Name: Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Apprenez l'isolation de cellules trophoblastiques primaires de souris et le test d'invasion sur matrigel. Cette méthode permet d'étudier le comportement cellulaire placentaire in vitro.

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Les auteurs tiennent à remercier l&#39;équipe des services de création de l&#39;Université de Missouri Centre de soutien scolaire qui a produit cette vidéo. Ce travail a été soutenu par la Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health &amp; Human Development de la National Institutes of Health, numéro d&#39;obtention HD055231

1. Dissection du placenta de souris <ol><li> Mettre en place paires d'accouplement de souris. </li><li> Sur chacun des jours suivants, vérifiez la présence d'un bouchon de copulation. Le jour où une prise est détecté est considéré comme 0,5 jours après le coït (dpc) 7. </li><li> Placentas peuvent être perçues au stade de la grossesse désirée, avec une dissection propre du placenta début possible avec le développement du placenta mature sur d 10.5. Ici, nous démontrons 14,5 dpc. Lors des volumes donnés, 40-60 placentas de 10,5 dpc, et 10-20 placentas sur 14,5 dpc permettra d'obtenir une couche de trophoblaste clairement visible cellule. </li><li> Euthanasier la souris enceintes, et enlever l'utérus, la coupe au niveau du col et le long de la mésomètre. </li><li> Avec des ciseaux pointus, couper entre chaque conceptus (figure 1A). </li><li> L'utilisation de deux paires de pinces, saisir la paroi utérine à l'arête de coupe, et tirer, enlever le myomètre (figure 1B) . Une paire dentelée, pince modérément fines (courbe ou droite) plus une paire pinces très fines (# 5, par exemple) est recommandée. </li><li> En face du placenta, ouvrez la caduque avec des pinces ou des ciseaux, ce qui expose le placenta. Saisir le tissu utérin avec une paire pince, faites glisser une autre pince sous le placenta se séparer (figure 1C). Si nécessaire, le fœtus séparé et membranes fœtales à partir du placenta. Il n'est pas possible d'enlever tous les tissus déciduale par dissection sans perdre également le tissu placentaire, mais d'autres tissus déciduale (pâle) peut être enlevé de la surface du placenta par un léger gommage avec une pince. Nous nous appuierons sur le gradient de Percoll une purification supplémentaire. </li><li> Placez chaque placenta disséqué dans 25 ml de glace froide tampon de dissociation dans un tube conique de 50 ml jusqu'à ce que toutes les dissections sont terminées. Aux stades ultérieurs, émincer grossièrement tissu placentaire avec des ciseaux ou une lame de rasoir avant de les transférer dans la mémoire tampon de dissociation. </li></ol>tle "&gt; 2. Isolement des cellules trophoblastiques <ol><li> Tube à bouchon conique sans serrer et placer dans un bain marie à 37 ° C pendant 45-60 minutes. Mélanger la solution de dissociation vigoureusement à la pipette environ toutes les 10 min. Le temps de digestion totale doivent être étroitement surveillés et il faudra probablement quelques essais et erreurs pour parvenir au recouvrement optimal des cellules. Les tissus doivent être en mesure de passer à travers une pipette de 10 ml, mais des morceaux visibles de tissu restera. Digestion excessive entraînera dans la survie cellulaire pauvres et l'efficacité de placage. La survie des cellules et une efficacité optimales plaquage se produit lorsque des amas de quelques cellules sont présents, plutôt que lorsque la dissociation complète est réalisée. A l'inverse, underdigestion mènera à la pureté réduite après la séparation percoll. Lorsque le point de digestion a été atteint, tube de place sur la glace pour arrêter l'activité de la collagénase. </li><li> Faire passer la solution à travers un tamis cellulaire pour éliminer les matières non digérées, et centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes. </li><li> Pour laver, retirercellules surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de solution de lavage. Centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes. </li><li> Lors de la centrifugation, préparer la solution percoll en mélangeant 9,6 ml percoll, 13,4 ml de solution de lavage et de 1,1 ml de milieu 10x 199 dans un tube de 50 ml appropriée pour centrifugation à grande vitesse. </li><li> Retirez la cellule surnageant et resuspendre le culot dans 2 ml de solution de lavage. </li><li> Ajouter à cellules Percoll solution et centrifuger @ 30000 xg pendant 30 minutes à 4 ° C. </li><li> Retirer le tube de centrifugeuse sans déranger le gradient. Pour visualiser le tube de gradient lieu, devant une source de lumière vive. Repérez la bande trophoblaste (figure 2), et aspirer avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la bande de globules rouges ci-dessous. Volume de la bande trophoblaste sera 5-8 ml. </li><li> Transfert cellules trophoblastiques dans un tube conique de 50 ml. Ajouter la solution de lavage pour un volume total de 45 ml. </li><li> Centrifuger à 500 xg pendant 5 minutes. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans la culture médium (NCTC-135). Les cellules peuvent être cultivées sur couche mince ou en plastique matrigel culture de tissus à 37 ° C et 5% de CO 2. Au jour 10.5, chaque placenta donne environ 50.000 cellules vivantes, dont 80-90% sont cytokératine positive. </li></ol> 3. Essai invasion trophoblastique <ol><li> Ajouter 1-2 ml du milieu de culture (NCTC-135) à chaque chambre matrigel et incuber à 37 °, 5% de CO 2 pendant 30-90 min. </li><li> Retirer moyen et ajouter 1,5 ml x 10 5 cellules fraîchement isolées en milieu 2ml à la chambre supérieure. Ajouter 1 ml de milieu de la chambre basse pour couvrir la surface inférieure membrane. </li><li> Cellules en culture dans des inserts pendant 18-24 heures. </li><li> Gratter les cellules et matrigel de l'insert à l'aide d'un écouvillon en mousse. </li><li> Rincer le haut et le bas de la chambre à 2 ml de PBS. </li><li> Fixer pendant 5 min dans 1 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS. </li><li> Colorer en remplissant la chambre basse avec 400 pl DAPI (300 nm) et incuber pendant 30 min. </li><li> Laver trois fois brièvement dans du PBS. </li><li retirer les membranes de plaquettes avec une lame scalpel tranchant.><li> Ajouter une chute de 10 pi de milieu de montage (glycérol à 50% dans du PBS) à glisser. En utilisant des pinces, poser la membrane sur la chute. Ajouter une autre baisse de 10 pi de milieu, puis lamelle avec soin. </li><li> Cellules et le nombre photographie. Veillez à orienter correctement la membrane (cellule vers le haut ou de la cellule vers le bas) pour le microscope utilisé. Image J logiciels (National Institutes of Health) comporte une fonction de comptage manuel qui peut être utilisé à cette fin, tout comme Adobe Photoshop ou un compteur manuel. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Dissection du placenta de souris. (A) L'utérus est enlevé par une coupe suivant les oviductes (jaune), le long de la surface mesometrial, et au col de l'utérus (partie inférieure). Conceptus individuels peuvent ensuite être séparés en coupant avec des ciseaux comme indiqué. (B) Le utérine paroi est éliminé en plaçant deux pinces à la surface de coupe de l'utérus, et à la déchirure le long de la face anti-mesometrial, à proximité du foetus et à distance du placenta. (C) Le placenta est ensuite isolé par préhension avec une pince coulissante et une autre entre le placenta et le tissu utérin. Le cordon ombilical et les membranes extra-embryonnaires d'autres peuvent ensuite être séparés du placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Percoll séparation des cellules trophoblastiques. Après centrifugation, trois bandes majeures sera visible comme indiqué dans le dessin animé à gauche, et la photo à droite. La bande supérieure contient des débris cellulaires et des fibroblastes et sera le plus apparent. Une serré (rouge) près de la bande de fond contenant des globules rouges sera visible juste en dessous de la bande trophoblaste diffus. Agrégats cellulaires seront probablement vu dans la bande de trophoblaste, comme dans les deux montré juste à gauche de la flèche sur la photo. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figure 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> La figure 3. Cellules trophoblastiques invasives (flèche blanche) passe à travers la couche de Matrigel et les pores de la membrane, apparaissant sur ​​la surface inférieure de la membrane. Les pores sont également visibles (flèche noire). Le nombre de cellules sur la surface de la membrane entière ou une zone échantillon représentatif peut être compté. Une image en niveaux de gris de fluorescence DAPI nucléaire a été inversé pour améliorer la visualisation des cellules. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figure 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Cellules trophoblastiques Figure 4. Peut être identifiée, et la pureté de la population isolée évalué par immunocoloration pour la cytokératine 7 (centre, magenta). Les cellules sont DAPI (en haut, bleu). Fusionnée image de fond.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons rien à déclarer.

Dans cette vidéo, nous démontrons l&#39;isolement de cellules trophoblastiques du placenta de souris. Nous montrons ensuite un test in vitro pour l&#39;invasion du trophoblaste. Grâce à cette procédure, une grande partie, mais pas entièrement, la population pure de cellules trophoblastiques peuvent être obtenues. Si la pureté supplémentaire est nécessaire, de séparation du talon magnétique ou cytométrie en flux peut être réalisée, comme cela a été décrit pour les cellules trophoblastiques primaires de l&#39;homme. La bo...

isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Le placenta est responsable du transport des nutriments, des gaz et des facteurs de croissance pour le fœtus, ainsi que l&#39;élimination des déchets. Ainsi, des défauts dans le développement placentaire avoir des conséquences importantes pour le fœtus et la mère, et sont une cause majeure de la létalité embryonnaire. Le type cellulaire majeur de la portion fœtale du placenta est le trophoblaste. Des cellules primaires de souris trophoblastes placentaires sont un outil utile pour étudier le développement normal et anormal du placenta, et contrairement à des lignées cellulaires, peuvent être isolés et utilisés pour étudier trophoblaste à des étapes spécifiques de la grossesse. En outre, des cultures primaires de trophoblaste de souris transgéniques peuvent être utilisées pour étudier le rôle des gènes particuliers dans les cellules placentaires. Le protocole présenté ici est basée sur la description de Thordarson et al. 1, dans lequel un gradient de Percoll est utilisé pour obtenir une population de cellules du trophoblaste relativement pur de placenta de souris isolées. Il est semblable à l&#39;utiliser plus largementméthodes d pour 2-3 trophoblaste humain isolement cellulaire. Pureté peut être évaluée par coloration immunocytochimique des cellules isolées pour la cytokératine 7 4. Ici, les cellules isolées sont ensuite analysés en utilisant un test invasion matrigel trophoblaste invasif pour évaluer in vitro 5-6. Les cellules envahies sont analysés par immunocytochimie et colorées pour le comptage.

Dans ce protocole, nous décrivons la dissection du placenta de la souris sur la grossesse D10.5, suivie de l&#39;isolement des cellules trophoblastiques en utilisant un gradient de Percoll. Nous avons ensuite démontrer l&#39;utilisation des cellules isolées dans un essai invasion matrigel.

Isolement des cellules trophoblastiques primaires de souris et le test invasion trophoblastique

Le placenta est responsable du transport des nutriments, des gaz et des facteurs de croissance vers le fœtus, ainsi que de l'élimination des déchets. 
Ainsi, des anomalies...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules primaires de trophoblaste placentaire de souris pour la culture cellulaire. Nous démontrerons également une utilisation possible de ces cellules, à savoir un test d'invasion au matri gel. L'utérus sera prélevé chez la souris gravide et le placenta sera disséqué.Le tissu placentaire sera digéré enzymatiquement afin d'obtenir des cellules individuelles ou de petits agrégats cellulaires, puis les cellules seront séparées selon un gradient de densité. La bande contenant les cellules trophoblastiques sera aspirée, et la population cellulaire obtenue pourra ensuite être lavée et mise en culture. Nous allons ensuite démontrer que pour le test d'invasion, les cellules sont mises en culture sur une couche de matrigel recouvrant une membrane fine.Les cellules invasives digéreront la couche de matrigel et traverseront des pores de huit micromètres dans la membrane. Les cellules sont ensuite fixées en place et la membrane est retirée. Les cellules ayant envahi peuvent alors être colorées et comptées.Bonjour, je suis Kathleen Pennington du laboratoire Schultz, Département d'obstétrique, de gynécologie et de santé des femmes à l'Université du Missouri à Columbia, Missouri. Aujourd'hui, nous allons vous montrer la procédure que nous utilisons pour isoler des cellules trophoblastiques primaires de souris enceintes. Nous démontrerons ensuite le test d'invasion que nous utilisons pour évaluer ces cellules.Nous utilisons ces procédures pour étudier les facteurs qui influencent le développement des cellules trophoblastiques placentaires et leur capacité à envahir une matrice extracellulaire. Commençons. Installez d'abord des couples d'accouplement de souris chacun des jours suivants.Vérifiez la présence d'un bouchon copulatoire. Le jour où un bouchon est détecté est considéré comme le jour 0,5.Le placenta post-coïtual peut être prélevé au stade de la grossesse souhaité. Ici, nous allons démontrer la dissection d'un placenta de jour 14,5 sur la paillasse. Toutefois, un microscope peut être nécessaire pour visualiser les tissus à des stades plus précoces. Localisez l'utérus, puis effectuez une incision au niveau de la jonction utéro-tubaire.Continuer à retirer le tissu adipeux et les vaisseaux sanguins en coupant au niveau du col et de l'autre jonction tubulaire. Pour retirer l'utérus, transférer l'utérus dans une boîte de Pétri propre à l’aide de ciseaux pointus. Séparer chaque conceptus. Une fois séparé, transférer chaque conceptus dans une boîte propre.Le fœtus se trouve du côté anti-myométrique par rapport au placenta. Le placenta est situé du côté mésique de l'utérus. Utilisez une paire de forceps pour saisir l'utérus près de la surface coupée.Éloigner soigneusement les deux paires de forceps l'une de l'autre, en déchirant la paroi utérine du côté anti-myométrique. Cela provoque généralement également la rupture des membranes. Laisser ainsi clairement visible le fœtus en haut, avec le placenta rouge en dessous et le tissu utérin blanc.En dessous, utilisez une pince fine pour séparer le cordon fœtal et les tissus amniotiques du placenta. Tenez le tissu utérin avec une paire de pinces et faites glisser l'autre paire entre le placenta et le tissu utérin sous-jacent. À ce stade, le tissu décidual excédentaire peut être retiré du placenta.Cependant, certaines cellules décidualles risquent de subsister. Placer chaque placenta disséqué dans un tampon de dissociation glacé jusqu'à ce que tous les prélèvements soient terminés. Une fois les dissections terminées, boucher légèrement le tube conique contenant le placenta et la solution de dissociation, puis le placer dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes.Après 10 minutes, mélangez la solution de dissociation en pipetant vigoureusement de haut en bas et surveillez attentivement l'avancement de la digestion. La durée appropriée de l'étape de dissociation à la collagénase doit être déterminée pour chaque expérience et s'acquiert par l'expérience. Une sur-digestion réduira fortement la récupération cellulaire, tandis qu'une sous-digestion peut entraîner une pureté réduite ainsi qu'un nombre de cellules inférieur.Arrêter la réaction lorsque quelques morceaux de tissu non digéré restent. Faire passer la solution à travers un tamis cellulaire pour éliminer les matériaux non digérés et centrifuger à 500 fois G pendant cinq minutes afin de former un culot de cellules placentaires. Ensuite, laver les cellules.Pour éliminer la solution de dissociation. Retirer le surnageant et resuspendre les cellules dans 10 ml de solution de lavage, puis centrifuger à 500 ×g pendant cinq minutes. Pendant ce temps, préparer la solution par cellule en mélangeant 9,6 ml de solution par cellule et 13,4 ml de solution de lavage dans un tube adapté à une centrifugation à haute vitesse.Ajoutez 1,1 mL de milieu 10 x, 1 99 pour préparer la solution par cellule. Inversez délicatement le tube pour homogénéiser. Après la centrifugation et la solution de lavage, retirez le surnageant et resuspendez le culot cellulaire. Dans deux mL de solution de lavage, ajoutez les cellules à la solution du protocole et mélangez pour créer le gradient. Effectuez une centrifugation à 20 000 × g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le tube de la centrifugeuse sans perturber le gradient.Le gradient peut être visualisé plus facilement en tenant le tube devant une source lumineuse. Une bande blanche contenant surtout des débris cellulaires sera visible près du haut du tube, et une bande de globules rouges sera très probablement visible près du bas du tube. Juste au-dessus.Voici la bande de trophoblaste. Aspirez le milieu jusqu'à juste au-dessus de la bande de trophoblaste et jetez-le. Ensuite, à l'aide d'une pipette, transférez la bande de trophoblaste dans un tube de centrifugation propre contenant 35 ml de solution de lavage et centrifugez à 500 fois G pendant cinq minutes.Pour former un culot des cellules trophoblastiques, resuspendre le culot dans le milieu de culture pour trophoblastes. Ici, les cellules seront cultivées dans des chambres d'invasion placées dans une plaque à six puits. Les chambres de matri-gel ont été préalablement rincées conformément aux instructions du fabricant ; pipeter de 0,5 à 1 ml de milieu de culture dans chaque puits, sous l'insert.Ensuite, ajoutez 1,5 fois 10 à la puissance 5 cellules dans un volume de milieu dans la chambre. Incubez à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. Retirez les chambres d'invasion de l'incubateur après 18 à 24 heures.Éliminer le milieu de culture et rincer les chambres trois fois dans du PBS pendant cinq minutes à chaque fois, délicatement mais soigneusement. Racler les cellules et le gel principal de la surface supérieure de l'insert. À l’aide d’un coton-tige, fixer les cellules envahies sur la surface inférieure de la membrane en remplissant le puits avec une solution de paraformaldéhyde à 4 % et en incubant pendant cinq minutes.Rincez trois fois au PBS. Colorer les cellules envahies en remplissant le puits avec un colorant nucléaire tel que le dappy. Incuber pendant 20 minutes.Une fois de plus, laver trois fois dans le PBS. Ajouter une goutte de milieu de montage sur une lame en verre à l’aide d’une lame de scalpel, puis retirer soigneusement la membrane de la chambre d’invasion à l’aide de pinces. Transférer la membrane sur la lame en orientant les cellules vers le haut.Disposer la membrane sur la goutte. Veiller à éviter les bulles d'air. Ajouter une autre goutte de milieu de montage, puis une lame de couverture.Observer attentivement et photographier les cellules envahies à la surface de la membrane. Sur la figure, des cellules trophoblastiques invasives traversent la couche de Matrigel et les pores de la membrane, visibles sur la surface inférieure de celle-ci. Les pores peuvent également être visibles.Le nombre de cellules envahies peut être décompté et comparé entre les groupes de traitement manuellement ou à l'aide d'un logiciel informatique. La figure deux, en complément des colorations nucléaires, illustre que l'immunocytochimie peut être utilisée pour caractériser les cellules envahies. Ici, nous avons utilisé un anticorps dirigé contre la cytokeratine sept pour confirmer que les cellules sont des trophoblastes.Nous avons démontré l'isolement de cellules trophoblastiques à partir du placenta de souris. Nous avons ensuite présenté un test in vitro de l'invasion trophoblastique. À l'aide de cette procédure, on peut obtenir une population de cellules trophoblastiques largement, mais pas entièrement, pure.Si une purification supplémentaire est nécessaire, une séparation par billes magnétiques ou une cytométrie en flux peut être réalisée, comme cela a été décrit pour les cellules trophoblastiques humaines primaires. Bien que nous ayons montré l'utilisation de chambres d'invasion préparées commercialement avec du matri gel, celles-ci peuvent également être préparées en ajoutant du matri gel sur des chambres transwell non revêtues, à l'épaisseur souhaitée. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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