Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de cultiver des cellules souches primaires de la crête neurale, ou N CSC, à partir de tissus du cuir chevelu humain. Ceci est accompli en jurant d’abord la peau du cuir chevelu humain en bandes d’un centimètre de large et en l’incubant dans des milieux contenant des disbays. La peau est ensuite disposée dans le milieu frais et les follicules pileux sont bouchés.

La deuxième étape de la procédure consiste à traiter les follicules pileux avec de la trypsine et à obtenir des suspensions unicellulaires. La dernière étape de la procédure consiste à trier CD 2 71 HNK un ncsc double positif par cytométrie en flux et à placer des plaques de culture. En fin de compte, la microscopie à contraste de phase est utilisée pour étudier la formation et la croissance des neurosphères, où la démonstration de ces méthodes est essentielle car l’extraction et l’isolement des étapes verticales de la santé sont difficiles à apprendre car il est très difficile de disséquer la peau et les particules de santé au microscope.

Pour préparer la culture, les cellules souches enrobent le fond de chaque puits d’une plaque de six puits avec du poly de lycine, laissez les plaques sécher dans le capot. Une fois les puits secs, rincez-les à l’eau stérile et aspirez, puis laissez les puits sécher à nouveau. Enduisez les plaques avec la solution de 0,17 milligramme par millilitre de fibronectine.

Ensuite, avant que la fibronectine ne sèche dans la plaque du milieu de culture NCSC, préparez et préparez les milieux et réactifs suivants. 97 % D-M-E-M-F 12 2 % B 27 supplément 1 % et deux suppléments B-F-G-F-E-G-F IGF un et diss. Prélever la peau fraîche du cuir chevelu humain adulte des procédures de lifting ou du tissu du cuir chevelu fœtal et la laver avec du PBS contenant de la pénicilline streptomycine.

Transférez la peau dans des tubes de 50 millilitres et incubez dans du DMEM avec 10 milligrammes par millilitre d’espace DIS à 37 degrés Celsius pendant deux à quatre heures ou toute la nuit à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez la peau dans une boîte de Pétri stérilisée et retirez les poils de la peau en saisissant la tige du cheveu près de la surface de la peau et en tirant fermement et en douceur. Les follicules pileux vont soit présenter une morphologie d’antigène orgen, soit incuber les fragments de follicules isolés en 0,05 % de voyages dans EDTA pendant 15 à 20 minutes à température ambiante avec agitation occasionnelle.

Ajoutez ensuite quatre millilitres de DMEM avec 10 % FBS pour arrêter la réaction. Ensuite, passez l’épithélium folliculaire à travers un filtre de 40 microns pour obtenir une suspension unicellulaire contenant des cellules de taille et de forme variables. Faites ensuite tourner la suspension à 200 fois G pendant cinq minutes.

Jetez soigneusement le surnageant S et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS avec 2 % de FBS Pour isoler les CSC N à l’aide de faits, étiquetez d’abord les cellules avec des anticorps contre un CD conjugué PC CD 2 71 FE C conjugué hnk one ou CD 2 71 PE alpha quatre intégrine en incubant sur de la glace pendant 40 minutes dans l’obscurité, centrifugez à 200 fois G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirez le surnageant. Mettre en suspension les cellules dans du PBS contenant 2 % FBS et deux microgrammes par millilitre. Iodure de propidium pour éliminer les cellules mortes.

Effectuer le tri cellulaire par cytométrie en flux et prélever une culture cellulaire de CD 2 71 H et K un double positif ou de CD 2 71 alpha quatre intégrine double positive. Les cellules dans des plaques de fixation ultra-faibles dans le milieu NCSC, en changeant le milieu une fois par jour. Vérifiez la culture cellulaire tous les jours au microscope.

Le NCSC commencera à former de petits agrégats flottants après plusieurs jours et des sphères bien formées en deux à cinq semaines dans la culture, en fonction de l’âge des donneurs. L’excroissance apparaîtra en quelques jours dans la région du renflement et des sphères bien formées in situ en quelques semaines lorsque des follicules pileux entiers seront cultivés dans le milieu NCSC. Pour étendre les cultures NCSC, lavez les cellules une fois avec du préchauffage PBS deux fois dans EDTA à 37 degrés Celsius.

Ensuite, ajoutez-le aux cellules pendant sept à 15 minutes pour que la cellule souche du follicule de grêle se détache. Pour arrêter les déclenchements, ADD DMEM avec 10 % FBS pipette doucement de haut en bas pour disperser les cellules. Puis tournez à 200 fois G pendant cinq minutes.

Remettre les cellules en suspension dans un milieu NCSC et des plaques de culture et de fibronectine à 37 degrés Celsius. La culture du NCSC. Le milieu est suffisant pour maintenir le NCSC humain dans un état indifférencié.

Sans avoir besoin de cellules nourricières, les kératinocytes ne proliféreront pas et mourront progressivement dans le milieu. Certaines petites cellules rondes vont proliférer et former de petits agrégats en suspension. Après trois à cinq jours, ces agrégats flottants augmentent lentement en taille, générant des structures tridimensionnelles ressemblant à des sphères, appelées sphères de cheveux.

Lorsqu’ils sont cultivés sur des plaques codées, les N CSC se fixent à la surface et se développent plus rapidement que les cellules formant des sphères en suspension, formant à la fois des sphères et des cellules souches attachées. Exprimez les marqueurs NCSC lorsque des follicules pileux entiers sont cultivés, des sphères se forment dans la zone correspondant à la région du renflement. Après avoir regardé la vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de s’isoler et de se cultiver.

Cellule souche neurologique primaire des tissus du cuir chevelu herma.