre positives et trois po, C3 positives de la circulation sanguine et elles diminueront la concentration de ces cellules dans l’échantillon de sang.

Et c’est essentiellement ainsi que nos données sont généralement présentées.