Name: Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T13:09:54.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Découvrez l'encapsulation cellulaire pour l'impression 3D en biologie cellulaire utilisant des fibroblastes de souris. Cette méthode avance l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative.

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NIH3T3 la préparation des cellules: A. Cellules pour l&#39;éjection <ol><li> Trypsiniser cellules, puis diluer 1:1 avec les médias de cellules, et le transfert à partir d&#39;un flacon T75 à un tube Falcon de 15 ml </li><li> Isoler les cellules en un culot par centrifugation, aspirer le surnageant et laver les cellules avec du DPBS </li><li> Isoler les cellules en un culot à nouveau, et aspirer le surnageant </li><li> Resuspendre les cellules dans les médias </li><li> Déterminer la densité des cellules avec des hémocytomètre (~ 200 x 10 4 cellules / mL par flacon T75) </li><li> Solution cellulaire Centrifuger, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans le montant approprié des médias pour différentes concentrations cellulaires </li></ol> Cellule d&#39;éjection B. <ol><li> Cellules Vortex avant de l&#39;utiliser pour l&#39;éjection </li><li> Transférer 200 ul de solution de la cellule dans la seringue </li><li> Réglez le mode approprié sur un générateur d&#39;impulsions <ol><li> Pour éjecter des gouttelettes d&#39;unique et de multiples gouttelettes (rafales), mis en générateur d&#39;impulsions à «E. BUR&quot; mode </li><li> Pour l&#39;éjection de gouttelettes en continu, mis en générateur d&#39;impulsions à &quot;NORM&quot; mode </li></ol></li><li> Modifier les paramètres du signal <ol><li> Réglez le niveau de haute et basse tension de sortie niveau: HIL à 5 V et de LOL à 0 V et assurez-vous de la «LIM» est allumée </li><li> Régler le signal comme un signal carré </li><li> Changer la quantité de temps l&#39;électrovanne est ouverte pour l&#39;éjection de gouttelettes en changeant la valeur de &quot;IFD&quot; ou le changement cyclique («devoir») </li><li> Modifier la fréquence d&#39;éjection en changeant la valeur de &quot;PER&quot; </li><li> Modifier le nombre de gouttelettes éjectées dans un élan en changeant la valeur de &quot;BUR&quot; </li></ol></li><li> Solution cellulaire éjection sur le substrat préparé pour l&#39;imagerie au microscope </li></ol> Coloration C. <ol><li> Maquillage solution de colorant avec 0,5 uL calcéine-AM et 2 uL d&#39;éthidium homodimère par ml de DPBS </li><li> Plongez substrat préparé dans une solution de teinture </li><li> Laisser l&#39;échantillon à incuber pendant 10 minutes à 37 ° C avant d&#39;imagerie </li></ol> Validation Experiment <ol><li> Sur un Nikon Eclipse TE-2000 U microscope à fluorescence <ol><li> Logiciels avancés spot (Diagnostics, Inc) </li><li> Live / Dead Assay </li></ol></li></ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

<table><tbody><tr><td>Microscope fluorescent</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE-2000 U</td><td></td></tr><tr><td>Éjecteur de cellules à valve solénoïde</td><td></td><td></td><td></td><td>Fréquence de fonctionnement : 1 kHz, 30 psi, 50 nl~0,5 µl. Pilote de valve 12 V : courant de commande 2,5 A</td></tr><tr><td>Réservoir d'air portable de 5 gallons</td><td></td><td>Coleman</td><td>Powermate CT5</td><td>Pression d'air : 30 psi</td></tr><tr><td>Régulateurs de pression</td><td></td><td>Marsh Bellofram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Générateur d'impulsions</td><td></td><td></td><td>HP8112A</td><td>Génération de fréquence d'activation : 50 MHz</td></tr><tr><td>Plateau XYZ</td><td></td><td>Newmark Systems</td><td></td><td>Avec moteur pas à pas : plateau XY course 6 pouces (NLS4-6-25), plateau Z course 2,5 pouces (NLS4-2,5-25), contrôleur 3 axes (NSC-G3), résolution 0,1 µm</td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>Ligne cellulaire</td><td></td><td></td><td>fibroblastes</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td></td><td></td><td></td><td>Solution à 0,05 %</td></tr><tr><td>Milieu pour cellules NIH 3T3</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td> tampon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75</td><td></td><td></td><td></td><td>Flacons de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Tubes coniques en plastique</td><td></td><td></td><td></td><td>15 ml, pour culture tissulaire</td></tr></tbody></table>

titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titre encapsulation cellulaire par des gouttelettes

Je m'appelle Hang Moon. Je travaille avec le professeur des préservatifs. Lui et moi travaillons avec l'étape XYJ pour créer une structure tridimensionnelle de cellule.Bonjour, je suis PE et Lynn, et je travaille sur le projet d'impression cellulaire avec encapsulation cellulaire et milieux et gels. C'est un solénoïde destiné à l'éjection d'une cellule et d'une mixture cellulaire d'aros au-dessus du milieu cellulaire. Le robinet solénoïde est activé par deux lignes de signal.La ligne de signal provient d'une carte sèche ici. Le signal provient d'ici. Cette ligne traverse cette autre ligne, celle-ci étant le premier générateur de fonction.Tout d'abord, le flux est généré par notre méthode programmée. Ainsi, si vous le souhaitez, vous pouvez modifier le débit en changeant le programme à l'aide de la ligne de commutation, ou bien en contrôlant ce générateur de processus depuis l'ordinateur. La vanne cellulaire s'ouvre et se ferme grâce à un signal électrique, mais la cellule est alimentée par cette ligne.La cellule et le milieu ou le gel d'agar sont fournis par l'intermédiaire de seringues. Les seringues situées dans l'eau, la pression à l'intérieur de la seringue est exercée par l'air. L'air comprimé est fourni à partir d'un réservoir, comme ici par la conduite.Ainsi, le petit filet d'air ionisé traverse le filtre à air. Le filtre à air élimine la poussière et les autres types de saletés. Ce générateur de pression, comme nous l'appelons, produit le signal utilisé pour ouvrir ou fermer la vanne d'air solaire ; l'ordinateur est connecté via un connecteur P-I-B-U-S-V.Nous pouvons donc utiliser le port USB en le reliant directement à notre ordinateur, l'ordinateur portable. Celui-ci est connecté à ce côté ici. Ensuite, nous pouvons contrôler via l'ordinateur de commande ici.Ainsi, si nous souhaitons synchroniser le mouvement de la scène et l'ouverture de la cloche, cela peut être contrôlé par le même contrôleur qu'un ordinateur portable. Nous pouvons donc contrôler le moment où elle s'ouvre, où elle se ferme, quand elle bouge et quand elle s'arrête. Et nous pouvons synchroniser le mouvement et l'ouverture de la cloche.Cette étape est la platine motorisée. Elle est déplacée automatiquement par l'intermédiaire de la ligne de signal de mort et du moteur. Ainsi, la motorisation est de 0,1 micromètre.Ainsi, idéalement, il peut tracer la ligne jusqu’à la graduation de 100 millimètres. L’axe du jet se déplace donc, montant et descendant de cette manière. Il contrôle ainsi l’entrefer entre le substrat et la courroie solaire.Ainsi, cela permet de contrôler la hauteur d'éjection. Ce substrat est relié aux étages XY ici, X ici et Y là. Il se déplace donc dans un plan XY.Il en résulte une démonstration de certaines fonctionnalités aux étapes clés, avec trois axes : X, Y et G. Ainsi, l'axe du jet (ou axe XY) est contrôlé par un signal ici. La ligne de signal est connectée au contrôleur de mouvement ici. Ce contrôleur de mouvement ne possède aucun interrupteur manuel, car il ne peut pas être piloté manuellement.Il est contrôlé via l'ordinateur portable. L'ordinateur portable est donc connecté. À l'arrière du contrôleur, nous avons trois xs pour une cellule d'impression XY jet.Ainsi, cela génère trois types de signaux distincts de manière indépendante. Ensuite, le contrôleur de mouvement communique via les connecteurs RF 2, 3, 2 qui sont directement reliés au USV. Puis le USV est connecté à un ordinateur portable.Ainsi, ordinateur portable contrôlant l'emprunteur. Nous utilisons le programme AutoCAD, nous créons un chemin de génération A de cette manière, bam. Ensuite, il est converti en langage machine comme ceci.Ainsi, le langage machine est transféré de manière à ce que les caractères et les nombres simples soient conservés. Chaque position correspond aux axes X, Y, Z. Ici, je choisis le fichier contenant ce type de programme, puis j'ouvre le programme de téléchargement de cette manière. Ensuite, je sélectionne à partir du fichier, exactement de la même façon, le fichier texte.Seul le fichier texte est téléchargé, sélectionnez le fichier texte et téléchargez-le automatiquement depuis l'ordinateur portable vers le contrôleur d'exécution de mouvement, puis il devient le caractère BAM comme je l'ai mentionné précédemment, BAM. Dans ce flacon se trouvent des cellules de fibroblaste murin N IH 3T3. Et je vais d'abord aspirer l'ancien milieu.Ce protocole consiste à repiquer les cellules, qui sont adhérentes au fond du flacon. Après avoir aspiré le milieu, j'ajoute six RYS, qui est une enzyme. D'accord ? Une fois la trypsine ajoutée dans le flacon, il faut attendre de trois à cinq minutes pour que les cellules se détachent du fond du flacon.Nous sommes maintenant prêts à ajouter le milieu et à transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse. Il s'agit d'une dilution au un pour un. J'ajoute donc six millilitres de ce milieu ici et je vais rincer légèrement les lamelles pour m'assurer que toutes les cellules sont transférées.Et maintenant, les cellules sont prêtes à être centrifugées dans ce tube. Nous allons maintenant centrifuger ces cellules à mille tr/min pendant trois à cinq minutes. Maintenant que les cellules ont été regroupées en un culot, je vais aspirer le surnageant.Maintenant, je vais laver les cellules avec du PBS. Ceci sert à colorer les cellules. Les colorants que nous utilisons sont des substrats d'estérase.Très bien, maintenant nous allons procéder à une nouvelle centrifugation afin de faire précipiter les cellules en un culot. Je vais ensuite aspirer le PBS et resuspendre les cellules dans le milieu destiné au comptage.Je mélange les cellules afin que, lorsque nous prélevons un échantillon, la concentration soit uniforme dans tout le tube. Maintenant, je vais prélever cent microlitres des cellules pour mesurer la densité cellulaire. J'ajoute maintenant cent microlitres de type et bleu, qui est un colorant.Nous allons attendre trois à cinq minutes afin que le colorant pénètre les membranes des cellules mortes. Lors du comptage des cellules, nous n'incluons pas les cellules bleues. Les cellules sont prêtes à être comptées avec le cytomètre sanguin ; je vais transférer 50 microlitres du mélange cellulaire de chaque côté du cytomètre sanguin.D'accord, je vais le recouvrir avec le côté d'une lame en verre. Il y a deux côtés sur le cytomètre hématique. Je vais compter le premier côté, puis après avoir compté les deux côtés, je ferai la moyenne et multiplierai par deux, car nous avions une dilution un-à-un avec le type en bleu.Donc, fondamentalement, notre densité cellulaire sera de 135 fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre. Pour notre expérience, nous utiliserons une solution cellulaire ayant une concentration de cinq cent mille cellules par millilitre. Étant donné que nous avons 13,5 millions de cellules, je vais resuspendre les cellules dans 27 millilitres de milieu.Nous utilisons deux types différents de colorants. Il s'agit d'un test vivant-mort de Molecular Probes. Notre premier colorant s'appelle le calcium am.Notre deuxième colorant s'appelle l'homodimère AUM. Il colore les cellules mortes. Nous utilisons une excitation bleue pour obtenir une fluorescence verte et une excitation verte pour obtenir une fluorescence rouge. Pour ces deux colorants, lorsque nous effectuons l'imagerie, notre solution de coloration sera préparée dans du PBS.Donc, tout d'abord, je vais transférer cinq millilitres de PBS dans un tube, soit du chlorure de sodium tamponné au phosphate. C'est une solution saline. Maintenant, je vais ajouter un demi-microlitre de chlorure de calcium par millilitre.Je vais maintenant ajouter 2,5 microlitres de calcium am au tube et 2 microlitres du homodimère athe par millilitre de PBS. Voici la machine btex. Elle permet une répartition homogène des cellules et du milieu dans tout le volume.À présent, nous chargeons la cellule de 200 microlitres sur le sept ici. Ensuite, nous mettons le bouchon, qui est hermétiquement scellé de cette manière. J'ouvre alors la vanne et l'air sous pression pénètre. Puis, j'ajuste la courroie ainsi. Ensuite, je modifie la pression.Donc, j'ajuste. La pression est de cinq PSI. La pression à l'intérieur du tube est de cinq PSI.De ce point à celui-ci, la connexion s’effectue à travers l’intérieur du trou. Nous ouvrons donc simplement le cloche ici, puis la cellule est injectée avec une pression de cinq PSI, puis commence à s’ouvrir. Ensuite, la vanne Sona commence à fonctionner.Ensuite, nous positionnons le substrat. Le substrat est simplement une lame en verre. Puis nous déposons la quantité appropriée et j'ajoute un ruban adhésif pour fixer le substrat de cette manière, n'est-ce pas ?Et simplement, je le fixe. Nous mettons donc en place l'ensemble, la cellule, la vanne ary et le substrat, pendant le déplacement du dispositif ary en cours de fonctionnement, qui commence à travailler. Nous installons donc l'ensemble, puis nous ouvrons la vanne ary pour démarrer. Ensuite, nous déplaçons la platine de cette manière, n'est-ce pas ? Puis nous créons un motif sur le substrat, un motif sur le substrat, et hop, le personnage. Je vais immerger ces gouttelettes que nous avons imprimées dans cette solution colorante que nous avons préparée précédemment.Et maintenant, les gouttelettes seront incubées pendant 10 minutes, puis observées. Je vais d'abord régler l'image à travers l'oculaire. Notre première image est simplement une image en champ clair.Je vais éteindre la lumière et changer le filtre afin d'obtenir une excitation bleue, qui révélera une fluorescence verte. La troisième image que nous prendrons correspond aux cellules mortes, marquées par le Thm Homodimer. Avec une lumière verte, nous obtiendrons une fluorescence rouge.

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