Emballage VIH ou FIV à base de constructions d'expression et de transduction du Lentivector VSV-G pseudotypés particules virales

L’objectif général de cette procédure est d’en apprendre davantage sur l’emballage lentiviral. Un protocole de cinq jours. Le premier jour, 2 9 3, les cellules productrices de TN sont plaquées à une densité calculée.

Le deuxième jour, les cellules sont transfectées avec la construction du vecteur lenti de votre choix contenant le gène d’intérêt et le mélange de plasmides d’emballage viral. Le quatrième jour, le sat viral est récolté et concentré en ajoutant une solution de précipitation du virus PEG. Les dernières étapes de la procédure consistent à récolter le virus concentré en PEG, à aliquote le virus et à infecter les cellules avec le virus concentré pour le traitement viral.

En fin de compte, la PCR quantitative des gènes intégrés stables est utilisée pour calculer le nombre de constructions intégrées stables. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transfection plasmatique ou la transduction rétrovirale est que le protocole d’emballage optimisé des lentivirus du FBI produit un virus fonctionnellement actif à titre élevé, ce qui permet une administration efficace dans presque toutes les cellules de mammifères, y compris les cellules difficiles à transfecter comme les cellules souches et les cellules primaires non divisées. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce qu’elles ne sont pas familières avec les petits détails du protocole, qui sont essentiels pour une production réussie de virus à titre élevé.

La démonstration visuelle de cette méthode est utile car la densité cellulaire visualisée au microscope pendant la transfection détermine l’efficacité de l’emballage viral, qui détermine le titre viral final. Dans les cas où cela est applicable, l’expression du rapporteur fluorescent détermine l’efficacité de la transfection, ce qui a un impact significatif sur le titre viral final. De plus, la démonstration visuelle de cette méthode est utile pour que les chercheurs se familiarisent avec des parties subtiles mais importantes du protocole, telles que les meilleures pratiques pour maintenir la stérilité tout au long du processus et comment éviter d’inclure des débris cellulaires dans le virus récolté.

Un emballage lentiviral efficace repose sur trois composants. Tout d’abord, le vecteur d’expression lentivirale doit contenir certains des éléments nécessaires à l’empaquetage et à l’intégration stable du virus, ainsi que des éléments permettant l’expression du gène d’intérêt. Épingle à cheveux courte, ARN, micro-ARN ou cassette rapporteure.

Deuxièmement, les plasmides d’emballage lentiviral doivent fournir les protéines essentielles à l’emballage d’une copie de l’ARN de la construction d’expression en particules pseudovirales recombinantes et à la transcription inverse et à l’intégration virale ultérieures lors de l’infection. Troisièmement, les cellules productrices de 2 9 et 3 TN doivent être transitoirement transectées par des cots avec les vecteurs d’expression et d’emballage. Ces cellules produisent des particules pseudovirales à haut titre qui doivent être récoltées dans les milieux de culture.

En fin de compte, la réussite de la transduction des cellules cibles dépend principalement du nombre de particules virales par cellule pour un type de cellule donné. En d’autres termes, la multiplicité des infections commence par la croissance de 2, 9, 3 cellules TN. En plaques de culture cellulaire de 15 centimètres pendant 18 à 24 heures pour obtenir une fluidité de 60 à 80 %.

Au moment de la transfection, chaque plaque produira environ 14 millions de cellules pour augmenter le rendement du virus. Plus d’une plaque peut être utilisée le lendemain lorsque les cellules 2 9 3 TN sont confluentes à 60 à 80 %, elles sont prêtes pour la transfection. Pour chaque plaque de cellules, ajoutez 1,6 millilitre de DMEM sans sérum dans un tube de faucon de 15 millilitres.

Ajoutez ensuite 22,5 microgrammes de ppac H one ou Ppac F1 et 4,5 microgrammes de votre lenti vectoriel Construct dans le DMEM et mélangez en pipetant de haut en bas. Ensuite, ajoutez 55 microlitres d’affection pure dans le même tube et vortex pendant 10 secondes, suivi d’une incubation à température ambiante de 15 minutes. Après 15 minutes, ajoutez un tube dans chaque plaque de culture.

Dropwise fait ensuite tourner doucement la plaque, puis incube les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures. Si la construction du vecteur lenti exprime un gène fluorescent comme la GFP, vérifiez les cellules au microscope, une transfection réussie donnera 50 à plus de 90 % de cellules fluorescentes vertes collectent maintenant le surnageant de culture cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres. Le surnageant contient les particules pseudovirales infectieuses.

Les cellules retirées de la plaque n’affecteront pas négativement la production de virus. Pour éliminer les débris centrifuger, le surnageant viral à 1500 G pendant 15 minutes à température ambiante. Ensuite, sans déranger la cuillotte, prélevez le surnageant viral en veillant à laisser un tampon d’environ 500 microlitres de surnageant et passez à l’étape suivante, qui consiste à concentrer les particules virales 72 heures après la transfection.

Un deuxième prélèvement facultatif du surnat viral peut être effectué à l’aide de la même technique après la collecte du sat viral. Concentré en ajoutant un volume de solution de précipitation du virus de la cheville glacée à tous les quatre volumes de surnageant dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 millilitres. Inversez la solution pour la mélanger.

N’utilisez jamais de vortex, puis conservez la solution sans agitation à quatre degrés Celsius jusqu’à 96 heures. Après un minimum de 12 heures de réfrigération, centrifuger le mélange à 1500 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, les particules lentivirales précipitées par le peggo apparaîtront sous la forme d’une pastille beige ou blanche au fond du tube.

Maintenant, éliminez toute trace de liquide par aspiration soigneuse sans perturber les particules lentivirales précipitées dans la cuffe. Alternativement, retirez la majeure partie de la supranatine et remettez la pastille en suspension dans le supinat restant. Transférez ensuite la suspension dans un tube einor stérile de deux millilitres et centrifugez le tube dans une micro-fuge froide pendant deux minutes.

À 14 000 tr/min, pipetez le surnageant restant et mettez à nouveau en suspension la pastille de particules lentivirales dans de la glace, un tampon froid et stérile à un 10e à un 100e. Le volume d’origine pipette soigneusement la pastille dans la solution sans créer de bulles, en la gardant froide à tout moment. Assurez-vous que le granulé est complètement remis en suspension.

Enfin, fabriquez des aliquotes d’encre de 15 à 25 microlitres, des flacons cryogéniques stériles sur de la glace et conservez les flacons à moins 70 degrés Celsius. Un cycle d’emballage réussi produira 10 à 1000 millions d’UFP par millilitre pour la transduction du virus dans une plaque de culture de 24 puits, 50 000 cellules par puits, et les cultivera pendant la nuit dans les conditions de culture spécifiées. Les cellules doivent être entre 50 et 70 % confluentes pour la transduction à des fins de titrage.

Les cellules HT 10 80 peuvent être utilisées comme une lignée cellulaire de contrôle facile à transduire, le lendemain, en aspirant le milieu des cellules. Combinez ensuite le milieu de culture avec une solution concentrée de canard. Ainsi, la concentration finale de canards trans est d’un x, ajoutez un demi-millilitre de transduction à chaque puits avec des cellules cibles à la densité correcte de 50 à 70 % de fluidité Co ajoutez le virus dans chaque puits aux dilutions suivantes, un à 100, un à 10 et une dilution directe un à un.

Le virus peut rester en contact avec les cellules cibles jusqu’à 72 heures sans changer de milieu. Après 72 heures, le provirus se sera intégré de manière stable dans le génome de l’hôte et exprimera le gène d’intérêt. Si l’expression actuelle du marqueur fluorescent peut être utilisée pour estimer l’efficacité de la transduction avec différentes dilutions virales, alors le nombre d’unités infectieuses peut être quantifié par QPCR.

Une fois que le titre du virus est connu, calculez le volume approprié de virus pour obtenir la multiplicité d’infection souhaitée pour les autres cellules cibles. La mesure du titre et le contrôle du MOI assurent la cohérence entre les expériences et les différentes préparations virales. Le virus est maintenant prêt à être utilisé dans des expériences supplémentaires.

La densité de départ des cellules 2, 9 et 3 TN était essentielle pour le succès de l’emballage viral le jour de la transfection. Ces cellules 2 9 3 TN étaient confluentes entre 60 et 80 %. 24 heures après une transfection réussie avec un vecteur lenti exprimant la GFP, il a été constaté qu’au moins 90 % des cellules 2 9 3 TN présentaient une fluorescence verte.

72 heures après la transduction, la GFP a continué à s’exprimer dans les cellules hôtes HT 10 80. Cela indique que la construction lentivirale intégrée de manière stable dans le génome de l’hôte, transduisant les mêmes cellules hôtes à une dilution décuplée, a diminué proportionnellement l’expression de la GFP. Parce que la relation entre le titre viral et l’expression génique médiée par les lentiviraux est directement proportionnelle.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée sur une période de cinq jours à raison d’environ une à deux heures par jour si elle est correctement exécutée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’emballer efficacement et en toute sécurité des particules virales fonctionnellement infectieuses et de transduires avec succès des cellules avec le virus. N’oubliez pas que travailler avec le lentivirus peut être dangereux et que des précautions telles que le travail dans une cagoule de culture de deux tissus BSL.

Le port d’une blouse de laboratoire et de gants doit toujours être pris lors de l’exécution de cette procédure.