Name: En utilisant une approche comparative des espèces pour Enquêter sur la neurobiologie des réponses paternel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Découvrez une approche comparative entre espèces pour étudier les bases neurobiologiques du comportement paternel chez les souris Peromyscus. Cette méthode permet d'identifier les corrélats comportementaux et neurochimiques sans manipulation invasive.

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Cette recherche a été financée par des subventions non. 0723341 (à KGL) de la National Science Foundation. Nous sommes également reconnaissants pour les contributions fournies par le Programme de bourses de recherche Schapiro premier cycle et au département de psychologie au Randolph-Macon College. Enfin, nous apprécions les contributions de collaboration Craig Kinsley dans cette recherche et d&#39;aider Amanda Rzucidlo dans la préparation du laboratoire de R-MC pour cet article la vidéo.

1. Identification du modèle animal <ol><li> La souris sylvestre Californie (Peromyscus californicus) est un modèle idéal pour explorer les réponses paternelle. Comme vous le voyez, cette souris palefreniers les chiots comme les mamans font - ils ont même s'accroupir sur eux de sorte qu'il ressemble à des chiots sont des soins infirmiers. Le comportement de la souris par rapport à la Californie est une espèce du même genre, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) qui présente peu d'intérêt pour les chiots, souvent essayant de s'échapper, ou même les attaquer. (Voir Figure 1 pour des photos de ces espèces en interaction avec les chiots.) </li><li> Une fois le modèle des espèces a été identifié, puis les différents groupes doivent être établis. Dans cette étude, les pères biologiques, les vierges qui n'ont aucune expérience parentale, et vierges avec l'exposition des petits limitée (pup-exposées ou les pères d'accueil) des deux espèces sont utilisées afin que les deux prédisposés et a acquis des caractéristiques paternelles peuvent être évalués. Dans cette étude particulière nous avons aussi tous les groupes exposés à une souris jouet chiot pour s'assurer que les interactions sociales étaient spécifiques à un chiot et non une réponse à tout représentant placé dans la cage (voir Figure 2). </li><li> Avant d'enquêter sur des facteurs neurobiologiques, il est important de confirmer que les espèces sélectionnées présentent de nettes différences dans le comportement de l'intérêt. Dans cette étude, les mâles sont placés dans une cage avec un chiot pendant cinq minutes et un éthogramme comportement paternel (voir le tableau 1, par exemple des éthogramme) est utilisé pour marquer les comportements tels que la latence d'approche du chiot et la quantité de temps passé en contact avec le chiot. Si des réactions agressives sont observées, le chiot est immédiatement supprimé. Ces sessions sont souvent filmées afin d'une analyse minutieuse du comportement peut ensuite être réalisée. </li></ol> 2. Préparation des tissus du cerveau <ol><li> Après une perfusion standards de chaque souris (protocole ci-joint), les cerveaux sont prélevés afin qu'ils puissent être sectionné dans le domaine d'intérêt spécifique (cerveau spectacle). </li><li> Une norme de cerveau de souris atlas (montrer atlas) est utilisé pour localiser le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, une région connue pour être riche en cellules produisant le neuropeptide d'intérêt dans cette étude - vasopressine (AVP). </li><li> Le cerveau est alors bloqué et monté sur un mandrin de congélation de sorte que le tissu se fige avant d'être sectionné avec le microtome. Le cerveau est sectionnée dans un mode de garniture jusqu'au repère spécifiques sont identifiés, puis l'épaisseur spécifique du cerveau, de 30 microns dans ce cas, est prévue pour les sections du cerveau utilisées pour l'analyse. </li><li> Les sections du cerveau sont soigneusement placés dans des assiettes bien remplies avec un tampon phosphate salin (PBS); (protocole d'attachés PBS, s'il vous plaît noter que ce n'est qu'un exemple d'un protocole immunocytochimie standard). </li></ol> 3. Immunocytochimie <ol><li> Tout au long des différentes étapes de ce processus (voir le protocole ci-joint), il est important d'avoir des compétences précises de pipetage pour assurer des mesures précises de produits chimiques et d'autres ingrédients importants pour cette technique (pipetage étudiants spectacle). </li><li> La première étape de ce processus est de se laver les cerveaux, qui consiste à remplacer le CPE dans les assiettes ainsi trois à cinq fois; entre chaque lavage des plaques ainsi sont placées sur une bascule de 10 minutes (montrer aux étudiants remplaçant PBS et en plaçant les plaques bien sur rockers) . </li><li> Les tranches de cerveau sont ensuite exposés à la solution d'anticorps primaire et conservés à 4 ° C pendant la nuit sur la bascule (processus de spectacle). </li><li> Après un autre lavage, les tranches de cerveau sont exposées à un anticorps secondaire pendant une heure sur la bascule à la température ambiante, puis lavés à nouveau. </li><li> Suivant les cerveaux sont exposés à une solution Avitin-biotine pour se préparer à la visualisation des cellules neurochimique-positif. </li><li> Pour l'étape de visualisation finale, les cerveaux sont exposés à la DAB. Ceci est un produit dangereux et devraient toujours être manipulés avec prudence. Comme on le voit ici, les tranches du cerveau commencent à s'assombrir devant vos yeux (montrer des processus). </li><li> Suite à l'exposition DAB, le cerveau passent par la dernière série de lavages et sont ensuite soigneusement placés sur des lames de microscope subbed et laisser sécher durant la nuit (montrer le placement d'une tranche de cerveau sur une lame; voir la pièce jointe pour le protocole de diapositives subbed). </li><li> Les lames sont ensuite compensées par une série de lavages à l'eau et de l'alcool distillé, d'être finalement submergés dans Citrosolv avant d'être lamelle et stockées dans un Slidebox pour garder sûr (montrer les différents aspects de ce processus, voir l'attachement des processus de compensation). </li></ol> 4. Neuroquantification <ol><li> Après les diapositives ont séché, elles peuvent être évaluées avec le logiciel neuroquantification spécialisés. Voici un logiciel Bioquant est utilisé pour quantifier les cellules vasopressine-positifs et des fibres dans le noyau paraventriculaire du cerveau de souris (montrer le logiciel à l'écran ... et le microscope). </li><li> Le domaine d'intérêt spécifique est identifié en utilisant les options de mesuredu logiciel pour établir le champ visuel pour neuroquantification. Il est important que la taille du champ visuel cohérent est quantifié pour chaque animal (étudiant montrent ce faire). </li><li> Voici les corps colorés en foncé cellules vasopressine-immunoréactive et les fibres sont apparentes. Parce qu'il est difficile de compter ou de trace de ce tissu, une caractéristique particulière de ce logiciel utilise la lumière pour seuillage déterminer le montant total du tissu colorées positivement dans la zone d'intérêt spécifié. Ce seuillage nous indique de combien de la zone spécifiée contenait vasopressine-positif tissus (montrer la valeur des données sur l'écran d'ordinateur). </li></ol> 5. Analyse comportementale <ol><li> Si plus d'un observateur sera notation des bandes vidéo, il est important d'établir fiabilité inter-évaluateurs pour assurer que les observateurs sont marquant le comportement d'une manière cohérente. Pour la session notation réelle, une feuille de pointage de comportement doit être préparé pour permettre notation facile du comportement pendant les séances d'observation (voir le tableau 2 pour exemple de notation tableur). </li><li> Pour les comportements qui ne sont pas rapides réponses épisodique, une analyse peut révéler microséquençage subtilités sur la progression des réponses spécifiques. Par exemple, le comportement de toilettage consiste en une chaîne de réactions très rapides. Bien que d'une option est de simplement enregistrer la présence et la durée de toilettage, une autre est de documenter la chaîne des événements qui accompagne cette réponse. En utilisant ce logiciel microséquençage, les observateurs score de la présence d'un comportement particulier à chaque seconde, comme demandé par le logiciel (software spectacle et vidéo). </li><li> Après la collecte des données, les paramètres d'intérêt sont déterminés et les scores comportementaux appropriés sont analysés. Des exemples peuvent être la durée totale du temps passé en contact avec le chiot, ou le nombre d'interruptions dans la séquence de toilettage (montrer ordinateur avec tableur avec les données saisies pour chaque animal). </li><li> Une fois que le comportement est marqué il est important de confirmer que les deux espèces présentaient des stratégies d'intervention différentes pour le comportement de l'intérêt dans l'étude. Dans ce cas, la souris sylvestre Californie devrait présenter un comportement plus paternel que les souris cerfs communs. De plus, diverses mesures comportementales peuvent être corrélées avec les mesures du cerveau pour obtenir une vision plus éclairée des influences pertinentes. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: <ol><li> Pour valider le modèle, les données devraient indiquer clairement que les deux espèces effectué différemment à l'égard du comportement de l'intérêt. Ici vous pouvez voir que le P. mâles californicus passé plus de temps de toilettage et accroupi sur les chiots, deux caractéristiques des réponses paternelle (voir Figure 4). </li><li> Afin de déterminer si la variable d'intérêt est neurobiologial important dans les réactions paternelle, le montant de la vasopressine (AVP)-positifs tissus a été quantifiée pour plusieurs zones du cerveau concernées; comme on peut le voir, le père P. animaux californicus avait plus de tissu immunitaire positive dans plusieurs de ces zones du cerveau. (Voir Figure 5). </li><li> Dans une étude connexe en utilisant l'analyse microséquençage, il a été émis l'hypothèse que la Californie paternelle souris présentent moins d'anxiété que leurs homologues vierge; en conséquence, lorsqu'ils sont exposés à une odeur de prédateurs, les pères exposés moins d'interruptions dans la séquence de toilettage que les animaux vierges (voir Figure 6). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: (A) Des souris mâles présentant des réponses en Californie paternelle envers conspécifiques chiot extraterrestre. (B) la souris sylvestre Homme présentant une approche prudente (étirement participer) et la réaction d'évitement, en présence d'un étranger conspécifiques chiot. Remarque: Dans ces évaluations interaction sociale, si un homme présente des réactions agressives envers le chiot, les expérimentateurs immédiatement frappé le haut de la cage pour distraire le mâle. A ce moment la session est terminée et que le chiot est retiré, inspecté pour déceler toute blessure et est retourné à la mère. Dans notre laboratoire, ce qui est rarement observé avec P. mâles californicus mais il est parfois observé avec P. maniculatus; observation attentive et une intervention immédiate, cependant, prévenir les dommages de se produire pour les animaux. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Une souris en Californie en interaction avec une souris jouet; les plus essayé de mâcher sur ces stimuli. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3: Dispositif expérimental de l'étude, il y avait environ 6 animaux de chaque groupe pour chaque espèce. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4: graphique des processus d'immunocytochimie. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> FigLa figure 5 réponses paternel dans la Californie et la souris sylvestre;. réponses plus paternel (marié, s'accroupir, approche plus rapide) ont été observées chez les souris en Californie. Plus étirer assiste (réponse au stress) ont été observées dans les souris sylvestres. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 6"> Figure 6. Immunoréactivité vasopressine dans différentes zones du cerveau des deux espèces. Les souris Californie avait plus de coloration dans les cellules et les fibres PVN. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3173/3173fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 7"> Figure 7: paternel souris exposées en Californie moins d'interruptions dans leurs séquences de toilettage, en présence d'une odeur de prédateurs que les groupes exposés chiot et vierge.

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<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cet article traite de trois composantes essentielles pensé pour être critique pour l&#39;exécution réussie des enquêtes comportementales neurosciences: (1) un modèle animal représentatif et valable; (2) un protocole d&#39;immunocytochimie précise et sensible, et (3) la plupart des analyses (observation et statistiques ) à la fois des données comportementales et cérébrales. Erreurs dans une seule catégorie sera très certainement compromettre les résultats de l&#39;étude. Ainsi, après avoir soigneusement le choix du modèle animal approprié, un effort considérable doit être orientée vers des essais pilotes les procédures comportementales et histologiques de s&#39;assurer que le comportement sera fiable observée dans l&#39;étude, suivi par le traitement réussi du cerveau. Comme mentionné précédemment, l&#39;utilisation d&#39;espèces comparative pour identifier les mécanismes neurobiologiques d&#39;une réponse particulière est une approche méthodologique précieux parce que cette technique ne nécessite pas de génie génétique ou douloureuses manipulations chirurgicales. Ainsi, cette approche méthodologique utilise moins menacés, les animaux intacts. L&#39;utilisation de variations naturelles des animaux, cependant, est renforcée par l&#39;incorporation des ressources naturelles-comme les environnements, même si les animaux sont logés dans le laboratoire. En outre, si les études en laboratoire peut être étendu au domaine de continuer à valider l&#39;authenticité de différences dans le comportement des espèces d&#39;intérêt, cette prochaine étape est recommandée. Bien que l&#39;approche comparative offre de nombreux avantages, une limitation est la nature des données corrélatives, par conséquent, des techniques complémentaires telles que les manipulations pharmacologiques doivent être utilisés pour valider davantage le rôle de cible systèmes neurobiologiques dans le comportement de l&#39;intérêt. Une fois les expérimentateurs se sentir confiants au sujet des procédures comportementales, histologiques et statistiques, des précautions doivent être prises afin que les conditions de vie des animaux restent constantes pour tous les groupes, sauf, bien sûr, pour la manipulation expérimentale. Les changements dans les variables telles que les horaires de lumière, le bruit, les concierges, les niveaux d&#39;humidité et les odeurs dans le laboratoire pourrait avoir des effets significatifs sur les réponses des animaux neurobiologiques. Dans cet article, l&#39;anticorps primaire a été utilisé pour la détection de la vasopressine, mais d&#39;autres anticorps primaires peuvent être utilisées pour une multitude de neurotransmetteurs différents centres d&#39;intérêt. Si l&#39;expérimentateur est de travailler avec un nouvel anticorps, il est important de mener des études de titration pour déterminer la dilution optimale de l&#39;anticorps nouveaux. Plusieurs fois, trop d&#39;anticorps est utilisé (comme suggéré par le vendeur), résultant en tissu qui est trop sombre pour distinguer le signal; encore, l&#39;utilisation excessive de l&#39;anticorps est très coûteux. Enfin, si plus d&#39;une seule analyse statistique peut être utilisée pour fournir d&#39;autres vues et les interprétations des données, ils doivent être utilisés. Dans cette étude particulière, des modèles linéaires généraux, corrélationnelles et analyse le positionnement multidimensionnel ont été utilisées pour fournir des vues les plus informative des données.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Microscope composé binoculaire </td><td> Motic </td><td> BA400 </td><td></td></tr><tr><td> BIOQUANT Software Sciences de la Vie </td><td> BIOQUANT Corporation Image Analysis </td><td> Version 8.40.20 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostat </td><td> Microm </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Masterflex console Easy Drive-Charge L / S (pompe à perfusion) </td><td> Instrument Company Cole-Parmer </td><td> 7518-00 </td><td></td></tr><tr><td> 24 Eh bien Cluster culture cellulaire (culture de tissus traités; apyrogène polystyrène; stérile) </td><td> Corning Costar </td><td> 3526 </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope 25x75x1mm </td><td> Globe Scientific, Inc </td><td> 1324W </td><td></td></tr><tr><td> Slip 22x50mm couverture No.1 </td><td> Globe Scientific, Inc </td><td> 1414-1410 </td><td></td></tr><tr><td> Non stérile 3ml Diplômé Grande pipettes de transfert Ampoule </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 70962-9 </td><td> &amp;nbps; </td></tr><tr><td> Poudre de détergent Alconox </td><td> Alconox </td><td> 1104 </td><td></td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9888-1 kg </td><td> CAS 7647-14-5 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium monobasique </td><td> Spectrum </td><td> SO130 </td><td> CAS 10049-21-5 </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium dibasique dihydraté </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 30412 </td><td> CAS 10028-24-7 </td></tr><tr><td> Triton X </td><td> Spectrum </td><td> TR135 </td><td> CAS 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Permount </td><td> Fisher </td><td> SP15-500 </td><td> CAS 108-88-3 </td></tr><tr><td> Sulfate de potassium Chrome </td><td> Sigma </td><td> C-5926 </td><td> CAS 7788-99-0 </td></tr><tr><td> CitriSolv </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-143975 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol, Bouteilles Den.Poly Haute, 200 preuve, 24 x 1 pinte </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200CSPP </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de chèvre normal </td><td> Vecteur </td><td> S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Lapin anti réactifs spécifiques d&#39;analyte vasopressine </td><td> Immunostar, Inc </td><td> 20069 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé anti-lapin IgG (H + L) purifiées par affinité </td><td> Vecteur </td><td> BA-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elite standard Vectastain ABC Kit </td><td> Vecteur </td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td> Kit DAB substrat de la peroxydase </td><td> Vecteur </td><td> SK-4100 </td><td></td></tr><tr><td> Originale de gélatine sans saveur (4-comptage des enveloppes) 1 oz boîte </td><td> Knox </td><td></td><td> Achat à l&#39;épicerie locale </td></tr><tr><td> Peroxyde d&#39;hydrogène à 3% </td><td> CareOne </td><td></td><td> Achat à la pharmacie locale </td></tr><tr><td> Javellisant </td><td> Clorox </td><td></td><td> Achat à l&#39;épicerie locale </td></tr></tbody></table>

en utilisant une approche comparative des espèces pour enquêter sur la neurobiologie des réponses paternel

Using a Comparative Species Approach to Investigate the Neurobiology of Paternal Responses

Un but de neuroscience comportementale est d&#39;identifier les facteurs sous-jacents qui régulent neurobiologiques des comportements spécifiques. En utilisant des modèles animaux pour atteindre cet objectif, plusieurs stratégies méthodologiques nécessitent des techniques invasives pour manipuler l&#39;intensité du comportement d&#39;intérêt (par exemple, les méthodes lésion, manipulations pharmacologiques, les techniques de microdialyse, des modèles animaux génétiquement modifiés). L&#39;utilisation d&#39;une approche comparative des espèces permet aux chercheurs de tirer profit des différences naturelles dans les stratégies de réponse existantes dans les espèces étroitement apparentées. Dans notre laboratoire, nous utilisons deux espèces du genre Peromyscus qui diffèrent dans les réponses paternelle. La souris sylvestre hommes Californie (Peromyscus californicus) présente les mêmes réponses des parents comme de la femelle tandis que sa cousine, la souris sylvestre commune (Peromyscus maniculatus) présente pratiquement pas de réponses nourrir / parents dans la présence de ratons. D&#39;un intérêt particulier dans cet article est une exploration des facteurs neurobiologiques liés à l&#39;affiliation des réponses sociales exposées par la souris en Californie cerfs paternelle. Parce que l&#39;approche des neurosciences comportementales est multiforme, les éléments clés suivants de l&#39;étude seront brièvement abordés: l&#39;identification des espèces appropriées pour ce type de recherche, la collecte de données pour l&#39;analyse comportementale, la préparation et le sectionnement des cerveaux; étapes de base de l&#39;immunocytochimie pour la la quantification de la vasopressine-immunoréactivité, l&#39;utilisation de logiciels de neuro-imagerie afin de quantifier le tissu cérébral, l&#39;utilisation d&#39;une analyse vidéo microséquençage au score de comportement et, enfin, les analyses statistiques appropriées pour fournir des interprétations les plus informés des résultats de recherche.

L&#39;approche comparative permet espèces neuroscientifiques comportementaux d&#39;explorer différents facteurs neurobiologiques associés à des comportements spécifiques considérés comme caractéristiques d&#39;un modèle animal spécifique. Profitant de naturellement des différences de comportement entre espèces étroitement apparentées, cette technique ne nécessite pas de techniques invasives pour manipuler l&#39;expression du comportement.

En utilisant une approche comparative des espèces pour Enquêter sur la neurobiologie des réponses paternel

L'un des objectifs des neurosciences comportementales est d'identifier les facteurs neurobiologiques sous-jacents qui régulent des comportements spécifiques. L'utilisation de modèles animaux pour parvenir à...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser une approche comparative entre espèces. Afin d'en apprendre davantage sur les régions cérébrales et les neurochimiques associées au comportement paternel, la première étape consiste à identifier deux espèces étroitement apparentées qui diffèrent significativement dans l'expression du comportement étudié. Ensuite, on permet aux deux espèces d'interagir avec les petits et d'observer leur comportement dans la réponse parentale.Échogramme eth. Ces comportements sont filmés pour une analyse ultérieure. L'étape suivante de la procédure consiste à prélever des échantillons de cerveau et à les analyser afin de détecter la présence de tissu immunoréactif à la vasopressine dans la zone ciblée.Un logiciel d'imagerie cérébrale est ensuite utilisé pour déterminer les différences propres à chaque espèce dans des régions cérébrales ciblées. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant des différences liées à l'espèce dans les réponses paternelles et l'immunoréactivité à la vasopressine dans des zones cérébrales spécifiques. Le principal avantage de l'approche comparative entre espèces, par rapport à d'autres méthodes existantes telles que les espèces modifiées pharmacologiquement ou génétiquement modifiées, est qu'elle permet d'utiliser les différences naturellement présentes entre des espèces étroitement apparentées, plutôt que de recourir à des comportements induits de manière artificielle.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les comportements paternels, elle peut également être appliquée à d'autres comportements tels que l'agressivité, le comportement sexuel ou le toilettage. Avant les tests, les souris de deux espèces étroitement apparentées sont réparties en groupes expérimentaux composés de pères biologiques, de souris vierges sans expérience parentale et de souris vierges ayant eu une exposition limitée aux petits.Tout d'abord, préparez la cage et le système d'enregistrement vidéo. Ensuite, placez un petit au centre de la cage. Une fois que tout est prêt, introduisez le mâle test dans la cage avec le petit et enregistrez le comportement pendant cinq minutes.Si des réactions agressives sont observées, retirer immédiatement le petit. Le raton laveur de Californie toilette les petits exactement comme le font les mères, en se penchant au-dessus d'eux de sorte qu'on dirait que les petits tètent. En revanche, le raton laveur commun manifeste peu d'intérêt pour les petits et tente souvent de leur échapper ou de les attaquer.Tous les groupes sont également exposés à une souris en peluche afin de s'assurer que les interactions sociales observées sont spécifiques à un petit et ne constituent pas une réponse générale. Après la période d'observation, préparez les fiches d'évaluation du comportement. S'il y a plus d'un observateur qui évaluera les vidéos.Il est important d'établir la fiabilité inter-juges. Le programme de comportement paternel présenté ici est utilisé pour évaluer les comportements. Des exemples incluent s'accroupir au-dessus des petits, toiletter les petits, ou exhiber des comportements d'anxiété tels que les réponses d'attention étirée.Le logiciel de microséquençage peut être utilisé pour révéler les subtilités entre certains comportements. Ici, les données provenant de souris cacus exposées à une odeur de prédateur servent d'exemple. Tout d'abord, regrouper les comportements en états binaires, c'est-à-dire toilettage versus non-toilettage, puis produire une série temporelle.Enfin, calculez le degré de fluctuation. En utilisant une formule prédéterminée, de nombreux comportements importants peuvent être manqués. À l’aide de techniques d’observation courantes, il est préférable d’enregistrer les comportements sur vidéo afin que les réponses puissent être visionnées au ralenti.Pour une observation plus précise, des logiciels spécialisés permettent aux chercheurs d'analyser des micro-séquences de comportements, fournissant des données qui seraient manquées par une observation humaine en temps réel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences comportementales, telles que quels systèmes neurochimiques médient des comportements spécifiques observés chez les animaux après l'exposition aux petits. Utilisez un protocole de perfusion standard pour isoler le cerveau et le congeler avant de sectionner le cerveau en mode de découpe jusqu'à ce que des repères spécifiques soient identifiés.Un atlas standard du cerveau de souris est utilisé pour localiser le noyau paraventriculaire dans l'hypothalamus, une région connue pour être riche en cellules produisant le neuropeptide vasopressine ou VP. Une fois le noyau paraventriculaire atteint, réalisez des sections de 30 microns pour une analyse ultérieure. Placez soigneusement les sections cérébrales dans des puits remplis de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Lavez les sections cérébrales avec du PBS de trois à cinq fois en plaçant les plaques sur un berceau pendant 10 minutes après l'ajout de PBS frais.Ensuite, ajoutez une solution contenant l'anticorps primaire dans les plaques et conservez-les à quatre degrés Celsius toute la nuit, puis agitez-les le jour suivant. Lavez les tranches avant d'ajouter l'anticorps secondaire. Laissez les échantillons agiter pendant une heure à température ambiante. Après un dernier lavage, exposez les tranches cérébrales à une solution de complexe adénine-biotine, qui facilite la visualisation des cellules positives aux neurochimiques.La dernière étape de la procédure de visualisation consiste à ajouter soigneusement le DAB après l'exposition au DAB. Soumettez les tranches de cerveau à une dernière série de lavages. Placez-les délicatement sur des lames d'objectif traitées et laissez-les sécher toute la nuit.Une fois séchées, passez les lames dans une série de rinçages à l'eau distillée et à l'alcool ; après le lavage, immergez la coupe dans du citrus solve. Enfin, appliquez les lamelles et rangez les lames dans une boîte pour les conserver en toute sécurité. Il existe de nombreuses méthodes pour le processus d'immunochimie.La clé du succès consiste à créer et à suivre un protocole clair. Les lames sont désormais prêtes à être analysées à l'aide d'un logiciel spécialisé de quantification neuronale. Ici, un logiciel de bioquantification est utilisé pour quantifier les cellules et fibres positives à la vasopressine dans le noyau paraventriculaire des cerveaux de souris.Utilisez l'option de mesure pour identifier la zone d'intérêt spécifique et définir le champ visuel pour la quantification neuro. Ici, les corps cellulaires et fibres immunoréactifs, fortement colorés, suppresseurs de la VA sont apparents. Utilisez la fonction de seuil de clarté du logiciel pour déterminer la quantité totale de tissu positivement coloré dans une zone spécifique.Ce seuillage nous indique la quantité de tissu positif pour la vasopressine présente. Comme on le voit ici, les mâles de Californicus passent plus de temps à se toiletter et à s'accroupir au-dessus des petits, deux caractéristiques des réponses paternelles, comparés à une espèce similaire. Une analyse par microséquençage révèle que les souris californiennes paternelles présentent moins d'interruptions dans leur séquence de toiletage par rapport aux animaux vierges.Lorsqu'ils sont exposés à une odeur de prédateur afin de déterminer si des variables neurobiologiques jouent un rôle important dans les réponses paternelles, la quantité de tissu positif pour la vasopressine est quantifiée dans plusieurs régions cérébrales pertinentes. Comme on le voit ici, les animaux paternels de l'espèce californicus présentent un tissu immunoréactif plus abondant dans plusieurs de ces régions cérébrales. En conclusion, l'approche comparative entre espèces permet d'identifier les systèmes neurobiologiques clés associés à un comportement particulier d'intérêt.Cependant, la nature des données est corrélative, il est donc important d'ajouter des techniques méthodologiques supplémentaires afin de confirmer davantage le rôle du système neurobiologique et du comportement étudié.

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