Name: La reconnaissance de la transglutaminase épidermique par les IgA et Tissue Transglutaminase 2 anticorps dans un cas rare de Rhésus Dermatite (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez une méthode de visualisation de la réaction auto-immune cutanée dans la dermatite herpétiforme chez les macaques rhésus sensibles au gluten. Cette technique utilise le marquage immunofluorescent pour détecter les autoanticorps IgA et la transglutaminase épidermique.

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Les auteurs tiennent à remercier Amanda Tardo, Dr Mostafa Bouljihad, Stéphanie Feely, Carol Coyne, le Dr Erin Ribka, le Dr Pete Didier et Dorothy Kuebler pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DK076653 et 3R01-02S1-DK076653 à KS et la subvention de fonctionnement de base de l&#39;TNPRC RR000164.

1. Collecte des échantillon de biopsie cutanée <ol><li> Avant de biopsie cutanée procédure, anesthésier les animaux par voie intramusculaire avec 2,5 mg / kg de chlorhydrate de tilétamine et le mélange de chlorhydrate zolazépam télazol (Fort Dodge Santé Animale, Fort Dodge, IA). Surveiller les animaux de l'administration de l'anesthésique jusqu'au décubitus puis retirer de leur enclos. </li><li> Enlever les poils de la zone de la peau d'intérêt en utilisant une Oster Golden A5 tondeuse vétérinaire Single Speed ​​avec une taille de 40 lames (Oster Professional Products, McMinnville, TN) et aseptique de préparer avec une alternance de Betadine scrub et l'alcool. Fixez un drapé fenêtrée stérile sur le site choisi biopsie. </li><li> En utilisant une technique stérile, placer un 4,0 mm Miltex punch instrument de biopsie cutanée (Miltex, York, Pennsylvanie) contre la peau tout en tournant l'appareil de 180 degrés dans le sens anti-horaire et avec une légère pression jusqu'à ce que la biopsie des transects à travers les couches dermiques dans le ti-cutanéeUMÉRO. Retirer l'échantillon de biopsie et de saisir la partie sectionnée de la peau avec une pince et libre du tissu sous-cutané. </li><li> Fermer le défaut de peau avec des sutures en nylon 3-0 attachée à une aiguille 3 / 8 cercle coupe (Ethilon, Ethicon, Johnson &amp; Johnson Medical Limited, Berkshire, Royaume-Uni) dans un modèle croisé. Donner à tous les animaux 0,01 chlorhydrate de buprénorphine mg / kg (Hospira, Lake Forest, IL) par voie intramusculaire pour l'analgésie post-opératoire. </li></ol> 2. Le traitement des échantillons <ol><li> Travailler avec des échantillons de biopsie de peau de dermatite chronique et de contrôle sain macaques rhésus. Procurez-vous deux à trois (4 mm de diamètre) des échantillons de biopsie de chaque animal. </li><li> Fixer le premier échantillon dans le formol zinc (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) pendant 24 heures, laver à l'eau pendant 30 min, laver rapidement à l'éthanol 70%, et le placer dans la préparation des tissus ASP300 Leica (Leica Microsystems Inc , Buffalo Grove, KS), où le tissu est déshydraté avec des notes ascendantes de 70%, 80%, 95% et 100% d'éthanol 48minutes chacune (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), suivi par deux changements de xylène (Fisher). </li><li> Intégrer dans les médias de paraffine (Fisher) pour stockage à long terme à température ambiante. Place à-20oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 6 sections um aide d'un microtome rotatif (HM325, Microm international, Waldorf, Allemagne). Placez sections sur des lames chargées (Fisher) et l'air sec à 60 ° C la nuit. Colorer à l'hématoxyline et l'éosine (H &amp; E) méthode standard (décrit ci-dessous). </li><li> Fix deuxième échantillon dans du paraformaldéhyde 2% (USB Corp, Cleveland, OH) pendant 30 min à température ambiante, laver trois fois en tampon phosphate salin (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), dans 30% de sucrose (Fisher) pour 4 heures, et d'intégrer dans un milieu de congélation OCT (Sakura Finetek, Torrence, CA). Conserver à-80oC pendant 20 minutes avant la coupe. Préparer 15 sections um utilisant le cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI). </li></ol> 3. Coloration H &amp; E <ol><li> Déparaffiner intégrersections du DED à travers trois changements de xylènes (Fisher) et réhydrater travers éthanols graduée: trois changements de 100%, deux changements de 95%, un changement de 80% et d'eau distillée, à 2 min chacune. </li><li> Colorer à l'hématoxyline (Richard-Allan scientifique, Kalamazoo, MI) pendant une minute et suivre par un bref lavage à l'eau courante. </li><li> Contre l'éosine (Sigma) pendant 6 min. </li><li> Déshydrater tissus colorés grâce à 95% et d'éthanol absolu, deux changements de 2 minutes chacun, puis clair dans trois changements de xylènes, à 3 min chacune. </li><li> Lamelle en utilisant le mont Cytoseal milieu de montage (Richard-Allan scientifique) sur le H &amp; E-sections de tissus colorés. </li></ol> 4. L'évaluation histopathologique Inspectez H &amp; E des sections colorées biopsie de la peau sous un microscope optique en utilisant les 4 - grossissement 40x et d'un microscope Leica avec une caméra SPOT Digital Insight (Digital Instruments Inc, au Michigan, Etats-Unis). 5. Immunofluorescence staiNing <ol><li> Travailler avec des sections de peau OCT-embarqué pour la coloration par immunofluorescence. Avant coloration, faire tremper pendant 20 min dans du PBS contenant 0,2% de la peau de gélatine de poisson (FSG, Sigma) à 0,1% Triton X-100 (Sigma) pour enlever les PTOM et pour perméabiliser les tissus. </li><li> Après le lavage des lames, incuber avec 10% sérum normal de chèvre (NGS, Sigma), dilués dans du PBS-FSG pendant 1 heure, à température ambiante, dans une chambre de diapositives humidifié. </li><li> Afin de visualiser les dépôts d'IgA et d'anticorps tTG2, incuber des diapositives avec des IgA anti-rhésus et tTG2 anticorps primaires, dilués dans 10% NGS-PBS-FSG pendant 1 heure. </li><li> Laver avec du PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) pendant 10 min, suivie par PBS-FSG pendant 10 min. </li><li> Incuber avec du secondaire, l'isotype des anticorps spécifiques marqués avec un fluorochrome Alexa Fluor 488 (vert), 568 (rouge) ou 633 (bleu) (Molecular Probes, Invitrogen) à 1:1000 dilution. Utiliser le colorant ToPro-3 pour visualiser l'ADN nucléaire. Utilisez les 10% de NGS-PBS-FSG comme diluant des anticorps. </li><li> Utiliser la solution anti-trempe (Sigma) pour monter les coupes de tissu taché. </li></ol> 6. Imagerie confocale Effectuer l'imagerie avec un Leica TCS SP2 microscope confocal à balayage laser vrai (Leica, Wetzlar, Allemagne) équipé de trois lasers (six lignes d'excitation disponibles): un laser argon-krypton à 488 nm (vert), un laser à krypton à 568 nm ( rouge) et un laser hélium-néon à 633 nm (bleu), qui couvrent du visible à l'extrémité rouge du spectre. Enregistrement de contraste d'interférence différentiel (DIC) des images pour l'évaluation de la non-étiquetés architecture tissulaire. 7. Les résultats représentatifs Un exemple de reconnaissance positive de GTE à la fois par tTG2 et IgA est montré dans la Fig. 3A. Conformément à la situation chez les patients humains et en raison de la prévalence beaucoup plus faible de DH-comme la dermatite que les CD-comme la sensibilité au gluten également dans les macaques rhésus, la plupart des échantillons de biopsie de peau sont censés show la réaction positive avec les anticorps tTG2 mais sans la présence d'IgA tTG2 + + double des cellules positives (Fig. 4). Ces cas DH-indépendantes, y compris les cas dermatites d'origine microbienne, va révéler certaines cellules mono-positif + IgA dispersés sous l'épithélium, mais pas de chevauchement spectral entre l'tTG2 et IgA marqué marqueurs (fig. 3B et 4). Par conséquent, il est important de maintenir l'ordre des procédures d'essai proposées, à commencer par l'examen clinique (Fig. 1), suivie par l'évaluation histopathologique (Fig. 2), et seulement si aucune autre, la dermatite causant plus fréquente des agents peuvent être identifiés, confocale examen au microscope des biopsies de peau colorée pour tTG2 et IgA est justifiée. Des évaluations cliniques et / ou histopathologique ne sont pas suffisants pour le diagnostic positif de cette condition. Dans ces cas lorsque vous double-positifs (+ tTG2 IgA +) les cellules sont identifiés autour de la zone des papilles dermiques, le diagnostic dermatite DH-like peut être délivré. Dans de tels cas, le retrait du glutenet l'administration du régime sans gluten est recommandé afin de soulager les symptômes dermatite. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Région inguinale du EM96 macaque avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 5 semaines. Réintroduction du gluten a coïncidé avec la réapparition de la dermatite (C). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Coloration HE du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: L'épithélium est épaissi (7-15 couches de cellules épithéliales) avec une croûte épaisse superficielle de cellules infiltrées par des neutrophiles hyperkératosiques dégénérer. Les neutrophiles apparaissent aussi à l'intérieur de l'épithélium et sont mélangés avec un nombre modéré de lymphocytes, de plasmocytes et histiocytes autour des annexes dans la partie supérieure du derme. B: Certains hyperkeratTSO est encore présent, épaisseur de l'épithélium est normalisé (4-7 couches) avec infiltration lymphoplasmocytaire minimal dans la partie supérieure du derme. C: Normal peau abdominale à partir FR56 macaque, sans infiltration lymphoplasmocytaire, est inclus à titre de comparaison. Grossissement 20x. <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Images de microscopie confocale du EM96 biopsies cutanées macaque collectées avant (A) et après (B) le retrait du gluten pendant 9 semaines. A: coloration des IgA (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu). Co-localisation des IgA et tTG2 apparaît en jaune autour de la zone d'papilae cutanée. B: échantillon de peau prise après 9 semaines de régime sans gluten ne montre aucun IgA dans l'épithélium alors que certains sous-épithéliale IgA est encore présent (vert), tTG2 (rouge) et ToPro-3 marqueurs ADN nucléaire (bleu). <img src="/files/ftp_upload/3154/3154fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. <table border="1"><tbody><tr><td> Tag animaux </td><td> Sex [M / F] </td><td> Âge [Ans] </td><td> Les symptômes cliniques </td><td> Plasma tTG2 anticorps </td><td> Alimentation [1,2] * </td></tr><tr><td> HJ71 </td><td> F </td><td> 1.3 </td><td> Saine </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HD13 </td><td> M </td><td> 1.4 </td><td> Sains, la diarrhée occasionnelle </td><td> + </td><td> 1 </td></tr><tr><td> FR56 </td><td> M </td><td> 5.4 </td><td> Une diarrhée chronique idiopathique </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EM96 </td><td> F </td><td> 5,0 </td><td> Dermatite chronique </td><td> + / - (Borderline) </td><td> 1 et 2 </td></tr><tr><td> GI24 </td><td> F </td><td> 4.6 </td><td> Dermatite chronique </td><td> - </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. TNPRC macaques rhésus utilisées pour la collecte des biopsies de la peau * Alimentation 1 - régulière singe Chow (contenant du gluten); régime 2 - régime sans gluten

<ol><li>Diosdado, B., Wijmenga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+the+adaptive%2C+innate+and+regulatory+immune+responses+in+the+intestinal+mucosa+of+celiac+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients.</a> Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).</li>
<li>Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+nutritional+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+Clin.+Care%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management.</a> Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).</li>
<li>Sardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+transglutaminase+%28TGase+3%29+is+the+autoantigen+of+dermatitis+herpetiformis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis.</a> J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).</li>
<li>Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+against+epidermal+transglutaminase+are+a+sensitive+diagnostic+marker+in+patients+with+dermatitis+herpetiformis+on+a+normal+or+gluten-free+diet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).</li>
<li>Bethune, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+enzymatic+detoxification+of+gluten+in+gluten-sensitive+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).</li>
<li>Mazumdar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+transepithelial+passage+of+the+immunogenic+33-residue+peptide+from+%CE%B1-2+gliadin+in+gluten-sensitive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques.</a> PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).</li>
<li>Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celiac+disease%3A+from+pathogenesis+to+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies.</a> Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).</li>
<li>Hunt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+genetic+risk+variants+for+celiac+disease+related+to+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genet%22%5BJournal%5D)">Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response.</a> Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).</li>
<li>Abadie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genetic+and+immunological+insights+into+a+model+of+celiac+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Notre nouvellement établie non-humain modèle primate de la sensibilité au gluten a été utilisée récemment pour étudier les modifications de la perméabilité intestinale déclenchée par gluten 5,6. Plasma tTG2 anticorps ainsi que intestinale tTG2 + IgA + dépôts ont été détectés dans certains macaques sensible au gluten. Depuis que nous avons récemment identifié rares incidents de dermatite idiopathique dans la colonie de macaques rhésus, où aucune habitude (infectieuses / métabolique) étiologie pourrait être éta...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif ou de l&#39;équipement </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue de produit / code </td><td> Remarque </td></tr><tr><td> Anti-Human IgA-FITC * </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> F-5259 </td><td> 1:100 dilution de travail </td></tr><tr><td> Anti-Human tTG2 </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> MS-300-P1ABX </td><td> 1:100 dilution de travail </td></tr><tr><td> Anti-Mouse IgG1 ** </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> A-21124 </td><td> 1:1000 dilution de travail </td></tr><tr><td> ToPro-3 *** sonde ADN </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> T-3605 </td><td> 1:1000 dilution de travail </td></tr><tr><td> Zinc formol (Z-fix) </td><td> Anatech Ltd, Battle Creek, MI </td><td> 171 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Gel octobre Medium </td><td> Sakura Finetek, Torrence, CA </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cytoseal montage Medium </td><td> Richard-Allan scientifique, Kalamazoo, MI </td><td> 8312-4 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Trempe Solution </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> P 3130 </td><td></td></tr><tr><td> Ethilon (Suture en nylon) </td><td> Ethicon, Johnson &amp; Johnson, Berkshire, Royaume-Uni </td><td> 663G </td><td></td></tr><tr><td> Miltex punch biopsie cutanée Instrument </td><td> Miltex, York, PA </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> Oster Golden A5 tondeuse simple Vétérinaire de vitesse avec une taille de 40 lames </td><td> Produits Oster, McMinnville, TN </td><td> 78005-050 </td><td></td></tr><tr><td> Préparateurs de tissus Leica </td><td> Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, KS </td><td> ASP300 </td><td></td></tr><tr><td> Microtome rotatif </td><td> Microm international, Waldorf, Allemagne </td><td> HM325 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Thermo Scientific, Kalamazoo, MI </td><td> HM560 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Leica, Wetzlar, Allemagne </td><td> TCS SP2 </td><td></td></tr></tbody></table> * Isothiocyanate de fluorescéine ** Secondaire (Alexa Fluor 568-conjugué) anticorps utilisé après tTG2 anticorps primaire ** Dye

la reconnaissance de la transglutaminase épidermique par les iga et tissue transglutaminase 2 anticorps dans un cas rare de rhésus dermatite

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

2 transglutaminase tissulaire (tTG2) est une enzyme digestive intestinale qui deamidates déjà partiellement digérés alimentaires peptides de gluten par exemple la gliadine. Chez les individus génétiquement prédisposés, tTG2 déclenche les réponses auto-immune qui se caractérise par la production d&#39;anticorps et leur tTG2 dépôt direct en 1,2 mur de l&#39;intestin grêle. La présence de ces anticorps constitue l&#39;une des caractéristiques majeures de la maladie cœliaque (MC). Epidermal transglutaminase (ETG) est un autre membre de la famille transglutaminase qui peut également fonctionner comme un autoantigène dans une petite minorité de patients CD. Dans ces cas relativement rares, ETG déclenche une réaction auto-immune (une éruption cutanée) cliniquement connu comme la dermatite herpétiforme (DH). Bien que le mécanisme exact de la pathogenèse de CD et de DH n&#39;est pas bien comprise, il est connu que tTG2 et ETG épitopes antigéniques part qui peut être reconnue par les anticorps du sérum de patients atteints de CD et de DH 3,4 fois. (Macaca mulatta) atteints de dermatite (Tableau 1, Fig. 1 et 2) a été utilisée pour étudier les tissus affectés. Chez un animal (EM96) un chevauchement spectral des anticorps IgA et tTG2 (Fig. 3) a été démontrée. La présence de doubles-positifs tTG2 + cellules + IgA a été concentré dans l&#39;épiderme en profondeur, autour de la papille dermique. Ceci est cohérent avec les lésions décrites chez des patients DH 3. Lorsque EM96 a été placé sur un régime sans gluten, la dermatite, ainsi que tTG2 + IgA + dépôts ont disparu et ne sont plus détectables (fig. 1-3). Dermatite réapparu cependant, basée sur la réintroduction du gluten dans EM96 (non représentée). En d&#39;autres macaques, y compris les animaux sans lien avec la dermatite, l&#39;tTG2 + IgA + dépôts n&#39;ont pas été détectés. Régime sans gluten dépendant rémission de dermatite dans EM96 avec présence de tTG2 + IgA + cellules de sa peau suggèrent une auto-immunes, comme le DH-mécanisme pour le développement de cette condition. C&#39;est le premier rapport du DH-comme la dermatite de quelque primate non humain.

La dermatite herpétiforme (DH) est une maladie inflammatoire chronique caractérisée par une réaction auto-immune entre les IgA et épidermique transglutaminase (GTE). DH se développe dans une très petite partie des patients sensibles au gluten et / ou cœliaque. Les résultats de cette étude indiquent que la DH peut aussi se développer chez un hôte singe rhésus avec des symptômes de la dermatite idiopathique.

La reconnaissance de la transglutaminase épidermique par les IgA et Tissue Transglutaminase 2 anticorps dans un cas rare de Rhésus Dermatite

La transglutaminase tissulaire 2 (tTG2) est une enzyme digestive intestinale qui désamide le gluten alimentaire déjà partiellement digéré, par exemple les peptides de gliadine. Dans ...

Cet article vidéo démontre une méthode permettant de visualiser la réaction auto-immune dans la peau de Reeses Maccas sensibles au gluten atteints de dermatite herpétiforme. Cette approche consiste d'abord à identifier des animaux présentant une dermatite qui ne peut être associée à d'autres causes de dermatite plus fréquemment diagnostiquées, parmi ces cas idiopathiques ainsi que des témoins sains appariés par âge. Des échantillons de peau sont prélevés à partir de la zone affectée afin d'évaluer l'architecture tissulaire, l'inflammation, ainsi que la présence de transglutaminase épidermique.Les échantillons d'auto-anticorps prélevés sont fixés dans du formol-zinc et de l'hématine au paraformaldéhyde à 2 % dans l'EOSINE ou l'HNE. Une coloration est ensuite réalisée afin d'évaluer l'ampleur de l'inflammation et de l'histopathologie, et une coloration immunofluorescente est effectuée pour évaluer le dépôt d'auto-anticorps dirigés contre la transglutaminase épidermique dans l'épiderme profond. La dermatite herpétiforme est une affection inflammatoire chronique caractérisée par une réaction auto-immune entre l'IgA et la transglutaminase épidermique. La DH se développe chez une très petite proportion de patients cœliaques sensibles au gluten. Les résultats de cette étude indiquent que la DH peut également se développer chez une faible fraction de singes Resus sensibles au gluten.Nos résultats corroborent la validité du modèle Resus Meac récemment développé de la sensibilité au gluten tel que présenté. Les résultats montrent que les manifestations cliniques de cette affection ne se limitent pas uniquement à l'intestin grêle. Un protocole typique implique un animal souffrant de dermatite idiopathique et un témoin sain apparié par âge.Après une anesthésie appropriée et la préparation du site selon une technique stérile, appliquez un instrument de biopsie cutanée à poinçon Miltex de 4,0 millimètres contre la peau de l'animal en exerçant une légère pression. Faites tourner l'instrument de 180 degrés dans le sens horaire puis anti-horaire jusqu'à ce que le poinçon de biopsie traverse les couches dermiques et atteigne le tissu sous-cutané. Répétez l'opération pour une seconde biopsie en utilisant une pince.Saisir la portion de peau sectionnée et la détacher du tissu sous-cutané. Placer le premier échantillon, qui sera traité pour la coloration H&E, dans du formol au zinc. Puis placer le second échantillon, qui sera évalué par microscopie en immunofluorescence, dans du paraformaldéhyde à 2 % en utilisant une aiguille de coupe en cercle des trois huitièmes avec un fil de suture en nylon trois traits zéro.Fermer le défaut cutané selon un motif en croix. Répéter ce processus afin d'obtenir deux à trois échantillons biopsiques par animal. Administrer une analgésie postopératoire comme décrit en détail dans le protocole écrit afin d'examiner la présence et la localisation de l'IGA et de la TTG.Commencez par incuber les échantillons placés dans du formaldéhyde à 2 % pendant quatre heures à température ambiante pour les fixer après la fixation. Éliminez le paraformaldéhyde et rincez avec du PBS pendant 30 à 60 minutes sur une plateforme agitée. Répétez deux fois, pour un total de trois rinçages, puis éliminez le PBS et remplacez-le par du saccharose à 30 % pendant au moins quatre heures et jusqu'à deux semaines.Ensuite, placez l'échantillon dans un milieu de congélation OCT et immergez-le dans un bain de butane méthylique refroidi à la glace sèche jusqu'à ce que l'OCT transparent devienne blanc opaque, indiquant qu'il est complètement congelé. Puis placez les blocs à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Cela garantit que le tissu est solidement congelé afin que la lame puisse le sectionner sans l'écraser.Le tissu peut être conservé à long terme dans de l'OCT à moins 80 degrés Celsius. Après la coupe et le montage des sections sur des lames, éliminer l'OCT et rendre le tissu perméable. Plonger les lames dans un bocal Copeland contenant du PBS avec 0,2 % de gélatine de peau de poisson et 0,1 % de Triton X-100.Ensuite, placez le bocal sur un agitateur rotatif pendant 20 minutes ; après 20 minutes, lavez les lames pendant 10 minutes dans du PBS contenant 0,2 % de gélatine de peau de poisson, puis incubez-les avec 10 % de sérum de chèvre normal dilué dans du PBS contenant 0,2 % de gélatine de peau de poisson pendant 40 minutes à température ambiante dans une chambre humide pour lames. Incubez les lames avec les anticorps primaires anti-resus IgA et TTG deux séparément pendant une heure. Ensuite, tenant la lame par ses bords, pulvérisez-la délicatement avec du P-B-S-F-S-G Triton X-100 à l’aide d’une pipette de transfert.Ensuite, placez-le dans un bocal Copeland contenant le même tampon. Placez ensuite le bocal sur un agitateur rotatif pendant 10 minutes. Répétez le lavage une fois.Ensuite, effectuez un lavage avec du P-B-S-F-S-G pendant 10 minutes. Incubez avec des anticorps secondaires marqués à la fluorescence Alexa, spécifiques de l'isotype, pendant 40 minutes après l'incubation. Lavez la lame comme précédemment.Ensuite, ajoutez la coloration de l'ADN nucléaire au milieu de montage anti-fluorescence dans un rapport de dilution de un à 2000. Appliquez une goutte de ce milieu directement sur chaque lame. Puis placez une lamelle par-dessus le tissu et scellez avec du vernis à ongles.Placez la lame à l'obscurité et laissez-la sécher. Pour visualiser la double coloration IGA et TTG, effectuez l'imagerie à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser équipé des lasers appropriés pour les anticorps secondaires utilisés pour l'évaluation de l'enregistrement de tissu non marqué. Images de contraste interférentiel différentiel, images CIR.Le contraste de phase est un canal du microscope qui restitue les tissus selon une échelle de gris. Cela permet de mieux déterminer l'architecture cellulaire afin de réaliser la coloration HNE. L'échantillon qui a été placé dans du formol au zinc est d'abord inclus en paraffine et sectionné sur des lames.Les lames sont ensuite incubées à 60 degrés Celsius pendant la nuit et placées dans un colorateur automatique, qui colore les lames à l'HNE. Une fois la coloration terminée, examiner les coupes de biopsie au microscope optique équipé d'une caméra numérique, en utilisant les objectifs Forex et 40 x. Enregistrer trois à quatre images pour chaque grossissement. Des échantillons de biopsie provenant de lésions cutanées de Reuss Maca ont été obtenus et colorés comme décrit dans cette vidéo, afin d'étudier l'effet du retrait du gluten alimentaire sur la dermatite ici.La région inguinale d'un macaque est montrée avant le retrait du gluten alimentaire. Lorsque cet animal a été mis au régime sans gluten, la dermatite a disparu et n'était plus détectable, comme on peut le voir ici. La dermatite est réapparue après la réintroduction du gluten alimentaire afin d'évaluer l'architecture tissulaire.La coloration H et E a été réalisée avant l'arrêt du gluten. L'épithélium était épaissi, avec sept à quinze couches de cellules épithéliales et une croûte superficielle épaisse composée de cellules hyperkératosiques infiltrées de neutrophiles en dégénérescence. Des neutrophiles étaient également présents à l'intérieur de l'épithélium et se mêlaient à un nombre modéré de lymphocytes, de plasmocytes et d'histiocytes autour des annexes dans le derme supérieur, après l'arrêt du gluten alimentaire pendant neuf semaines.Une hyperkératose et un épithélium épaissi étaient encore présents, cependant, uniquement avec une infiltration lymphoplasmocytaire minime dans le derme superficiel pour comparaison. La peau abdominale normale, sans épaississement épithélial ni infiltration lymphoplasmocytaire du derme superficiel, est montrée ici. Des images de microscopie confocale des mêmes biopsies cutanées de macaque, prélevées avant l'arrêt du gluten dans l'alimentation, montrent une colocalisation des IgA en vert et de la tTG2 en rouge, apparaissant en jaune autour de la zone des papilles dermiques, indiquant la présence d'autoanticorps dirigés contre la transglutaminase épidermique.Le marqueur nucléaire d'ADN to pro trois est indiqué en bleu après neuf semaines de régime sans gluten. Les IgA n'étaient plus observées au niveau de l'épithélium, indiquant l'absence d'auto-anticorps dirigés contre la transglutaminase épidermique, qui apparaîtraient en jaune. Quelques IgA sous-épithéliales, A indiquées en vert, étaient encore présentes ; le marqueur nucléaire d'ADN to pro trois est indiqué en bleu chez d'autres Maccas, y compris un animal souffrant d'une dermatite idiopathique non liée.Aucun autoanticorps n'a été détecté. La coloration IGA est en vert, la ttg deux en rouge et le marqueur nucléaire d'ADN to pro trois est en bleu. Les cellules positives pour la ttg deux sont présentes à l'intérieur de l'épithélium.Quelques cellules positives pour l'IGA situées sous l'épithélium. Aucun recouvrement spectral étendu entre les marqueurs rouge et vert n'est observé, indiquant l'absence d'autoanticorps dirigés contre la transglutaminase épidermique. Dans cette étude, nous utilisons la microscopie confocale pour visualiser la présence d'autoanticorps IgA dirigés contre la transglutaminase épidermique.Lors de la réalisation de la procédure, il est important de se rappeler que la plupart des cas de dermatite ne sont pas causés par une sensibilité au gluten. Par conséquent, d'autres méthodes, notamment la détection d'anticorps anti-gliadine, d'anticorps anti-transglutaminase tissulaire, ainsi qu'une évaluation clinique minutieuse, doivent être effectuées au préalable. Malgré cela, la prévalence de la dermatite herpétiforme est inférieure à celle de l'entéropathie sensible au gluten.Les résultats fournissent une base pour les recherches futures, en supposant que d'autres animaux présentant cette affection seront identifiés.

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