Lensless microscopie à fluorescence sur une puce

L’objectif global de cette procédure est de faire la démonstration d’une plate-forme de microscopie fluorescente sur puce sans lentille pour imager des objets fluorescents sur un champ de vision ultra large. Pour ce faire, un mince filtre d’absorption et une plaque frontale à fibre optique sont délicatement placés sur un réseau de capteurs optoélectriques, ou mousse CCDC, puis une puce microfluidique est positionnée sur la plaque frontale. Ensuite, un prisme est assemblé avec la micropuce à l’aide d’huile d’appariement d’indice.

La citation fluorescente est réalisée à travers la facette latérale d’un prisme rhomboïdal et l’éclairage holographique se fait à travers la facette supérieure du même prisme. En fin de compte, des images microscopiques à haute résolution peuvent être obtenues à partir des images fluorescentes acquises en décodant les images brutes à l’aide d’algorithmes numériques. Si nécessaire, les objets fluorescents décodés peuvent être comptés automatiquement à l’aide d’une interface développée sur mesure.

Lentille sur puce. L’imagerie en général vise à remplacer les microscopes optiques encombrants à lentille par des conceptions plus simples et plus compactes. Cette plate-forme technologique émergente a le potentiel d’éliminer le besoin de composants encombrants et coûteux grâce à l’aide de nouvelles théories et d’algorithmes de reconstruction numérique.

La liste des objectifs sur la plate-forme d’imagerie sur puce comprend plusieurs composants optiques, notamment un réseau de capteurs numériques, une source d’éclairage incohérente, un prisme, un filtre d’absorption et une plaque frontale à fibre optique, ou un cône à fibre optique. Dans cette plate-forme, différents types de réseaux de capteurs peuvent être utilisés pour la détection du signal fluorescent des micro-objets cibles. Pour les besoins de cette vidéo, un dispositif à couplage de charge sera utilisé, une source lumineuse incohérente, telle qu’une simple diode électroluminescente, est utilisée pour l’excitation de fluorescence.

Deux méthodes différentes de filtrage d’excitation sont utilisées en parallèle pour créer l’arrière-plan de fond requis, comme le montre ce schéma. Tout d’abord, un prisme de verre ou un hémisphère de verre est utilisé pour créer une réflexion interne totale ou TIR à la surface inférieure de la puce microfluidique qui héberge les échantillons d’intérêt. En parallèle, un filtre à absorption peu coûteux est utilisé pour éliminer les lumières d’excitation diffusées hebdomadaires qui n’obéissent pas au processus TIR.

Lors du rejet réussi de l’excitation à l’aide de ces deux mécanismes, seule l’émission fluorescente des échantillons est acquise dans le plan du détecteur. Malgré une telle ouverture numérique de détection, les points fluorescents bruts du réseau de capteurs deviennent assez larges pour concevoir et mieux contrôler la propagation spatiale de ce signal fluorescent. Une plaque frontale à fibre optique sera placée entre l’objet et les plans du capteur comme alternative à une plaque frontale ordinaire.

Une plaque frontale conique à fibre optique, qui a une densité de câbles à fibre optique nettement plus grande sur sa face supérieure par rapport à la facette inférieure, peut être utilisée pour une imagerie à plus haute résolution grâce au grossissement. Les puces microfluidiques utilisées dans cette plate-forme sont fabriquées à l’aide de parois en polydiméthyl Sloane placées sur des lames de verre pour créer les micro-canaux nécessaires à l’imagerie sur puce pour commencer l’assemblage de la plate-forme d’imagerie sur puce sans terre. Tout d’abord, retirez la vitre de protection du réseau de capteurs optoélectroniques à l’aide d’un stylo à vide, placez doucement un mince filtre d’absorption sur le dessus de la zone active du détecteur.

Placez une plaque frontale à fibre optique sur le dessus de ce filtre d’absorption. Placez ensuite la puce microfluidique fabriquée directement sur le réseau de fibres optiques. Ensuite, un prisme de verre est assemblé au-dessus de la puce microfluidique en utilisant l’indice d’adaptation de l’huile de sorte que l’indice de réfraction de l’interface soit adapté à l’indice de réfraction du verre.

Connectez les sources lumineuses aux câbles à fibres optiques à l’aide de connecteurs FC. L’un des aspects les plus difficiles de cette procédure est l’alignement des composants. Alignez soigneusement les distances entre les composants, la position et l’angle de l’éclairage.

Enfin, rapprochez la fibre d’éclairage latéral du prisme et ajustez son angle pour vous assurer qu’une réflexion interne totale se produit à l’interface verre-air correspondant aux puces microfluidiques. Le substrat inférieur, diverses cellules ou de petits modèles animaux peuvent être imagés à l’aide de cette plate-forme sur puce, mais les globules blancs seront imagés pour les besoins de cette démonstration. Pour marquer les globules blancs avec un colorant fluorescent, mélangez d’abord environ 100 microlitres de sang total avec environ un millilitre de tampon ascendant de globules rouges, incubez pendant environ trois minutes à température ambiante, puis centrifugez la solution de sang de mensonges.

Après avoir retiré la couche supérieure à l’aide d’une micropipette, mettez à nouveau la couche de pastilles en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate pour marquer l’acide nucléique des cellules avec un colorant fluorescent, ajoutez SYTO 16 à la suspension résuscite, puis incubez l’échantillon pendant environ 30 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Après 30 minutes, centrifugez l’échantillon étiqueté. Retirez le supinate pour diminuer le bruit de fond dû à l’émission fluorescente des colorants non liés.

Reese a courbé la couche de pastilles de globules blancs dans environ cinq millilitres de PBS. L’échantillon est maintenant prêt à être chargé dans la puce microfluidique pour l’imagerie fluorescente sans lentille sur puce. Avant d’imager les globules blancs, la plateforme d’imagerie doit être calibrée à l’aide de microbilles fluorescentes.

Préparez l’échantillon de microbilles diluées à l’aide d’eau désionisée et d’une solution de billes brutes. À l’aide d’une seringue à aiguille pointue. Injectez ce premier échantillon dans la puce microfluidique par le côté des parois du PDMS.

Après avoir assemblé les composants pour réaliser une imagerie fluorescente sur puce, acquérez des images brutes de billes fluorescentes à l’aide de l’interface de vue de laboratoire développée sur mesure via un ordinateur. Assurez-vous qu’il y a au moins 20 images de billes fluorescentes isolées sur tout le champ de vision. Enregistrez les données d’étalonnage, qui seront utilisées ultérieurement pour calibrer et extraire la fonction d’étalement du point de la plate-forme de microscopie fluorescente sans lentille.

Retirez la puce microfluidique contenant l’échantillon de bille fluorescente et détachez le prisme de cette puce. Injectez l’échantillon de globules blancs préalablement préparé dans une autre puce microfluidique inutilisée sur le côté des parois du PDMS. A Assemblez à nouveau les composants dans les mêmes conditions expérimentales, notamment en ce qui concerne les distances et la puissance d’excitation.

Acquérez les images brutes des globules blancs à l’aide de la vue de laboratoire personnalisée avec les mêmes paramètres logiciels que ceux utilisés pour les microbilles fluorescentes. Les données d’étalonnage et les images brutes des globules blancs sont ensuite utilisées pour créer des images à plus haute résolution dans MATLAB grâce au traitement numérique. Les résultats représentatifs de l’imagerie fluorescente sur puce à lentille à grand champ d’un mélange contenant des particules fluorescentes vertes de quatre microns et 10 microns sont présentés ici à des fins de comparaison, microscope 10 x.

Des images objectives sont également fournies, qui s’accordent bien avec les images moins fluorescentes de l’objectif présentées. Ensuite, les résultats d’une lentille à grand champ, moins d’imagerie fluorescente d’un mélange contenant des particules fluorescentes vertes de 10 microns et rouges de 10 microns. Les images fluorescentes sans lentille offrent une correspondance décente avec les images objectives 10 x microscope des mêmes échantillons.

Cette figure fournit une comparaison des performances de la déconvolution Lucy Richardson et de l’échantillonnage compressif basé sur des algorithmes de décodage pour l’imagerie de diverses paires de billes de 10 microns. La rangée du haut illustre les images fluorescentes brutes sans lentille dans lesquelles les images encastrées montrent les comparaisons au microscope des mêmes particules qui sont requises avec une lentille d’objectif 10x. La rangée du milieu montre les résultats du décodage compressif tandis que la rangée du bas illustre les résultats de la déconvolution de Lucy Richardson : DDCS et DLR se réfèrent respectivement aux distances centre à centre et aux images de microscope, aux images d’objectif décodées CS et aux images LR de lentille alvéolée.

Ensuite, le traitement numérique de l’objectif, des images brutes moins fluorescentes sont illustrées. Un algorithme basé sur l’échantillonnage compressif est utilisé pour obtenir une résolution spatiale inférieure à quatre microns en résolvant des paires de billes de deux microns de diamètre. Les encarts montrent des comparaisons d’objectifs de microscope 40x, qui s’accordent très bien avec les images fluorescentes décodées.

Ici, D fait référence aux distances centre à centre dans les images microscope. Alors que DCS fait référence aux distances centre à centre dans l’objectif décodé CS, les images sont moins fluorescentes. Cette figure montre les résultats de l’imagerie sans lentille de globules blancs marqués par fluorescence.

Les images brutes sans lentille sont rapidement décodées à l’aide d’un décodeur basé sur CS, ce qui s’accorde très bien avec une image de microscope conventionnelle du même échantillon acquise avec un objectif 10 x. En plus de l’imagerie si nécessaire, les objets fluorescents décodés peuvent également être comptés automatiquement à l’aide d’une interface développée sur mesure pour les applications de cytométrie sur puce. Nous venons de démontrer la procédure de microscopie fluorescente sans terre de cellules marquées et de micro-battements sur un champ de vision de huit centimètres carrés.

Une telle plate-forme d’imagerie de vaisseau comparée avec le décodeur compressif rapide derrière. Il sera assez variable pour la cytométrie à haut débit, l’analyse micro-rare et les applications de recherche cellulaire réelles.