Analyse microscopique des synapses dans des tranches d’hippocampe de souris par immunofluorescence

Place une tranche d’hippocampe d’un cerveau de souris dans un puits contenant un tampon. La tranche contient un réseau de neurones qui communiquent par le biais de synapses.

Les terminaisons neuronales présynaptiques contiennent des vésicules remplies de neurotransmetteurs avec des transporteurs transmembranaires caractéristiques, tandis que les terminaisons postsynaptiques présentent des protéines d’échafaudage caractéristiques qui régulent les récepteurs des neurotransmetteurs. Les deux servent de marqueurs clés pour les structures synaptiques.

Remplacez le tampon par une solution bloquant la perméabilisation et incubez avec agitation pour perméabiliser les membranes cellulaires et bloquer les sites de liaison non spécifiques.

Ajouter des anticorps primaires ciblant les marqueurs présynaptiques et postsynaptiques et incuber avec agitation pour permettre la liaison.

Laver la tranche, ajouter des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores spécifiques aux anticorps primaires, et incuber en agitant dans l’obscurité.

Lavez la tranche, puis montez-la sur une diapositive.

À l’aide d’un microscope confocal, identifiez la région d’intérêt et agrandissez-la pour visualiser les synapses.

Capturez des images pour identifier les marqueurs présynaptiques et postsynaptiques marqués par fluorescence et évaluer leur colocalisation au niveau des synapses.

Pour commencer la coloration par immunofluorescence, remplacez le PBS dans les puits de coupe par un tampon de blocage et de perméabilisation, et incubez à température ambiante pendant 4 à 6 heures sur l’agitateur. Vers la fin de l’étape de blocage, diluez l’anticorps contre VGLUT1 1 à 2000 dans un tampon de blocage et de perméabilisation. Veuillez noter que cette dilution peut différer selon l’entreprise et le lot de l’anticorps utilisé. Incuber les tranches dans la solution d’anticorps primaires pendant la nuit à 4 degrés Celsius. Utilisez une plate-forme secouante avec des mouvements vigoureux.

Une distribution uniforme des anticorps primaires et secondaires est importante pour une coloration optimale. D’après notre expérience, une agitation vigoureuse permet la meilleure pénétration de l’anticorps.

Après l’incubation dans l’anticorps primaire, lavez les tranches trois fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois comme auparavant. Lors du dernier lavage, diluez les anticorps secondaires appropriés de 1 à 500 dans un tampon de blocage. Incuber ensuite les tranches dans cette solution pendant 2 à 3 heures à température ambiante. Assurez-vous que les tranches sont protégées de la lumière, car les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.

Après avoir lavé les tranches comme précédemment, utilisez un pinceau pour retirer soigneusement les tranches de la plaque à 24 puits et placez-les uniformément sur des lames de verre pré-étiquetées. Ajoutez une goutte de support de montage sur chaque tranche. Ensuite, placez délicatement une lamelle en verre sur les tranches, en prenant soin d’éviter la formation de bulles d’air.

Protéger de la lumière et laisser sécher les lames pendant au moins trois à quatre jours à température ambiante. Stockez les lames à 4 degrés Celsius à court terme. Mais pour un stockage à long terme, conservez-les à moins 20 degrés Celsius. Commencez par utiliser un objectif 10x ou 20x pour identifier la région de l’hippocampe à imager - dans ce cas, les synapses entre les neurones pyramidaux CA1 et les axones collatéraux de Schaffer.

Passez à un objectif d’immersion dans l’huile 40x ou 63x et assurez-vous que l’anatomie de la tranche est intacte en identifiant les neurites continus et une structure organisée. Utilisez un marqueur neuronal, tel que MAP2, comme référence. Ajustez les paramètres de chaque canal pour obtenir un signal et un contraste optimaux avec une résolution de 1024 x 1024 pixels. Réglez l’intensité de chaque laser pour éviter la saturation des pixels.

Évaluez la profondeur à laquelle la coloration est uniforme, puis réglez le logiciel pour qu’il acquière des piles d’images d’au moins huit plans équidistants de 250 nanomètres. Prenez ensuite trois piles d’images représentatives adjacentes de la même zone d’intérêt par tranche. Répétez l’acquisition dans au moins trois tranches par condition et de six à huit animaux par groupe de traitement.