Name: Transformation des cercaires et In vitro Culture de Schistosoma mansoni Schistosomules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Apprenez à transformer des cercaires infectieux en schistosomules non infectieux de Schistosoma mansoni à l'aide d'une aiguille double. Cette méthode de culture in vitro permet d'étudier la biologie du parasite responsable de la schistosomiase.

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Ce projet a été financé par des fonds Case Western Reserve University de démarrage fournis à E. Jolly. Escargots infectés ont été fournies par le Centre de ressources Schistosome, NIH-NIAID (NIAID Marché n HHSN272201000009I). Nous remercions également Chris King et Ronald Blanton pour le soutien à la sécurisation des escargots infectés de schistosomes et pour des discussions utiles.

Mesures de sécurité: Cercaires de schistosomes peuvent directement pénétrer la peau sans les besoins d'une coupure ou pores et provoquer la schistosomiase maladies chroniques. S. mansoni est un niveau de biosécurité 2 organisme, donc un équipement de protection individuelle et des mesures de sécurité appropriées doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des cercaires infectantes. La plupart des équipements nécessaires à la croissance et à transformer les schistosomes est standard, à quelques exceptions près clés indiqués dans le tableau à la fin du protocole. Tous les travaux des cercaires devrait être fait dans une pièce isolée. Schistosomules doivent être cultivées dans un récipient stérile, la biosécurité approuvé le capot. Deux couches de nitrile ou des gants en latex doivent être portés, tout comme une blouse, une paire de chaussures imperméables, pantalons avec des trous ou de déchirures, et les protecteurs manches étanches pour vos poignets et des bras. En cas de déversement accidentel, pulvériser immédiatement zone contaminée avec de l'éthanol à 70% ou eau de Javel à 10%, frottant vigoureusement si sur votre personne.Ce sera suffisant pour désactiver le parasite, mais toutes les infections possibles doivent être signalés et pris au sérieux. Bien que schistosomules ne sont pas naturellement infectieux, directives institutionnelles varient et doivent être consultées pour déterminer si BSL2 précautions sont nécessaires lors des étapes de la vie non infectieuses. Désinfectez toutes les surfaces qui entrent en contact avec une substance potentiellement infectieux après l'expérience est effectuée et jeter les déchets dans un contenant approuvé biohazard. REMARQUE: bacs de couverture escargot hôte 1 à 2 jours avant la mue et protègent de la lumière 1. La récolte des cercaires de l'escargot hôte <ol><li> Remplir un gobelet propre et libre de 500mL détergents à mi-chemin plein avec de l'eau distillée équilibrés à température ambiante. Si vous travaillez avec des escargots hôtes infectées par miracidiums à des dates différentes, utiliser un bécher séparé pour chaque date d'infection (Ceci est particulièrement important si les escargots seront réutilisées pour future expériences). La taille du gobelet peut aussi être inférieur en fonction de l'expérience de l'utilisateur. </li><li> Recueillir des mollusques hôtes infectés que vous souhaitez jeter et de les déposer avec précaution dans le bécher à l'aide d'un poisson d'aquarium standard net et une pince à usage général selon les besoins. </li><li> Bécher place sur un bac de nettoyage d'urgence environ 8 à 12 pouces au-dessous d'une source incandescente. Laisser reposer pendant 1-2 heures, sous la lumière. Cercaires quitter le mollusque hôte lorsqu'il est exposé à la lumière. </li><li> Soigneusement filtrer les escargots à partir du mélange des cercaires. Prenez des précautions supplémentaires, sous forme de mélange est très contagieux. Rappelez-vous, les cercaires peuvent directement pénétrer la peau humaine! </li><li> Remplacer mélange sous source de lumière pendant environ 15 minutes, ce qui permet une matière particulaire de déchet à régler. </li><li> Transfert cercaires dans un erlenmeyer propre à l'aide d'une pipette, en évitant les débris au fond du bécher. Placer le ballon à environ un angle de 45 ° sur la glace dans l'obscurité pendant45 - 60 minutes, ce qui permet cercaires de s'installer dans un coin. </li><li> Utiliser une pipette 50 ml pour éliminer 75 à 90% du surnageant et le déposer dans le bécher contenant l'eau de Javel à 10% ou 70% d'éthanol, en prenant soin de ne pas laisser les gouttes d'eau contenant des cercaires goutte à goutte de la pipette. </li><li> Agiter le flacon d'Erlenmeyer contenant des cercaires doucement pour remettre en suspension les cercaires en solution. Utiliser une pipette pour transférer l'échantillon à stériles tubes de 50 ml coniques. Placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 20 minutes dans l'obscurité. Cercaires se déposent vers le bas du tube dans l'obscurité. </li></ol> 2. Transformation manuelle des cercaires à schistosomules Avant de commencer: Assurez-RPMI 1640 complet (RPMI, 5% de sérum fœtal bovin, 1X Pen / Strep) et chaude à 37 ° C. (Il est crucial que le sérum fœtal bovin utilisé a été inactivée par incubation de 56 ° C pendant 1 heure comme schistosomes peuvent être sensibles à compléter). <ol><li> Dans une hotte biohazard, retirezsurnageant jusqu'à 5 à 10 ml de solution dans chaque conique 50 ml à l'aide d'un dispositif de pipetage ou de vide. </li><li> Joindre un calibre 22 à double extrémité, Luer lok émulsifiant aiguille d'une seringue de taille appropriée. </li><li> Aspirer lentement le mélange dans la seringue. Recueillir des cercaires de tous les tubes de 50 ml dans une seringue. Soyez attentif de gouttes. </li><li> Tournez avec précaution la seringue au cours de telle sorte que l'extrémité de l'aiguille seule est en place. Fixer une autre seringue de ce côté-ci de l'aiguille d'émulsification. </li><li> Passer le mélange à travers l'aiguille un total de 40 fois (20 fois aller et retour) pour transformer les cercaires. </li><li> Positionner verticalement les seringues de telle sorte que le mélange est contenu dans la seringue en bas et en haut de la seringue est vide. Retirer la seringue et désinfecter haut dans l'éthanol à 70%. </li><li> Goutte à goutte dépôt mélange dans un récipient propre de hauteur x 50mm paroi 100mm plat en pyrex ou cristallisoir. Désinfectez l'aiguille et la seringue dans l'éthanol à 70%. </li><li> Ajouter 37 ° C milieu RPMI 1640 complet de sorte que la inférieure de la boîte de Petri est entièrement recouverte, comme une plaque de coulée bouillon Luria. </li><li> Agiter doucement pour recueillir schistosomules dans le centre de la boîte de Pétri. Éviter les éclaboussures. Remarque: Il peut être utile de désactiver la lumière de hotte pour cette étape de façon à mieux visualiser les schistosomules dans le centre. </li><li> Déposer immédiatement schistosomules concentrés dans un nouveau de 12 puits de plaque de culture cellulaire et en utilisant un compte-gouttes stérile. </li><li> Répétez jusqu'à ce que 2.9 et 2.10 schistosomules ne sont plus présents dans le centre du plat (environ 10 fois). Déposer chaque collecte ultérieure dans un endroit bien frais. </li><li> Remplir chaque puits jusqu'à mi-course (~ 1,5 ml) avec milieu RPMI complet préchauffé. </li><li> Visualisez sur un microscope inversé pour vérifier la présence de schistosomules et l'absence de cercaires. </li><li> Cultivez les schistosomules dans un incubateur à CO 2 réglée à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: ove_content "&gt; Dans l'attente de transfert des schistosomules transformés en milieux de culture, la visualisation en vertu d'un champ lumineux inversé microscope (voir tableau équipement pour un exemple) devrait donner une image similaire à la figure 1, dans laquelle seuls schistosomules transformées sont présents dans le puits. contaminants potentiels pourrait inclure des cercaires intacte, coupées queues cercariens, ou d'autres débris. Si aucun microscope inversé est disponible, un microscope standard ou même un champ de dissection sera suffisante pour visualiser les schistosomules. Notez que cette procédure ne permet pas toujours de transformer 100% de cercaires. <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: schistosomule Transformé <img src="/files/ftp_upload/3191/3191fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2: Severed cercaires et Tails

<ol><li>Ross, A. G., Bartley, P. B., Sleigh, A. C., Olds, G. R., Li, Y., Williams, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> N Engl J Med. 346, 1212-1220 (2002).</li>
<li>Steinmann, P., Keiser, J., Bos, R., Tanner, M., Utzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis+and+water+resources+development%3A+systematic+review%2C+meta-analysis%2C+and+estimates+of+people+at+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis and water resources development: systematic review, meta-analysis, and estimates of people at risk.</a> Lancet Infect Dis. 6, 411-425 (2006).</li>
<li>Savioli, L., Albonico, M., Engels, D., Montresor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+prevention+and+control+of+schistosomiasis+and+soil-transmitted+helminthiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Int%22%5BJournal%5D)">Progress in the prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.</a> Parasitol Int. 53, 103-113 (2004).</li>
<li>King, C. H., Dickman, K., Tisch, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+cost+of+chronic+helmintic+infection%3A+a+meta-analysis+of+disability-related+outcomes+in+endemic+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the cost of chronic helmintic infection: a meta-analysis of disability-related outcomes in endemic schistosomiasis.</a> Lancet. 365, 1561-159 (2005).</li>
<li>Haas, W., Grabe, K., Geis, C., Pach, T., Stoll, K., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+invasion+of+human+skin+by+Schistosoma+mansoni+cercariae%3A+the+key-role+of+L-arginine.+Parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Recognition and invasion of human skin by Schistosoma mansoni cercariae: the key-role of L-arginine. Parasitology.</a> 124, 153-167 (2002).</li>
<li>Grabe, K., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+within+host+tissues%3A+cercariae+orientate+towards+dark+after+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Navigation within host tissues: cercariae orientate towards dark after penetration.</a> Parasitol Res. 93, 111-113 (2004).</li>
<li>Shiff, C. J., Cmelik, S. H., Ley, H. E., Kriel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+human+skin+lipids+on+the+cercarial+penetration+responses+of+Schistosoma+haematobium+and+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The influence of human skin lipids on the cercarial penetration responses of Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni.</a> J Parasitol. 58, 476-480 (1972).</li>
<li>Saladin, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+cercarial+responses+to+irradiance+changes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: cercarial responses to irradiance changes.</a> J Parasitol. 68, 120-124 (1982).</li>
<li>Chai, M., McManus, D. P., McInnes, R., Moertel, L., Tran, M., Loukas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+lung+schistosomula%2C+in+vitro+cultured+schistosomula+and+adult+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of lung schistosomula, in vitro cultured schistosomula and adult Schistosoma japonicum.</a> Cell Mol Life Sci. 63, 919-929 (2006).</li>
<li>Gobert, G. N., Tran, M. H., Moertel, L., Mulvenna, J., Jones, M. K., McManus, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+in+Schistosoma+mansoni+during+early+schistosomula+development+and+in+the+presence+of+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes in Schistosoma mansoni during early schistosomula development and in the presence of erythrocytes.</a> PLoS Negl Trop Dis. 4, (2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoni+in+vitro.+I.+Establishment+of+cultures+from+cercariae+and+development+until+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoni in vitro. I. Establishment of cultures from cercariae and development until pairing.</a> J Parasitol. 67, 179-185 (1981).</li>
<li>Yoshino, T. P. &amp, Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J Parasitol. 81, 714-722 (1995).</li>
<li>Colley, D. G., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+simplified+method+for+the+production+of+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: simplified method for the production of schistosomules.</a> Exp Parasitol. 35, 44-51 (1974).</li>
<li>Lazdins, J. K., Stein, M. J., David, J. R., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+rapid+isolation+and+purification+of+schistosomula+of+different+developmental+stages+by+centrifugation+on+discontinuous+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: rapid isolation and purification of schistosomula of different developmental stages by centrifugation on discontinuous density gradients of Percoll.</a> Exp Parasitol. 53, 39-44 (1982).</li>
<li>Cousin, C. E., Stirewalt, M. A., Dorsey, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+ultrastructure+of+early+transformation+of+skin-+and+shear-pressure-derived+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: ultrastructure of early transformation of skin- and shear-pressure-derived schistosomules.</a> Exp Parasitol. 51, 341-365 (1981).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 19, 1-1 (2001).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Plusieurs problèmes potentiels pourraient survenir pendant la procédure de transformation, mais ce protocole est conçu pour éviter la plupart de ces problèmes. Un danger potentiel est le colmatage de l&#39;aiguille émulsifiant, qui survient généralement à cause de débris laissés par l&#39;exploitation à l&#39;étape 1.3. Veillez à conserver toutes les particules de s&#39;installer dans l&#39;étape 1.5 et de transférer les cercaires soigneusement à l&#39;étape de 1,6 à éviter ce problème. En outre, comme décrit précédemment, travaillant à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique, l&#39;utilisation d&#39;équipements de protection individuelle (masques protecteurs même) et d&#39;éviter une pression excessive sur les seringues est conseillé. Détaché queues cercariens peuvent être visualisés dans les médias, ce qui est révélateur d&#39;une mauvaise séparation lors de l&#39;étape 2.9. Les queues de présenter une motion de spasme comparable et ont une forme distincte (voir la figure 2), et thusly sont facilement distinguables des schistosomules. Les queues peuvent être enlevées par lavage des schistosomules en excès de RPMIcompléter les schistosomules permettant de régler. Les queues restera flottant qui peut être aspirées. Si cercaires intacts sont présents dans les médias, la transformation à l&#39;étape 2.5 a été pas exécuté correctement. Une image d&#39;une cercaire intacte est représenté dans la figure 3b pour référence. Si ce problème se produit, s&#39;assurer que l&#39;aiguille émulsifiant utilisé est de la bonne taille. En outre, le nombre de fois que le mélange des cercaires est passé par l&#39;aiguille peut être augmenté, mais 40 fois est généralement beaucoup plus que suffisant pour approcher cisaillement 100% des queues cercariens. Transformation des cercaires en schistosomules a été décrite pour la première en 1974 par Colley et Wikel (13). Depuis lors, la préparation des schistosomules a été fait en utilisant soit la stratégie de cisaillement avec une aiguille et d&#39;une seringue comme décrit dans le présent protocole, ou en utilisant une approche vortex et séparés par des gradients de Percoll (14, 15) ou tourbillonnant comme l&#39;a démontré dans le présent document. Ces deux techniques de préparation de schistosomules sont magnifiquement décrite par Fred Lewis (16) et pour plus d&#39;informations poursuite de la culture du schistosomules de croissance à long terme peut être trouvée au Centre de ressources Schistosome NIAID ( <a href="http://www.schisto-resource.org/">www.schisto-resource.org</a> ).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> 22g x 2-7/8 &quot;émulsifiant aiguille </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 825-17G </td></tr><tr><td> Milieu RPMI 1640 1X (500ml) </td><td> Invitrogen </td><td> 11835030 </td></tr><tr><td> Sérum foetal bovin (FBS) inactivé par la chaleur </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td></tr><tr><td> Cristallisoir (100mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-741D </td></tr><tr><td> Pinces à usage général </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-316C </td></tr><tr><td> Petco Aquarium net pour les crevettes de saumure </td><td> Petco </td><td> SKU: 1190954 </td></tr></tbody></table>

transformation des cercaires et<em&gt; in vitro</em&gt; culture de<em&gt; schistosoma mansoni</em&gt; schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosomes sont les agents responsables de la schistosomiase, une maladie chronique débilitante qui touche plus de 200 millions de personnes au niveau mondial et se classe deuxième au paludisme dans les maladies parasitaires en termes de santé publique et socio-économiques (1-4). Schistosomes sont des vers trématodes, avec un cycle de vie complexe échangeant entre une vie parasitaire dans mollusques hôtes et de mammifères avec des intervalles de libre-natation étapes. En bref, la nage libre cercaires infecter un hôte mammifère en pénétrant la peau à l&#39;aide de protéases sécrétées, au cours de laquelle les cercaires perdent leur queue, se transformant en schistosomules. Les schistosomules doit désormais échapper au système immunitaire de l&#39;hôte, de développer un intestin pour la digestion des globules rouges, et de migrer si les poumons et la circulation portail en route vers leur destination finale dans le système porte hépatique et éventuellement les veines mésentériques (pour S. mansoni) où mâle et femelle et s&#39;accoupler deux vers, producing centaines d&#39;œufs par jour. Certains des œufs sont excrétés par le corps dans l&#39;eau douce, où les œufs éclosent en nage libre miracidiums (5-10). Le miracidium infecter les espèces d&#39;escargots spécifiques et se transforment en sporocystes mère et la fille, qui, à son tour, produisent des cercaires infectantes, complétant ainsi le cycle de vie. Malheureusement, le cycle de vie des schistosomes ne peuvent pas être cultivées in vitro, mais cercaires infestantes peut être transformé en schistosomules et les schistosomules peuvent être cultivées pendant des semaines pour l&#39;analyse du développement schistosome in vitro ou l&#39;analyse des microréseaux. Dans ce protocole, nous fournissons une description visuelle de la transformation des cercaires et culture in vitro de schistosomules. Nous nous débarrassons de cercaires infectieuses de l&#39;escargot Biomphalaria glabrata hôte et manuellement les transformer en schistosomules en détachant leurs queues en utilisant un émulsifiant double aiguille. In vitro, la transformation des cercaires et des techniques de culture d schistosomulesescribed éviter l&#39;utilisation d&#39;un hôte mammifère, ce qui simplifie la visualisation des schistosomes et faciliter la collecte du parasite pour l&#39;analyse expérimentale. transformation in vitro et des techniques de culture de schistosomes ont été faites depuis des années (11, 12), mais pas de protocoles visuels ont été développés qui sont à la disposition de toute la communauté.

Nous décrivons une<em&gt; In vitro</em&gt; Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt;, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d&#39;eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d&#39;accueil.

Transformation des cercaires et<em&gt; In vitro</em&gt; Culture de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Schistosomules

Les parasites schistosomes sont les agents pathogènes de la schistosomiase, une maladie chroniquement débilitante qui touche plus de 200 millions de personnes dans le monde et...

L'objectif général de cette procédure est de transformer les CRC infectieux en shisom. Cette transformation s'effectue en premier lieu en récoltant les CRC infectieux à partir de l'hôte limnée. Les CRC infectieux sont ensuite concentrés, puis transformés en shisom non infectieux à l'aide d'une aiguille double tranchant.Enfin, les shisom sont concentrés et récoltés dans une plaque de culture, puis incubés dans du RPMI à 37 degrés Celsius et sous 5 % de dioxyde de carbone. Grâce à cette méthode, on peut obtenir des shisom transformés présentant une contamination par le FU cial ou la queue cial. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car une procédure de transformation peut être difficile à apprendre et potentiellement dangereuse.Les Cica sont infectieux et se trouvent à une concentration élevée ; leur isolement exige une manipulation délicate et précise afin de procéder en toute sécurité et efficacement. John, un assistant de recherche dans mon laboratoire, démontrera la procédure. Remplissez à moitié un bécher propre de 500 millilitres avec de l'eau distillée à température ambiante à l'aide d'un filet à poisson standard pour aquarium et de pinces. Transférez les escargots infectés dans le bécher.Placer le bécher sur un plateau de sécurité anti-déversement à une hauteur de 20 à 30 cm sous une source lumineuse incandescente et le laisser pendant une à deux heures. L'exposition à une lumière intense provoque la sortie des CRC de l'hôte gastéropode. Pour retirer les escargots, veiller à prendre des précautions supplémentaires afin d'éviter tout contact avec l'eau infectieuse, qui contient des CRC capables de pénétrer directement la peau humaine.Retirer les escargots, puis remplacer la solution sous une source lumineuse pendant environ 15 minutes afin de permettre aux matières particulaires de déchets de sédimenter au fond du flacon. Une fois que les déchets se sont déposés, utiliser une pipette pour transférer le circ vers un flacon Erlenmeyer propre, en évitant les débris au fond du bécher.Placez le flacon sur de la glace, à un angle de 45 degrés. Incubez la solution à l’abri de la lumière pendant 45 à 60 minutes afin de permettre aux CRC de s’accumuler dans un coin. Une fois les parasites sédimentés, utilisez une pipette de 50 millilitres pour éliminer la majeure partie du surnageant et jetez-le soigneusement.Dans un bécher contenant de l'eau de javel à 10 % ou de l'éthanol à 70 %, faire tourner doucement le ballon Erlenmeyer afin de remettre en suspension les parasites. Ensuite, utiliser une pipette pour transférer l'échantillon dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres. Placer les tubes sur de la glace et les incuber à l'obscurité pendant encore 20 minutes afin de permettre au CRC de se déposer.Une fois que les parasites se sont déposés, utilisez une pipette pour éliminer la majeure partie des surnageants, en laissant cinq à dix millilitres de liquide dans chaque tube. Ensuite, fixez une aiguille d’émulsification à double embout calibrée 22 sur une seringue. Aspirez lentement la solution contenant les parasites de chaque tube dans la seringue.Veiller à ne pas faire goutter le mélange infectieux dans la hotte. Tourner soigneusement la seringue de manière à ce que l'aiguille soit orientée vers le haut, puis fixer une deuxième seringue à l'extrémité libre de l'aiguille. Transférer le mélange de l'une à l'autre seringue environ 20 fois pour transformer le crc.Ensuite, positionnez les seringues verticalement de sorte que celle vide soit en haut. Retirez soigneusement la seringue supérieure et désinfectez-la à l'éthanol 70 %. Déposez les parasites goutte à goutte dans un cristallisoir Pyrex propre à parois hautes.Ensuite, désinfectez l'aiguille et la seringue avec de l'éthanol à 70 %. Puis, placez la boîte sur un fond blanc afin de faciliter la visualisation des parasites, et ajoutez du RPMI complet préchauffé à 37 degrés Celsius de manière à recouvrir entièrement le fond de la boîte Pyrex.Agiter doucement pour regrouper le shiso au centre à l’aide d’un compte-gouttes stérile. Prélever une partie du shiso concentré et transférer les parasites dans une nouvelle plaque de culture cellulaire de 12 puits. Répéter cette étape de rinçage jusqu’à ce qu’il ne reste plus de parasites.Une fois les parasites transférés, remplir chaque puits environ à moitié avec du RPMI tiède afin de vérifier la présence de shisom. Visualiser la plaque à l’aide d’un microscope optique inversé. À ce stade, la majorité des parasites doivent s’être transformés en shisom, que l’on peut distinguer des CRC E par leur morphologie moins marquée et par l’absence de la queue caractéristique ciale.Un petit nombre de queues de CRC intactes ou de débris de CRC sectionnés peut également être présent. Ces cultures peuvent ensuite être cultivées et maintenues dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant jusqu'à six semaines, avec des changements hebdomadaires du milieu. N'oubliez pas que le travail avec des agents infectieux peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de deux couches de gants, de protections pour les manches, ainsi qu'une utilisation appropriée des installations et des hottes de sécurité biologique doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Schistosoma mansoni oeufs sont des stimulateurs efficaces du type T auxiliaire 2 (Th2) la réponse immunitaire, caractéristique d'une infection parasitaire, l'asthme et l'inflammation allergique. Ce protocole utilise S. mansoni œuf d'injection afin de générer un taux de CD4 Th2 induite par les cytokines réponse inflammatoire dans les poumons, caractérisée par la formation de granulomes pulmonaires autour de l'oeuf, l'éosinophilie et l'activation des macrophages alternative.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

Cet article décrit un protocole d’isolement axénique à grande échelle et de perception des miracidia nageant librement de la douve de sang humaine Schistosoma mansoni et leur traitement ultérieur pour être introduit dans la culture in vitro .

Masse d’Isolation et de la culture In Vitro des étapes apporte de la douve de sang humain Schistosoma Mansoni

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Ici, nous avons fourni une méthode pour atteindre la transfection stable des parasites de poulet Eimeria par nucléozoites nucléozoites ou merozoites de deuxième génération. Les parasites eimeriens génétiquement modifiés exprimant des gènes antigéniques hétérologues pourraient être utilisés comme vecteurs de vaccination.

Nucléofection et propagation in vivo des parasites de poulet Eimeria

Des études détaillées sur les stades des moustiques des parasites du paludisme sont essentielles pour concevoir des stratégies efficaces de blocage de la transmission. Ce protocole montre comment mettre en culture efficacement des gamétocytes infectieux, puis nourrir ces gamétocytes avec des moustiques pour générer des stades de moustiques de P. falciparum.

Plasmodium falciparum Culture de gamétocytes et infection par les moustiques par l’alimentation par membrane artificielle

Nous décrivons une technique de transduction transitoire rapide à différents stades de développement d’Echinococcus granulosus en utilisant des vecteurs lentiviraux de troisième génération.

Transduction transitoire des formes strobilées d’Echinococcus granulosus

Ici, nous décrivons la méthodologie utilisée pour générer des souches de L. panamensis et de L. donovani exprimant le gène de l’eGFP en tant que transgène intégré stable à l’aide du système pLEXSY. Les parasites transfectés ont été clonés par dilution limite, et les clones ayant l’intensité de fluorescence la plus élevée chez les deux espèces ont été sélectionnés pour une utilisation ultérieure dans les tests de dépistage de médicaments.

Développement de souches d’espèces de Leishmania avec expression constitutive de eGFP

Le paludisme est transmis par l’inoculation du stade sporozoïte de Plasmodium par des moustiques infectés. Le plasmodium transgénique nous a permis de mieux comprendre la biologie du paludisme et a contribué directement aux efforts de développement d’un vaccin contre le paludisme. Nous décrivons ici une méthodologie simplifiée pour générer des sporozoïtes transgéniques de Plasmodium berghei .

Génération de sporozoïtes génétiquement modifiés à Plasmodium berghei

Cette étude montre un protocole détaillé pour effectuer la microscopie à expansion d’ultrastructure dans trois stades du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi, l’agent pathogène responsable de la maladie de Chagas. Nous incluons la technique optimisée pour les protéines cytosquelettiques et le marquage pan-protéome.

Microscopie à expansion ultrastructurale en trois étapes du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi

La génétique chimique implique la substitution d’un résidu gardien par un acide aminé contenant une chaîne latérale différente au locus cible. Ici, nous avons généré un parasite mutant contenant un allèle hypomorphe de cdpk1 et identifié des voies compensatoires adoptées par le parasite dans le fond mutant.

Comprendre le développement de voies compensatoires chez un parasite mutant du paludisme hébergeant un allèle hypomorphe de kinases ressemblant à des plantes

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

Apprenez à transformer des cercaires infectieux en schistosomules non infectieux de Schistosoma mansoni à l'aide d'une aiguille double. Cette méthode de culture in vitro permet d'étudier la biologie du parasite responsable de la schistosomiase.

Transformation des cercaires et

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