Name: Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Découvrez une méthode de vis guide pour établir des xénogreffes intracrâniennes de gliome chez la souris. Cette technique permet d'évaluer l'efficacité de nouveaux agents thérapeutiques sur la croissance tumorale et la survie.

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Les auteurs tiennent à remercier Verlene Henry et Lindsay Holmes pour l&#39;aide au développement de ce modèle. Ce travail a été partiellement financé par la Fondation James S. McDonnell (# 220020173).

1. Les lignées cellulaires <ol><li> U87MG cellules de gliome sont cultivées dans de grands flacons de culture tissulaire avec du DMEM-F12 supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal (FBS). </li><li> Les cellules sont récoltées par les flacons de lavage à deux reprises avec du phosphate chaude saline tamponnée (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant 5 minutes avec 10 ml de PBS contenant 0,25% de trypsine et 0,05% d'EDTA. Une fois que les cellules sont levées, elles sont placées dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de milieux de culture et centrifugés (300 X g pendant 4 min). </li><li> Après le lavage, les cellules sont resuspendues à une concentration de 10 x 10 6 / ml dans les milieux de culture, ce qui a permis pour un ensemencement de 50.000 cellules / 5 pl. </li><li> Les cellules sont conservées dans la glace jusqu'à l'injection intracrânienne. </li></ol> 2. Guide à vis intracrânienne boulonnage Cette procédure peut être effectuée plusieurs jours avant l'injection des cellules. Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées dans le cadre stricte des conditions stériles. <ol><li> Souris (BALB / c nu / nu féminin; 5-6 semaines, environ 18g) sont numérotées à des fins d'identification, pesés et anesthésiés avec un intrapéritonéale (IP) par injection d'un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg). </li><li> La peau est essuyé avec une solution d'iode et d'une petite incision (2-3 mm) se fait le long du côté droit de la ligne médiane et antérieure à la ligne interaural. Cette situation expose les points de suture coronale et sagittale du crâne. Le bregma est positionné à la jonction de ces deux points de suture. </li><li> Le point d'entrée Guide vis est ensuite marqué à un point de 2,5 mm latéral et 1 mm antérieure au bregma. Ce point est situé directement au-dessus du noyau caudé 1. </li><li> Un trou de 1 x 1 mm de profondeur est percé avec une main stériles maintenues foret à travers le crâne de la mère. </li><li> Une vis de guidage stérilisés qui s'étendra de 1,6 mm sous la surface des crânes dans la dure-mère est ensuite boulonné dans le trou avec un tournevis jusqu'à ce ras du crâne (figure 1A). </li><li> Un stylet stérile ou factices vis est ensuite placé dans le trou central de la vis de guide pour fermer l'ouverture (figure 1B). </li><li> La plaie est fermée avec une colle tissulaire Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) et les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de reversine (petits animaux) (0,1 ml / kg) et carprofène (5 mg/kg/100 ul) pour l'analgésie. Les souris sont ensuite autorisés à récupérer sur un tapis de réchauffement (36 ° C) qui peut prendre jusqu'à 20 minutes. Les souris sont fréquemment suivis et observés pendant ce temps de récupération jusqu'à ce qu'ils soient pleinement conscients. </li></ol> 3. Intracrânienne greffe cellulaire <ol><li> Une seringue stérile menottées Hamilton est préparé en appliquant un petit anneau en plastique à la pointe de l'aiguille permettant seulement 2 mm de l'aiguille de prolonger en dessous de la sortie de la vis de guidage (figure 1B). Le point d'inoculation final est donc de 3,5 mm en dessous de la surface du crâne. </li><li> Quatre jours après la chirurgie vis de guidage, les souris sont à nouveau anesthésiés comme ci-dessus (2,1) et une petite incision est faite sur la vis de guidage pour retirer le stylet. </li><li> La seringue menottées Hamilton est ensuite rempli avec 5 pi de bien prendre cellules mixtes précautions pour ne pas créer ou établir les bulles d'air. </li><li> La seringue est fixé à la pompe de perfusion et de l'aiguille est insérée dans la vis de guidage (figure 1C). Les cellules sont ensuite infusé à un taux de 30 ul par heure. </li><li> L'appareil automatisé (figure 1D) nous a permis d'injecter jusqu'à 10 animaux en même temps à un débit constant. Les cellules peuvent également être injectés manuellement en utilisant la seringue Hamilton menottées ou bien la seringue peut être menotté par une pointe de pipette 200 ul qui a été coupé par 3 mm pour permettre à la pointe de l'aiguille au-delà de la vis de guidage par 2 mm. L'injection doit alors être effectuée à un rythme constant stable. </li><li> Lorsque la perfusion est terminée, la seringue est soigneusement enlevé et le stylet est remplacé dans la vis guide. La plaie est fermée collés et les souris sont donnés des médicaments de récupération comme avant (2,7) et a permis de récupérer sur un tapis de réchauffement. </li></ol> 4. Défi thérapeutique <ol><li> Quatre jours après l'inoculation des cellules U87MG, les souris sont pesés et divisés au hasard en groupes de contrôle et de traitement. </li><li> Le groupe de contrôle est donné une intra-péritonéale (IP) d'injection de PBS (100 pl), tandis que le groupe de traitement est donné une injection IP de AMG102 (100 ug dans 100 ul de PBS). </li><li> Les injections sont répétées tous les deux jours pendant 14 jours, un total de 6 injections (figure 2). </li><li> Après la dernière injection, les souris sont contrôlés quotidiennement et pesé tous les deux jours. </li><li> Lorsque les souris ont commencé à afficher significative des dysfonctionnements neurologiques (troubles de l'équilibre, paralysie), la déshydratation, ou perte de poids de plus de 10% ou moribonds, ils étaient humainement euthanasiés. Ces humaine point final jours ont ensuite été enregistrées sur la courbe de survie de Kaplan-Meier. </li></ol> 5. Evaluation de l'efficacité thérapeutique <li> La courbe de survie de Kaplan-Meier a été généré en utilisant GraphPad Prism 4.03 pour Windows; GraphPad Software, San Diego, en Californie Etats-Unis, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Décès ou euthanizations étaient marqués comme point final des événements et un score de 1. Les animaux qui ont survécu à la fin de l'expérience ont été enregistrées comme non-événements et notée 0. </li> 6. Les résultats représentatifs: Les animaux témoins ont commencé à montrer des signes de troubles neurologiques et la perte de poids 23 jours après l'inoculation initiale des cellules. Cela a été considérablement retardé dans le groupe traité AMG102 à 35 jours. En effet en 35 jours, 77% (n = 7 / 9) du groupe de contrôle avaient été euthanasiés. La courbe de survie de Kaplan-Meier démontre clairement l'augmentation significative de la survie en réponse à AMG102 traitement (figure 3). En 70 jours, 88% des souris témoins ont été euthanasiés (n = 8 / 9), comparativement à 37% (n = 3 / 8) des AMG102 groupe traité. L'analyse histologique des cerveaux a confirmé que tous les 9 animaux du groupe contrôle ont développé des tumeurs, comparativement à seulement 3 des 8 AMG102 souris traitées (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: Image (A) montre vis de guidage intracrânienne positionné dans une zone située directement au-dessus du noyau caudé. Le revers seringue Hamilton (pré-chargé avec des cellules) est alors placé à l'intérieur de la vis guider afin que l'aiguille de 2 mm d's'étend au-delà du guide et les cellules sont injectées de 3,5 mm à l'intérieur du noyau caudé. La seringue est ensuite retiré et remplacé par un stylet (B). Le dispositif de perfusion automatique (C) peut injecter jusqu'à 10 animaux à la fois. On voit ici cinq injections simultanées (D). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Schéma du protocole de l'étude. Les cellules ont été injectées au jour 0 avec un traitement à compter du jour 4. Les animaux témoins ont reçu une injection de PBS (100 pl) IP alors que le groupe de traitement ont reçu une injection de AMG102 (100 ug/100 ul) IP. Ces injections ont été réalisées tous les deux jours pendant 10 jours. Un total de 6 injections ont été administrées. Les animaux ont ensuite suivis pendant 70 jours des signes de troubles neurologiques et physiques. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: courbe de survie de Kaplan-Meier comparant le contrôle et AMG102 souris traitées. Significative de la survie a été obtenue après un traitement par AMG102 (p = 0,005). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: microphotographies de coupes de cerveau coronale montrant le développement de tumeurs chez les animaux témoins (A) et pas de développement de tumeurs cérébrales dans le AMG102 animaux traités (B). La barre d'échelle est de 1 mm.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche d&#39;Amgen Inc

La méthode Guide intracrânienne vis présentée ici permet la création rapide et reproductible des xénogreffes intracrânienne et dans les mains d&#39;un technicien animalier qualifié, cette procédure est très facile à réaliser sans la nécessité d&#39;un dispositif de stéréotaxie. Notre méthode combine l&#39;utilisation d&#39;une vis de guide, de localiser avec précision la région du cerveau la plus appropriée pour le développement tumoral in vivo, et une pompe à perfusion automatisée qui permet de l&#39;inoculation simultanée d&#39;un maximum de 10 animaux à la fois. La procédure d&#39;augmentation guide-vis prend moins de 5 minutes à effectuer. La perfusion automatisée des cellules à 30 pl / heure prend seulement 10 minutes pour un volume de 5 pl. Ceci assure un dosage précis à un taux constant et réduit le risque d&#39;expulsion de cellules dans la zone extra-crânienne due à la pression intracrânienne accrue. Nous avons également effectué cette procédure avec 10 volumes ul et n&#39;ont observé aucun croissance tumorale extra-crâniennes dues au reflux cellulaire. Comme la pompe à perfusion automatisée permet aussi plusieurs animaux à inoculer simultanément, nous pouvons injecter jusqu&#39;à 60 animaux par heure, comparativement à une procédure stéréotaxique qui est limitée à environ 15 animaux par heure. L&#39;étape la plus critique dans cette procédure est l&#39;emplacement des vis de guidage dans le crâne que sa position détermine l&#39;emplacement final du volume de la tumeur. Si la vis guide est trop centrale, les cellules vont être injectés dans une région entre les deux hémisphères du cerveau alors que si le guide est placé au loin vers l&#39;avant, les cellules ne sera pas injecté dans le cerveau du tout. Il est donc essentiel d&#39;être aussi précis que possible de localiser le guide latéral et 2,5 mm à 1 mm en avant de la bregma 1. Dans cette étude nous avons utilisé une vis de guidage en acier, bien que les vis de guidage en plastique sont également disponibles pour ceux qui nécessitent des études d&#39;imagerie cérébrale comme l&#39;IRM ou PET 6. Même si la pompe à perfusion automatisée est un coût prohibitif pour certains groupes, les cellules peuvent encore être injectés manuellement plus rapidement que les approches de stéréotaxie. Globalement, cette méthode rapide, précise et reproductible peut être utilisée pour étudier le gliome, médulloblastome et les tumeurs du tronc cérébral 7. Cette procédure a été effectuée sur plus de 500 souris entre nos deux laboratoires avec les décès dus à des réactions inattendues anesthésie (&lt;1%). Les souris qui ont été boulonnés avec la vis de guide et ensuite infusé avec des cellules n&#39;ont pas mourir ou de souffrir de complications neurologiques à la suite de la procédure. Les animaux ont survécu passé 100 jours sans aucune complication. Bien que nous avons préféré utiliser une souris sans poils, une souris immuno-compromis avec les cheveux comme le SCID serait tout aussi approprié fourni les cheveux du crâne a été retiré avant la chirurgie pour garder le site propre et pour empêcher les cheveux interférer avec vis de guidage. Il ya plusieurs nouveaux traitements actuellement développé pour le traitement du gliome 8-10. Récemment, nous avons montré que sous-cutanée U87MG xénogreffes de gliome peut être inhibée par un traitement avec AMG102 3; un anticorps humanisé dirigé vers HGF actuellement en cours d&#39;évaluation clinique dans les gliomes 5. Nous avons utilisé la méthode de décrire ici d&#39;établir des tumeurs intracrâniennes U87MG dans le cerveau des souris nude. Notre étude montre clairement l&#39;utilité de la méthode et démontre que AMG102 inhibe significativement la croissance de xénogreffes de U87MG orthotopique. Nous allons continuer à utiliser ce modèle pour déterminer quelles autres thérapeutiques peuvent être utilisées en combinaison avec AMG102 d&#39;obtenir une inhibition plus efficace de la croissance tumorale.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFB </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c souris nu / nu </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Titulaire à vis </td><td> Un Plastiques </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-foret </td><td> Un Plastiques </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Forets </td><td> Un Plastiques </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Vis guide (en métal) </td><td> Un Plastiques </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Dummy Vis (stylet) </td><td> Un Plastiques </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Seringue Hamilton (10 pi aiguille 26g cimenté) </td><td> Division Grace Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe à perfusion PHD 22/2000 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> En option </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Le greffage de cellules tumorales humaines dans le cerveau des souris immunodéprimées est une méthode établie pour l&#39;étude des cancers du cerveau, notamment le glioblastome (gliome) et médulloblastome. L&#39;approche stéréotaxique largement utilisée ne permet pour l&#39;injection d&#39;un seul animal à la fois, beaucoup de travail et nécessite un équipement hautement spécialisé. La méthode vis de guide, initialement développé par Lal et al., 1 a été développé pour éliminer les procédures stéréotaxiques encombrant. Nous allons maintenant décrire une approche Guide modifiés vis qui est rapide et exceptionnellement sûr; qui sont tous deux essentiels des considérations éthiques. Notamment, notre procédure intègre désormais une pompe à perfusion qui permet jusqu&#39;à 10 animaux destinés à être injectés simultanément avec des cellules tumorales. Pour démontrer l&#39;utilité de cette procédure, nous avons établi des cellules de gliome humain U87MG que les xénogreffes intracrânienne chez la souris, qui ont ensuite été traitées avec AMG102; un anticorps entièrement humain dirigé vers HGF / facteur de dispersion actuellement l&#39;objet d&#39;une évaluation clinique 2-5. Injection systémique de AMG102 significativement prolongé la survie de toutes les souris avec des xénogreffes U87MG intracrânienne et a abouti à un certain nombre de guérisons complètes. Cette étude démontre que la méthode vis de guide est un peu coûteux, l&#39;approche hautement reproductible pour l&#39;établissement de xénogreffes intracrânienne. Par ailleurs, il fournit un modèle pertinent physiologiques pour valider de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des cancers du cerveau.

Afin d&#39;évaluer de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour le traitement du gliome, physiologiques des modèles pertinents sont essentiels. Nous utilisons une procédure de guider implantable à vis pour l&#39;établissement des modèles de xénogreffe intracrânienne qui est plus rapide et plus sûr que les approches stéréotaxique.

Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

La greffe de cellules tumorales humaines dans le cerveau de souris immunosupprimées est une méthode établie pour l'étude des cancers cérébraux, notamment le glioblastome...

L'objectif de cette procédure est de générer une greffe intracrânienne de cancer du cerveau afin d'évaluer l'efficacité d'un nouvel agent thérapeutique. Cela est réalisé en fixant d'abord une vis de guidage sur le crâne, puis en infusant des cellules dans le cerveau à travers cette vis. L'étape suivante consiste à entamer un traitement thérapeutique ciblant les cellules tumorales qui se sont établies dans le cerveau.Les animaux sont ensuite surveillés pour évaluer les réponses thérapeutiques en analysant les résultats de survie. En fin de compte, les agents thérapeutiques peuvent influencer la croissance tumorale et la survie dans les groupes traités par rapport aux témoins. Cette procédure peut être réalisée plusieurs jours avant l'injection des cellules.Commencez par peser les souris et les anesthésier à l’aide d’un mélange de kétamine et de xylazine par injection intrapéritonéale. Une fois que les souris ne réagissent plus à une pincée des orteils, préparez leur cuir chevelu avec de l’iode, puis effectuez une incision de deux à trois millimètres le long du côté droit de la ligne médiane et en avant de la ligne interorbitaire. Cette incision expose les sutures coronales et sagittales du crâne.Le bgma est positionné au niveau de la jonction de ces deux sutures. Marquer l'entrée de la vis de repérage à 0,2 à 0,5 millimètre sur le côté latéral par rapport au bgma et à un millimètre en avant du bgma. Ce point se situe directement au-dessus du noyau CAU huit.Maintenant, au repère, utilisez un perceuse portative et faites un trou d’un millimètre de profondeur dans le boulon dural. Insérez une vis de guidage stérilisée dans le trou jusqu’à ce qu’elle soit alignée avec la surface du crâne. Veillez à cesser d’enfoncer la vis dès qu’elle touche la surface du crâne.Si la vis marque le crâne, celui-ci peut se fracturer. La vis de guidage supporte une aiguille de calibre 26 longue de 1,6 millimètre. Pour fermer l'ouverture de la vis de guidage, insérez-y un bouchon ou une fausse vis dans le guide.Vissez maintenant. Fermez la plaie en maintenant les bords de la peau coupée ensemble avec une pince et en collant la peau avec une goutte de colle vétérinaire, étalez-la le long du bord de la peau coupée, maintenez la peau quelques secondes jusqu'à ce qu'elle adhère. Enfin, administrez des analgésiques de type carprofène et un agent de renversement par injection intrapéritonéale et laissez les souris se remettre sur un tapis chauffant.La récupération peut prendre jusqu'à 20 minutes. Pour l'expérience illustrative, des cellules de gliome U-87MG ont été cultivées dans de grands flacons de culture tissulaire avec du DMEM/F12 enrichi de 5 % de sérum de veau fœtal. Cette section décrit comment préparer ces cellules pour l'injection le jour même de l'injection.Récupérez les cellules en lavant d'abord le flacon deux fois avec du PBS tiède. Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS contenant 0,25 % de trypsine et 0,05 % d'EDTA, puis incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu'à ce qu'elles se détachent. Ensuite, recueillez les cellules dans 10 millilitres de milieu.Placer les cellules sur un cytomètre hématique et compter les cellules au microscope selon la cellule. Le tube conique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de culture et de cellules est centrifugé à 300 × g pendant quatre minutes. Après la centrifugation, resuspendre les cellules dans le milieu de culture à une concentration de 10 millions de cellules par millilitre. À cette concentration, chaque volume de cinq microlitres de suspension cellulaire contiendra 50 000 cellules, ce qui est utilisé pour chaque injection intracrânienne.Conserver la suspension cellulaire pour l'injection sur glace. Un seul volume de cellules en suspension est nécessaire ici, car des volumes de cinq microlitres s'évaporent facilement et détruiraient ainsi les cellules. Commencer par préparer une seringue Hamilton munie d'un manchon.Fixer un petit anneau en plastique sur l'extrémité de l'aiguille de sorte que seulement deux millimètres de l'aiguille dépassent sous la sortie du guide-vis. Cela garantit que le point d'inoculation se trouve à 3,5 millimètres de profondeur. Anesthésier une souris préalablement augmentée et pratiquer une petite incision au-dessus du guide. Visser puis retirer l'obturateur.Ensuite, remplissez la seringue avec cinq microlitres des cellules bien mélangées conservées sur glace. Veillez à éviter les bulles d'air dans la seringue, car elles pourraient provoquer une embolie ou un reflux des cellules hors du site d'injection. Fixez la seringue à la pompe de perfusion, puis insérez l'aiguille dans le guide.Commencez l'infusion cellulaire à un débit de 30 microlitres par heure. À l'aide de l'appareil automatisé, jusqu'à 10 animaux peuvent être injectés simultanément à un débit constant. Une injection manuelle est également possible, à condition qu'elle soit effectuée à un rythme constant et régulier.Lorsque l'infusion est terminée, retirez soigneusement la seringue, puis remettez le stylet dans la vis de guidage comme précédemment. Fermez la plaie avec du vet bond, administrez des analgésiques et laissez les souris se remettre. La récupération peut prendre jusqu'à 20 minutes.Quatre jours après l'innoculation des cellules U 87 mg, les souris ont été pesées et réparties aléatoirement en groupes contrôle et traitement. Le groupe contrôle a reçu une injection intrapéritonéale de 100 microlitres de PBS, tandis que le groupe traitement a reçu 100 microgrammes par 100 microlitres d'un MG 1 0 2 ip. L'injection a été répétée tous les deux jours pendant 14 jours, pour un total de six injections.Après l'injection finale, les souris ont été surveillées quotidiennement et pesées tous les deux jours. Le critère d'exclusion de l'animal était défini par l'apparition de troubles neurologiques importants tels que des problèmes d'équilibre, des troubles de la coordination ou des paralysies, une déshydratation, une perte de poids supérieure à 10 % ou le décès. Les jours correspondant aux critères d'exclusion ont été enregistrés sous forme de courbes de survie de Kaplan-Meier.Les décès ou les appels ont été notés comme des événements terminaux, comptabilisés comme un. Les animaux restés vivants à la fin de l'expérience ont été enregistrés comme des non-événements et notés zéro contrôle. Les animaux ont commencé à présenter des signes de troubles neurologiques et une perte de poids 23 jours après l'inoculation initiale des cellules.Ce phénomène a été significativement retardé dans le groupe traité à l'A MG 1 0 2. Au jour 35, 7 des neuf animaux témoins avaient été euthanasiés. Au jour 78, huit des neuf animaux témoins avaient été euthanasiés, contre seulement trois des huit animaux traités à l'AMG 1 0 2.L’analyse histologique des cerveaux a confirmé que les neuf animaux du groupe témoin ont développé des tumeurs, contre seulement trois des souris traitées à 8:00 AM g 1 0 2.

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Médecine

Luciférase modifiée xénogreffes de tumeurs humaines du cerveau peut être établie par voie intracrânienne chez des souris athymiques, avec un suivi ultérieur de la croissance tumorale et la réponse au traitement en utilisant l'imagerie par bioluminescence. En combinaison avec une analyse de survie, de surveillance bioluminescence est un outil de recherche indispensable pour les essais pré-cliniques de thérapies envisagées pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à l&#39;aide d&#39;imagerie par bioluminescence

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Source : Liou, C. et al. Administration intra-ventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris se déplaçant librement. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre l’injection intracrânienne d’acides gras à chaîne courte (AGCC) chez une souris se déplaçant librement pour étudier leurs effets sur le comportement médié par le cerveau. Une canule d’injecteur est insérée dans une canule guide implantée dans le cerveau de la souris. Après sa guérison, la souris s’acclimate...

Injection intracrânienne de métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans un modèle murin

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

Les gliomas malins constituent un groupe hétérogène de néoplasmes glial fortement infiltrative avec les configurations cliniques et moléculaires distinctes. Les xénogreffes orthotopic primaires récapitulent les dispositifs histopathologiques et moléculaires des sous-types malins de glioma dans les modèles animaux précliniques.

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l'emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d'une pompe à seringue à basse pression.

Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Les cellules souches sont des vecteurs thérapeutiques prometteurs pour traiter les tumeurs cérébrales en raison de leur tropisme intrinsèque tumoral. L'administration de cellules souches intranasales non invasives contourne la barrière hémato-encéphalique et démontre un fort potentiel de traduction clinique. Cet article résume les principes fondamentaux de la transmission des cellules souches intranasales dans un modèle de souris du gliome.

Livraison intradermique de cellules souches thérapeutiques au glioblastome dans un modèle de souris

Les tumeurs du système nerveux central (SNC) sont la principale cause de décès liés au cancer chez les enfants, et les thérapies immunitaires locorégionales sont de plus en plus testées pour les patients dans les essais cliniques. Ce protocole décrit des méthodes d’implantation de canules locorégionales chez la souris pour l’évaluation préclinique de perfusions immunothérapeutiques ciblant les tumeurs du SNC.

Implantation intracrânienne de canules pour des perfusions de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) locorégional en série chez la souris

Le développement de modèles orthotopiques de tumeurs cérébrales pédiatriques nécessite une précision méticuleuse, en utilisant un dispositif stéréotaxique pour implanter les cellules cancéreuses avec précision. La méthodologie présentée ici décrit les étapes de la préparation des cellules tumorales cérébrales, de la réalisation d’injections intracrâniennes et de la mise en œuvre d’un système de surveillance postopératoire pour évaluer la greffe de tumeur cérébrale.

Etablissement de modèles de xénogreffes orthotopiques dérivées de patients pour des tumeurs cérébrales à l’aide d’un dispositif stéréotaxique

L’objectif de ce protocole est de fournir aux chercheurs une technique hautement reproductible pour les implantations intracrâniennes.

Implantation intracrânienne stéréotactique de lignées cellulaires de xénogreffes dérivées d’un patient chez des souris

Découvrez une méthode de vis guide pour établir des xénogreffes intracrâniennes de gliome chez la souris. Cette technique permet d'évaluer l'efficacité de nouveaux agents thérapeutiques sur la croissance tumorale et la survie.

Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

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