Name: Étude du cytosquelette dactine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez l'imagerie en cellules vivantes pour étudier la dynamique du cytosquelette d'actine dans les cellules endothéliales exprimant la GFP-actine. Cette méthode permet d'analyser en temps réel les changements cytosquelettiques et la perméabilité endothéliale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Le plasmide GFP-β-actine a été généreusement fourni par le Dr Wayne Orr, LSUHSC-S Département de pathologie, et a été amplifié dans le laboratoire du Dr Becky Worthylake, LSUHSC-NO Département de pharmacologie. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (P20 RR-018 766) et l&#39;American Heart Association (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

L&#39;imagerie de la GFP-actine dans les cellules endothéliales en direct permet une analyse détaillée de la dynamique du cytosquelette d&#39;actine en réponse aux stimuli inflammatoires. Cette méthode peut également être utile de s&#39;appuyer sur les conclusions antérieures montrant remodelage du cytosquelette en réponse aux forces physiques comme la contrainte de cisaillement 11. En outre, cette méthode permet une évaluation détaillée de la contribution de la dynamique de l&#39;actine du cytosquelette à diverses activités de la cellule endothéliale, y compris la migration, la mitose, la formation des jonctions intercellulaires et la maturation jonctionnelle, et le maintien de la fonction de barrière. Dans les données présentées, le comportement du cytosquelette d&#39;actine endothéliales peuvent être observées avant et après traitement par la thrombine. Lamellipodes locale tout au long des bords des cellules endothéliales ont été observées former et régresse au fil du temps dans les monocouches de cellules à la fois nonconfluent et confluentes. Le traitement par la thrombine brièvement interrompu la forme lamellipodesation et le chiffre d&#39;affaires. La thrombine a également causé des cellules de se contracter légèrement, en accord avec les précédents rapports que la thrombine provoque la formation de fibres d&#39;actine stress et les tensions centripètes développement accru dans les cellules endothéliales 12-14. Cependant, à partir des études d&#39;imagerie des cellules vivantes de ce genre, l&#39;origine des fibres de stress peuvent désormais être déterminé. En HUVEC, la plupart des fibres de stress proviennent à la périphérie des cellules et des fibres ressemblent à l&#39;arc dans la migration de cellules transversales 8, 9. Une autre force de cette méthode sur l&#39;utilisation de cellules fixes est que le nombre de fibres de stress peuvent être quantifiés dans des cellules individuelles avant et après traitement de thrombine, en éliminant les biais de sélection entre les groupes expérimentaux. Avec ce protocole, nous évaluons le mouvement dynamique de la bordure des cellules et des fibres de stress d&#39;actine. Pour comprendre la dynamique de monomère d&#39;actine dans les cellules endothéliales, des techniques plus avancées telles que le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ou de fluorescence speckle microscopie (FSM) peut être appliquée 15, 16. En outre, parce cellules endothéliales microvasculaires peuvent représenter un meilleur modèle de la fonction de barrière microvasculaire, l&#39;optimisation des protocoles de transfection pour exprimer efficacement GFP-actine dans les cellules endothéliales microvasculaires représente une direction future logique. En résumé, l&#39;imagerie des cellules vivantes endothéliales exprimant la GFP-actine représente un outil puissant pour déterminer comment le cytosquelette d&#39;actine des cellules endothéliales répond à différents types de stimuli. Des études utilisant des monocouches confluentes étroitement endothéliales aideront à déterminer les rôles des structures dynamiques telles que l&#39;actine riches lamellipodes et transversale des fibres de stress d&#39;arc en fonction de la barrière endothéliale. En outre, imagerie des cellules vivantes des cellules endothéliales exprimant la GFP-actine ou d&#39;autres protéines de fusion qui permettent de visualiser d&#39;autres structures subcellulaires fournira des informations détaillées spatio-temporelle nécessaire pour comprendre la signalisation et les mécanismes structurels qui dintégrité de la barrière éterminer.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Ringer stock 5x </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Chlorure de Potassium </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Sulfate de magnésium </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. Tampon MOPS </td></tr><tr><td> Chimique </td><td>Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. L&#39;albumine du sérum physiologique (APSS) </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Ringer stock (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Tampon MOPS </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Phosphate de sodium </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> Sel de sodium EDTA </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Le glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> L&#39;albumine, bovine </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Ajuster le pH à 7,4 à 37 ° C, puis filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et conserver à 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. Saline à 0,9% </td></tr><tr><td> Chimique </td><td> Société </td><td> Nombre de catalogue </td><td> Montant </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Stérile eau filtrée </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et les magasins à 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% une solution de gélatine </td></tr><tr><td> Gélatine de la peau de porc </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> Saline à 0,9% </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Porter à 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Chauffer la solution à 37 ° C pour dissoudre la gélatine suffisamment. Alors qu&#39;il était encore chaud, filtre stérile dans des flacons à l&#39;autoclave et conserver à 4 ° C </td></tr></tbody></table>

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la gfp-actine

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

L&#39;endothélium microvasculaire joue un rôle important comme une barrière sélective perméable aux fluides et des solutés. Les jonctions d&#39;adhérence entre les cellules endothéliales régulation de la perméabilité de l&#39;endothélium, et de nombreuses études ont montré la contribution importante du cytosquelette d&#39;actine à la détermination de l&#39;intégrité jonctionnelle 1-5. Une ceinture d&#39;actine corticale est pensé pour être important pour le maintien de la stabilité des jonctions 1, 2, 4, 5. En revanche, les fibres de stress d&#39;actine sont censés générer des tensions centripètes dans les cellules endothéliales qui affaiblit les jonctions 2-5. Une grande partie de cette théorie a été basée sur des études dans lesquelles les cellules endothéliales sont traités avec des médiateurs inflammatoires connus pour augmenter la perméabilité endothéliale, puis fixer les cellules et l&#39;étiquetage de F-actine à l&#39;observation microscopique. Cependant, ces études fournissent une compréhension très limitée du rôle du cytosquelette d&#39;actine, car des images de cellules fixes fournissent des instantanés seulement danstemps avec aucune information sur la dynamique des structures d&#39;actine 5. Imagerie des cellules vivantes permet l&#39;incorporation de la nature dynamique du cytosquelette d&#39;actine dans les études des mécanismes de détermination intégrité de la barrière endothéliale. Un avantage majeur de cette méthode est que l&#39;impact de divers stimuli inflammatoires sur les structures d&#39;actine dans les cellules endothéliales peuvent être évalués dans le même ensemble de cellules vivantes avant et après traitement, en supprimant le biais potentiel pouvant survenir lors de l&#39;observation des échantillons fixés. Les cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) sont transfectées avec GFP-β une actine plasmide et cultivées jusqu&#39;à confluence sur lamelles de verre. Time-lapse images de GFP-actine dans confluentes HUVEC sont capturés avant et après l&#39;ajout de médiateurs inflammatoires qui provoquent des changements dépendant du temps dans l&#39;intégrité de barrière endothéliale. Ces études permettent une observation visuelle de la séquence fluide de changements dans le cytosquelette d&#39;actine qui contribuent à des endothéliumsrupture de la barrière l et de restauration. Nos résultats montrent constamment locale, riche en actine formation de lamellipodes et le roulement dans les cellules endothéliales. La formation et le mouvement des fibres de stress d&#39;actine peuvent également être observés. Une analyse de la fréquence de la formation et la rotation de la section locale lamellipodes, avant et après traitement avec des stimuli inflammatoires peuvent être documentés par des analyses kymographe. Ces études fournissent des informations importantes sur la nature dynamique du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales qui peuvent servir à découvrir les mécanismes moléculaires non identifiés auparavant important pour le maintien de l&#39;intégrité barrière endothéliale.

Imagerie microscopique des cellules endothéliales direct exprimant la GFP-actine permet la caractérisation des changements dynamiques dans les structures du cytosquelette. Contrairement aux techniques qui utilisent des échantillons fixés, cette méthode fournit une évaluation détaillée des changements temporels dans le cytosquelette d&#39;actine dans les mêmes cellules, avant, pendant, et après divers stimuli physiques, pharmacologiques ou inflammatoires.

Étude du cytosquelette d&#39;actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

L'endothélium microvasculaire joue un rôle important en tant que barrière sélectivement perméable aux fluides et aux solutés. Les jonctions adhérentes entre les cellules endothéliales...

L'objectif de cette procédure est d'observer les changements dynamiques du cytosquelette d'actine dans des cellules endothéliales vivantes. Transfectez d'abord des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine avec un plasmide d'actine bêta GFP, puis cultivez-les jusqu'à confluence sur des lamelles. Ensuite, placez les lamelles dans une chambre d'imagerie de cellules vivantes équipée d'un plateau chauffant et d'une perfusion de solution physiologique à l'albumine.La dernière étape consiste en l'acquisition de données d'une zone sélectionnée de cellules par une capture d'images en laps de temps avant et après traitement avec un agent pharmacologique. L'analyse du graphique chime à l'aide d'un logiciel d'imagerie tel qu'Image J peut fournir des informations sur les protrusions locales de lamellipodes, telles que la distance, le temps et la vitesse des protrusions, ainsi que le mouvement des fibres actines au fil du temps. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l'imagerie en immunofluorescence est que l'imagerie de cellules vivantes permet d'intégrer la nature dynamique de l'actine et du cytosquelette dans l'étude des mécanismes régulant la perméabilité endothéliale.Alors que les cellules fixées colorées représentent des instantanés dans le temps et fournissent peu d'informations sur la dynamique de l'actine et du cytosquelette avant et après traitement avec un médiateur inflammatoire dans une hotte de sécurité biologique. Stérilisez les lamelles avec de l'éthanol à 70 % pendant deux minutes, puis laissez-les sécher à l'air. Placez chaque lamelle dans une plaque de culture de 10 centimètres et ajoutez 300 microlitres de solution chaude de gélatine au centre sans toucher les bords de la lamelle. Après cinq minutes, aspirez le liquide.Récoltez maintenant une culture confluente de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ou de VE avec de la trypsine-EDTA à 0,25 %. Comptez les cellules et concentrez-les par centrifugation. Aspirez autant que possible le milieu SUP natum pour une réaction de transfection avec le kit d'effecteur nucléaire VE.Résuspendre les culots cellulaires dans une solution basique d'effecteur nucléaire et ajouter de 0,2 à deux microgrammes de plasmide du vecteur GFP bêta-actine. Transférer 100 microlitres de suspension cellulaire dans une cuve d'effecteur nucléaire qve. Tapoter la vete couverte plusieurs fois pour s'assurer qu'il n'y a pas de bulles entre le fond de la Q vet et l'échantillon de transfection.Placer le Q VET dans le dispositif nucléaire effecteur deux et exécuter le programme A 0 3 4 en utilisant une pipette de transfert du kit nucléaire effecteur pour transférer un quart chauffé de 500 microlitres de milieu EGM deux MV vers le qve. Ensuite, transférer le mélange dans le tube microfuge et incuber pendant 15 minutes. Mélanger délicatement la suspension VE transfectée une fois et semer 300 microlitres de suspension sur un lamelle recouvert de gélatine sans toucher les bords.Incuber ensuite pendant une à quatre heures. Examiner les cellules transfectées pour confirmer leur adhérence au lamelle. Ajouter ensuite 10 millilitres de milieu E GM two MV dans la plaque et poursuivre l'incubation pour permettre l'expression de la GFP.Tout d'abord, ajoutez un milieu de solution saline physiologique contenant de l'albumine ou une solution saline tamponnée (PSS) au système d'écoulement par gravité et connectez-le au réchauffeur en ligne. Réglez ensuite le régulateur de débit pour obtenir un débit d'environ 40 millilitres par heure. Arrêtez ensuite l'écoulement en fermant le robinet à tournant à l'aide d'un applicateur muni d'un embout en coton.Appliquer de la graisse à vide sur le bord extérieur de la face inférieure du bain en diamant. Retirer maintenant une culture transfectée de l'incubateur. Soulever délicatement le lamelle à l’aide de pinces.Ensuite, à l’aide d’un essuie-tout Kim, absorbez l’excès de milieu EGM two MV sur la lame inférieure, en positionnant la face des cellules vers le haut. Placez le bain en diamant par-dessus la lamelle afin de former une chambre. Insérez rapidement la chambre dans le réchauffeur de platine.Serrer les pinces sur la chambre et pipeter environ un millilitre de milieu EGM two MV depuis la plaque dans la chambre. Fixer ensuite le tuyau de vide à son support situé sur le côté gauche de la chambre et la ligne A PSS issue du réchauffeur en ligne dans le canal situé sur le côté droit de la chambre. Enclencher alors le vide et ouvrir la ligne A PSS pour permettre la perfusion du bain sur les cellules transfectées.Activez également le chauffage intégré à 37 degrés Celsius. Ensuite, placez la sonde thermistor du plateau chauffant dans le bain, en bordure, et activez le chauffage du plateau à 37 degrés Celsius. Pour éliminer tout résidu de milieu EGM deux MV et les accumulations, essuyez soigneusement la face inférieure de la lame couvre-objet à l’aide d’un essuie-tout Kim imbibé d’éthanol à 70 %, puis avec un essuie-tout Kim sec. Équilibrez les cellules HU transfectées pendant 30 minutes.Verrouillez le réglage grossier. Mettez au point sur la zone sélectionnée des cellules en culture à étudier. Réglez le temps d'exposition de la caméra entre 0,5 et deux secondes, selon l'intensité du signal GFP Actin dans les cellules.Réglez également les intervalles et les durées pour l'expérience. Maintenant, avec les lumières de la pièce éteintes, capturez une image unique afin d'évaluer les paramètres. Enregistrez la série temporelle en surveillant les images au fur et à mesure de leurs besoins.Dans un protocole typique, obtenir 20 à 30 minutes d'images de base avant d'ajouter un agent test, suivies de 0,5 à quatre heures d'acquisition d'images supplémentaires. Enfin, comme décrit dans le texte accompagnant, évaluer la distance de protrusion des lamellipodes, la persistance et la vitesse par analyse des graphiques CH. Dans une expérience typique, l'actine GFP est exprimée dans plus de 50 % des VE transfectées de manière aléatoire.Ces images acquises une fois par minute ont capturé l'actine GFP dans tout le cytoplasme, ainsi que dans des structures filamenteuses et dans des protrusions locales de lamellipodes le long du bord cellulaire. La persistance de la distance et la vitesse des protrusions cellulaires sont quantifiées à partir de séries d'images en laps de temps. À l'aide de l'analyse de graphes chm, une ligne d'un seul pixel est d'abord tracée approximativement perpendiculairement au bord de la cellule.Cette région est extraite de chaque image de la série temporelle afin de générer un montage de la région dans le temps ou un graphique en cloche. Dans le graphique en cloche, vu de gauche à droite, les protrusions sont représentées par des mouvements vers le haut au niveau du bord de la cellule. Lorsqu'une ligne est superposée au bord de l'une de ces protrusions, les données en pixels associées à cette ligne peuvent être recueillies afin de quantifier la dynamique des protrusions. Le nombre total de protrusions dans un graphique en cloche peut être utilisé pour estimer la fréquence des protrusions.Cette analyse illustre les mouvements des fibres de stress formées près de la périphérie cellulaire et se déplaçant vers le centre de la cellule, où elles finissent par se désassembler. Sur le graphique chio, les fibres de stress apparaissent comme des lignes continues dans la zone cytoplasmique, se déplaçant souvent vers le bas et vers la droite en direction du centre cellulaire. Lorsque les fibres sont difficiles à distinguer sur le graphique chio d'origine, le filtre de masque flou accentue les lignes de l'image ; les lignes tracées sur les fibres de stress facilitent la collecte des données de pixels à l’aide de la fonction de mesure. En alternative, des lignes sont tracées depuis le début jusqu’à la fin de la fibre de stress identifiée, permettant d’obtenir une moyenne pondérée des données de pixels pendant toute la durée d’observation de la fibre.Cette présentation a montré comment analyser les données provenant du jeu d'images en prise de vue instantanée par analyse graphique à l'aide de logiciels tels qu'ImageJ. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier la dynamique du cytosquelette d'actine en réponse à des médiateurs inflammatoires en utilisant l'imagerie de cellules endothéliales transfectées vivantes.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Sélection, la microinjection, et l'imagerie de fluorescence étiqueté F-actine fluorescente via chatoiement de microscopie (FSM).

Imagerie de cellules vivantes de la F-actine fluorescente Dynamics via chatoiement de microscopie (FSM)

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

Ce document vise à instruire le lecteur dans le fonctionnement d'un système intégré à force atomique, microscope optique d'imagerie pour la stimulation mécanique des cellules vivantes en culture. Un protocole étape par étape est présentée. Un ensemble représentatif de données qui montre la réponse de cellules vivantes à la stimulation mécanique est présenté.

Réponse Live Cell à la stimulation mécanique étudiée par microscopie à force atomique et optique intégré

Une méthode de visualiser et de quantifier la F-actine se termine barbelés dans les cônes de croissance neuronale est décrite. Après les neurones en culture sur des lamelles en verre, les cellules sont perméabilisées avec une solution contenant de la saponine. Ensuite, une courte incubation avec le tampon de la saponine contenant rhodamine-actine intègre actine fluorescente sur l'actine se termine sans barbelés.

Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

L’immunité adaptative est contrôlée par des 'synapses immunologiques' dynamiques formées entre les lymphocytes T et les cellules présentatrices d’antigènes. Ce protocole décrit des méthodes d’étude des cellules endothéliales à la fois en tant qu’APC physiologiques sous-étudiées et en tant que nouveau type de « modèle d’APC cellulaire planaire ».

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Combinant des approches de transplantation cellulaire, de marquage cytosquelettique et de perte/gain de fonction, ce protocole décrit comment la plaque préchordale prospective du poisson-zèbre en migration peut être utilisée pour analyser la fonction d’un gène candidat dans la migration cellulaire in vivo.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Début endosome fonctions dépendent de la polymérisation de l’actine-F. Nous décrivons ici une analyse axée sur la microscopie in vitro qui reconstitue la nucléation et la polymérisation de l’actine F sur les membranes endosomale précoce dans des éprouvettes, rendant ainsi cette série complexe de réactions se prêtent à biochimiques et génétiques manipulations.

In Vitro Polymérisation de l’actine F sur Endosomes précoces

Les auteurs décrivent comment les techniques micro - et photomanipulation comme FRAP et photoactivation permettent la détermination des paramètres de la motilité et la dynamique spatio-temporelle des protéines au sein de la migration des cellules. Afficheurs expérimentales incluent dynamique subcellulaire et chiffre d’affaires de régulateurs de la motilité ou du cytosquelette d’actine sous-jacent.

Techniques de micromanipulation permettant l’analyse de la dynamique morphogénétique et chiffre d’affaires des organismes de réglementation du cytosquelette

Ce protocole vise à mesurer les paramètres dynamiques (protubérances, rétractions, volants) des protubérances au bord des cellules étalées.

Mesure de la dynamique de la saillie du bord cellulaire pendant la propagation à l’aide de la microscopie à cellules vivantes

Nous présentons des protocoles pour des tests microfluidiques de filaments d’actine simples, en combinaison avec la microscopie à fluorescence, qui permettent de surveiller avec précision les filaments d’actine individuels en temps réel tout en les exposant séquentiellement à différentes solutions protéiques.

Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Découvrez l'imagerie en cellules vivantes pour étudier la dynamique du cytosquelette d'actine dans les cellules endothéliales exprimant la GFP-actine. Cette méthode permet d'analyser en temps réel les changements cytosquelettiques et la perméabilité endothéliale.

Étude du cytosquelette d'actine dans les cellules endothéliales en direct exprimant la GFP-actine

Explorer plus de vidéos