Étude du cytosquelette d'actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

L'objectif de cette procédure est d'observer les changements dynamiques du cytosquelette d'actine dans des cellules endothéliales vivantes. Transfectez d'abord des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine avec un plasmide d'actine bêta GFP, puis cultivez-les jusqu'à confluence sur des lamelles. Ensuite, placez les lamelles dans une chambre d'imagerie de cellules vivantes équipée d'un plateau chauffant et d'une perfusion de solution physiologique à l'albumine.

La dernière étape consiste en l'acquisition de données d'une zone sélectionnée de cellules par une capture d'images en laps de temps avant et après traitement avec un agent pharmacologique. L'analyse du graphique chime à l'aide d'un logiciel d'imagerie tel qu'Image J peut fournir des informations sur les protrusions locales de lamellipodes, telles que la distance, le temps et la vitesse des protrusions, ainsi que le mouvement des fibres actines au fil du temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l'imagerie en immunofluorescence est que l'imagerie de cellules vivantes permet d'intégrer la nature dynamique de l'actine et du cytosquelette dans l'étude des mécanismes régulant la perméabilité endothéliale.

Alors que les cellules fixées colorées représentent des instantanés dans le temps et fournissent peu d'informations sur la dynamique de l'actine et du cytosquelette avant et après traitement avec un médiateur inflammatoire dans une hotte de sécurité biologique. Stérilisez les lamelles avec de l'éthanol à 70 % pendant deux minutes, puis laissez-les sécher à l'air. Placez chaque lamelle dans une plaque de culture de 10 centimètres et ajoutez 300 microlitres de solution chaude de gélatine au centre sans toucher les bords de la lamelle. Après cinq minutes, aspirez le liquide.

Récoltez maintenant une culture confluente de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou de VE avec de la trypsine-EDTA à 0,25 %. Comptez les cellules et concentrez-les par centrifugation. Aspirez autant que possible le milieu SUP natum pour une réaction de transfection avec le kit d'effecteur nucléaire VE.

Résuspendre les culots cellulaires dans une solution basique d'effecteur nucléaire et ajouter de 0,2 à deux microgrammes de plasmide du vecteur GFP bêta-actine. Transférer 100 microlitres de suspension cellulaire dans une cuve d'effecteur nucléaire qve. Tapoter la vete couverte plusieurs fois pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles entre le fond de la Q vet et l'échantillon de transfection.

Placer le Q VET dans le dispositif nucléaire effecteur deux et exécuter le programme A 0 3 4 en utilisant une pipette de transfert du kit nucléaire effecteur pour transférer un quart chauffé de 500 microlitres de milieu EGM deux MV vers le qve. Ensuite, transférer le mélange dans le tube microfuge et incuber pendant 15 minutes. Mélanger délicatement la suspension VE transfectée une fois et semer 300 microlitres de suspension sur un lamelle recouvert de gélatine sans toucher les bords.

Incuber ensuite pendant une à quatre heures. Examiner les cellules transfectées pour confirmer leur adhérence au lamelle. Ajouter ensuite 10 millilitres de milieu E GM two MV dans la plaque et poursuivre l'incubation pour permettre l'expression de la GFP.

Tout d'abord, ajoutez un milieu de solution saline physiologique contenant de l'albumine ou une solution saline tamponnée (PSS) au système d'écoulement par gravité et connectez-le au réchauffeur en ligne. Réglez ensuite le régulateur de débit pour obtenir un débit d'environ 40 millilitres par heure. Arrêtez ensuite l'écoulement en fermant le robinet à tournant à l'aide d'un applicateur muni d'un embout en coton.

Appliquer de la graisse à vide sur le bord extérieur de la face inférieure du bain en diamant. Retirer maintenant une culture transfectée de l'incubateur. Soulever délicatement le lamelle à l’aide de pinces.

Ensuite, à l’aide d’un essuie-tout Kim, absorbez l’excès de milieu EGM two MV sur la lame inférieure, en positionnant la face des cellules vers le haut. Placez le bain en diamant par-dessus la lamelle afin de former une chambre. Insérez rapidement la chambre dans le réchauffeur de platine.

Serrer les pinces sur la chambre et pipeter environ un millilitre de milieu EGM two MV depuis la plaque dans la chambre. Fixer ensuite le tuyau de vide à son support situé sur le côté gauche de la chambre et la ligne A PSS issue du réchauffeur en ligne dans le canal situé sur le côté droit de la chambre. Enclencher alors le vide et ouvrir la ligne A PSS pour permettre la perfusion du bain sur les cellules transfectées.

Activez également le chauffage intégré à 37 degrés Celsius. Ensuite, placez la sonde thermistor du plateau chauffant dans le bain, en bordure, et activez le chauffage du plateau à 37 degrés Celsius. Pour éliminer tout résidu de milieu EGM deux MV et les accumulations, essuyez soigneusement la face inférieure de la lame couvre-objet à l’aide d’un essuie-tout Kim imbibé d’éthanol à 70 %, puis avec un essuie-tout Kim sec. Équilibrez les cellules HU transfectées pendant 30 minutes.

Verrouillez le réglage grossier. Mettez au point sur la zone sélectionnée des cellules en culture à étudier. Réglez le temps d'exposition de la caméra entre 0,5 et deux secondes, selon l'intensité du signal GFP Actin dans les cellules.

Réglez également les intervalles et les durées pour l'expérience. Maintenant, avec les lumières de la pièce éteintes, capturez une image unique afin d'évaluer les paramètres. Enregistrez la série temporelle en surveillant les images au fur et à mesure de leurs besoins.

Dans un protocole typique, obtenir 20 à 30 minutes d'images de base avant d'ajouter un agent test, suivies de 0,5 à quatre heures d'acquisition d'images supplémentaires. Enfin, comme décrit dans le texte accompagnant, évaluer la distance de protrusion des lamellipodes, la persistance et la vitesse par analyse des graphiques CH. Dans une expérience typique, l'actine GFP est exprimée dans plus de 50 % des VE transfectées de manière aléatoire.

Ces images acquises une fois par minute ont capturé l'actine GFP dans tout le cytoplasme, ainsi que dans des structures filamenteuses et dans des protrusions locales de lamellipodes le long du bord cellulaire. La persistance de la distance et la vitesse des protrusions cellulaires sont quantifiées à partir de séries d'images en laps de temps. À l'aide de l'analyse de graphes chm, une ligne d'un seul pixel est d'abord tracée approximativement perpendiculairement au bord de la cellule.

Cette région est extraite de chaque image de la série temporelle afin de générer un montage de la région dans le temps ou un graphique en cloche. Dans le graphique en cloche, vu de gauche à droite, les protrusions sont représentées par des mouvements vers le haut au niveau du bord de la cellule. Lorsqu'une ligne est superposée au bord de l'une de ces protrusions, les données en pixels associées à cette ligne peuvent être recueillies afin de quantifier la dynamique des protrusions. Le nombre total de protrusions dans un graphique en cloche peut être utilisé pour estimer la fréquence des protrusions.

Cette analyse illustre les mouvements des fibres de stress formées près de la périphérie cellulaire et se déplaçant vers le centre de la cellule, où elles finissent par se désassembler. Sur le graphique chio, les fibres de stress apparaissent comme des lignes continues dans la zone cytoplasmique, se déplaçant souvent vers le bas et vers la droite en direction du centre cellulaire. Lorsque les fibres sont difficiles à distinguer sur le graphique chio d'origine, le filtre de masque flou accentue les lignes de l'image ; les lignes tracées sur les fibres de stress facilitent la collecte des données de pixels à l’aide de la fonction de mesure. En alternative, des lignes sont tracées depuis le début jusqu’à la fin de la fibre de stress identifiée, permettant d’obtenir une moyenne pondérée des données de pixels pendant toute la durée d’observation de la fibre.

Cette présentation a montré comment analyser les données provenant du jeu d'images en prise de vue instantanée par analyse graphique à l'aide de logiciels tels qu'ImageJ. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier la dynamique du cytosquelette d'actine en réponse à des médiateurs inflammatoires en utilisant l'imagerie de cellules endothéliales transfectées vivantes.