Name: Détection et Genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en Taqman en une seule étape de RT-PCR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de RT-PCR TaqMan en une seule étape pour détecter et identifier les génogroupes des norovirus dans les selles pédiatriques. Cette technique économique améliore le diagnostic des gastroentérites virales.

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Les auteurs tiennent à remercier le Centre National Laboratory Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) pour le don de la nature quelques points positifs standards et de contrôle pour NoV, et les laboratoires de l&#39;École de santé publique de Johns Hopkins pour fournir des réactifs.

1. Des échantillons de selles <ol><li> Des échantillons de selles doivent être congelés afin de préserver l'ARN. Pour faire une suspension à 10% fécale, prenez environ 0,1 g de l'échantillon de selles décongelées et compléter à 1 ml avec du PBS. </li><li> Aliquoter dans 200 ul d'éviter les cycles de gel et de dégel. Entreposer les aliquotes à -70 ° C. </li><li> Décongeler et centrifuger à 4000 g aliquotes pendant 10 min avant de l'utiliser dans l'extraction. </li></ol> 2. Préparation de particules de silice pour l'extraction avec de la guanidine et de silice <ol><li> A RT, de suspendre 30 g de dioxyde de silicium et de compléter avec dH 2 O jusqu'à 250 ml. </li><li> Après 24 heures de sédimentation, retirer 215 ml du surnageant par aspiration. Ajouter dH 2 O jusqu'à 250 ml, et de suspendre le culot de silice en secouant. </li><li> Après encore 24 heures, éliminer le surnageant par aspiration, et ajuster le pH de la suspension de silice à pH 2,0, à l'aide d'acide chlorhydrique (HCl). Aliquoter la suspension de silice dans le verre botbouteilles et l'autoclave. </li></ol> 3. Préparation de L6 tampon pour l'extraction avec de la guanidine et de silice <ol><li> A RT, préparer L6 tampon en dissolvant 60 g de thiocyanate de guanidinium (GuSCN) et 1,3 g de Triton X-100 dans 50 ml de Tris 0,1 M de chlorhydrate, pH 6,4, et 11 ml d'une EDTA 0,2 M, pH 8,0 solution. </li></ol> 4. Préparation du Tampon L2 pour l'extraction avec de la guanidine et de silice <ol><li> A RT, préparer un tampon L2 en dissolvant 180 g de thiocyanate de guanidinium (GuSCN) dans 150 ml de 0,1 M Tris chlorhydrate, pH 6,4. </li></ol> 5. Procédure d'extraction <ol><li> Dans chaque extraction d'un échantillon de selles positif NoV, comme contrôle positif, et l'eau traitée au DEPC, comme contrôle négatif, devraient être inclus. </li><li> Dans un tube à centrifuger micro-mélanger le suivant: 1 ml de tampon L6, 20 pl de particules de silice, et ajouter 200 ul de la suspension fécale extrait 10%. Vortexer brièvement et laisser à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Centrifuger la suspension à 6000 g pendant 10 s et laver le culot avec 1 ml de tampon L2 deux fois, suivi par deux lavages avec de l'éthanol 70% et un temps avec de l'acétone. Sécher le culot dans un bloc de chauffage à sec à 56 ° C pendant 5 min. </li><li> Hydrater les ARN dans le culot de silice par addition de 50 pl de RNase dH 2 0. Ajouter 1 ul de RNasin, mélanger en retournant le tube et incuber à 56 ° C pendant 15 min. </li><li> Centrifuger pendant 3 min à pleine vitesse, dans une centrifugeuse de table, et de recueillir 40 ul du surnageant contenant l'ARN. </li><li> Quantifier les échantillons extraits d'ARN en utilisant Nanodrop 2000 spectrophotomètre (Thermo Scientific). Puis stocker à -70 ° C jusqu'à son utilisation, jusqu'à 6 mois. (Remarque: Une meilleure façon de préserver intacte l'ARN total est de le convertir en ADNc). </li></ol> 6. Extraction alternative utilisant l'ARN commercial QIAamp Viral RNA Kit Les instructions complètes se trouvent dans le livret provided avec le kit QIAGEN. En bref, la procédure est comme suit: <ol><li> Ul 560 Pipet de tampon AVL contenant les ARN porteur dans un tube de 1,5 ml, et ajouter 140 ul de la suspension de selles de 10%. Mix par impulsions vortex pendant 15 secondes. Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Ajouter 560 ul d'éthanol (96-100%) pour l'échantillon et mélanger par impulsions vortex pendant 15 secondes, puis centrifuger brièvement. </li><li> Appliquer 630 uL de cette solution à une colonne spin placé dans un tube de 2 mL de collecte. Centrifuger 1 min à 6000 g, puis placez la colonne de spin dans un tube de 2 ml propre. </li><li> Laver la colonne contenant de l'ARN liés avec 500 uL de tampon AW1 et centrifuger à 6000 g pendant 1 min. Lieu colonne dans un endroit propre tube collecteur de 2 ml. </li><li> Laver la colonne avec 500 ul de tampon AW2 et centrifuger à pleine vitesse (20.000 g ou 14 000 tpm) pendant 3 min. </li><li> Colonne spin Placer dans un propre de 1,5 ml de micro-tube à centrifuger, ajouter 40 ul eau traitée au DEPC et éluer l'ARN à pleine vitesse. Répéter l'opération surCE pour un final 80 ul d'ARN élues. </li><li> Quantifier les échantillons extraits d'ARN en utilisant Nanodrop 2000 spectrophotomètre (Thermo Scientific). Puis stocker à -70 ° C jusqu'à son utilisation, jusqu'à 6 mois. (Remarque: Une meilleure façon de préserver intacte l'ARN total est de le convertir en ADNc). </li></ol> 7. Détection des norovirus dans l'ARN extrait par une étape en temps réel RT-PCR avec des sondes TaqMan spécifiques Instrument StepOnePlus PCR en temps réel des systèmes (Applied Biosystems). Méthodologie <ol><li> Essuyer et nettoyer toutes les surfaces de travail, les pipettes et des centrifugeuses avec de la RNase, pour supprimer toute contamination éventuelle RNase. </li><li> Déposer le GI et GII NoV de dépistage master mix selon le tableau 1. Primaires et sondes Taqman sont énumérés dans le tableau 2. </li><li> Aliquote de 10 pl de mélange maître approprié à chaque tube de réaction. </li><li> Ajouter 5 ul de l'échantillon non dilué inconnueARN, eau traitée au DEPC comme contrôle négatif, ou IG, respectivement GII contrôle positif ARN, les puits de réaction correspondantes. Tous les échantillons doivent être analysés en double. Les contrôles positifs et les normes de concentration de 300 ug / uL et 500 ug / uL respectivement ont été fournis par National Calicivirus Laboratoire de contrôle des maladies (CDC). </li><li> Centrifuger la plaque de réaction à 6.000 g pendant 10 sec. </li><li> Dans l'expérience les propriétés de l'écran; définir et sélectionner un type d'expérience pour la course. Assurez-vous que les réactifs TaqMan sont affichés comme le type de réactifs, et que lecture pré-PCR et l'amplification sont sélectionnés. </li><li> Exécuter 15 réactions ul en utilisant le profil thermique dans le Tableau 3. </li><li> Analyser les résultats. </li></ol> 8. Génotypage des NoV GI et GII aide conventionnelle RT-PCR et séquençage (Il n'est pas mentionné dans cette vidéo car il s'agit d'une méthode commune et largement utilisé.) Instrument. Applied Biosystems StepOne et StepOnePlus Systèmes Temps réel PCR avec le modèle Quantitec. Méthodologie <ol><li> Avant le génotypage, le génogroupe (GI ou GII) des échantillons sont déterminés par la projection de RT-PCR décrite ci-dessus. GI NoV ARN doit être amplifié avec le mélange GI maître génotypage et le GII NoV ARN avec le mélange GII génotypage maître. </li><li> Déposer le GI et GII NoV génotypage master mix conformément au tableau 4. Primaires GI SKF / SKR et G2 SKF / SKR sont énumérés dans le tableau 5. </li><li> Aliquoter 45 ul du mélange maître approprié de tubes de 0,2 mL de réaction. </li><li> Ajouter 5 pi de eau traitée au DEPC à chaque tube contrôle négatif, et 5 pi de présélection, NoV (GI et / ou GII) à ARN positif du tube de réaction correspondante. </li><li> Exécuter 50 réactions ul en utilisant le profil thermique dans le Tableau 6. </li><li> Envoyer produits PCR CONTAINing au moins 100 ng / pi de la région amplifiée de capside Macrogen Société pour la purification et le séquençage. (9700 Grande Sénèque autoroute. Rockville, MD 20850 et 10 $ par échantillon par séquençage). </li></ol> 9. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> La figure 1 montre des résultats représentatifs de la Taqman One-Step RT-PCR lorsqu'il est utilisé à l'ARN de dosage extraites à partir d'échantillons de selles d'enfants diarrhéiques. Le cycle seuil (Ct) pour un échantillon positif a été fixé à inférieur ou égal à 37 pour Ct et Ct IG 39 pour GII. Le CT-valeurs pour les contrôles positifs ont été trouvés à moins de 27 et 18 de la jonction ORF1-ORF2 pour GI et GII, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Final Conc </td><td> Volume (pi) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2,875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6,250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 uM Cog R amorce </td><td> 1 uM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 50 uM d'amorce F Cog </td><td> 1uM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 10 sonde Anneau uM </td><td> 1 uM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10,00 </td></tr></tbody></table> * 0,250 ul de chaque sonde a été utilisée pour le test GI, tandis que 0.125 pi de chaque sonde a été utilisée pour les tests GII. Tableau 1. Qiagen Quantitect master mix pour le dépistage GI et GII (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Geno-groupe </td><td> Utiliser </td><td> Séquence (5 'à 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> IG </td><td> Apprêt </td><td> CTT AGA CCG CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> IG </td><td> Apprêt </td><td> CGY TGG ATG CGN ATS CAT AG </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Apprêt </td><td> TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Apprêt </td><td> CAR GAR BCN ATG ATS AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Bague 1A </td><td> IG </td><td> Sonde </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> 1B Anneau </td><td> IG </td><td> Sonde </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Sonde </td><td> FAM-TGG GGC GAT GAG CCG AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Primer et des oligonucléotides sondes utilisées en temps réel RT-PCR quantitative pour génogroupes I, II (Kageyama et al.,2003) 8. <table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp (° C) </td><td> Temps (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> synthèse de l'ADNc </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> Activation HotStart Taq polymérase </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> Cycles 45X </td></tr></tbody></table> Table3. Le profil thermique pour une étape Taqman en temps réel RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Mix Master </td><td> Final Conc </td><td> Volume (pi) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29,50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Buffer </td><td> 1x </td><td> 10,00 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP Mix </td><td> 0,4 mM </td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> Mélange enzyme </td><td></td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> 40 U / uL RNAsin </td><td> 20 U / uL </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 SKF uM </td><td> 0,1 uM </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 SKR uM </td><td> 0,1 uM </td><td> 0,50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45,00 </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix pour le génotypage GI et GII. <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Geno-groupe </td><td> Utiliser </td><td> Séquence (5 'à 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> IG </td><td> Apprêt </td><td> 5'-CTG CCC GAA ATS GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> IG </td><td> Apprêt </td><td> 5'-ACC ACC ACC CAR TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Apprêt </td><td> 5'-CNT GGG GCG AGG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Apprêt </td><td> 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Primaires Tableau 5. Utilisées pour l'amplification de la région C de la région de la capside (Kojima et al., 2002) 5. <table border="1"><tbody><tr><td> Étape </td><td> Temp (° C) </td><td> Temps (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> synthèse de l'ADNc </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> Activation HotStart Taq polymérase </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> Cycles 40X </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Recuit </td></tr></tbody></table> Tableau 6. Profil thermique pour Taqman One-Step RT-PCR.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Utilisation de l&#39;économique dans la maison-méthode pour isoler l&#39;acide nucléique à partir d&#39;échantillons de selles, on obtient des résultats égaux avec le commercial QIAmp virale ARN kit de Qiagen, et avec le TaqMan RT-PCR développée dans notre laboratoire, nous permet de détecter un large éventail de NoV génotypes appartenant à la GI et GII génogroupe. Une publication récente du protocole de la région C ont signalé des taux de génotypage de 78% 6. Depuis la diversité des souches de NoV contempora...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Isothiocyanate de guanidine </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris HCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Silice </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> BDH Chemicals </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Diéthylpyrocarbonate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit (250) </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Inhibiteur de RNase 2000 unités </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / flacon </td></tr><tr><td> Non-Stick microtubes Rnae-libres </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

détection et genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en taqman en une seule étape de rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Les norovirus (NoV) sont la principale cause des épidémies de gastro-entérite aiguë sporadique dans le monde entier chez les humains de tous âges. Ils sont cause importante d&#39;hospitalisation chez les enfants ayant un impact de santé publique semblable à celle de rotavirus. NoV sont des virus à ARN de grande diversité génétique et il ya un aspect continu de nouvelles souches. Cinq génogroupes sont reconnus; GI et GII avec leurs nombreux génotypes et sous-types étant le plus important pour l&#39;infection humaine. Cependant, le diagnostic de ces deux génotypes reste problématique, ce qui retarde le diagnostic et le traitement. 1, 2, 3 Pour l&#39;extraction d&#39;ARN à partir d&#39;échantillons de selles de la méthode la plus couramment utilisée est le kit RNA viral QIAmp commercial de Qiagen. Ce procédé combine les propriétés de liaison d&#39;une membrane de gel de silice, les tampons qui ARNases contrôle et fournir liaison optimales de l&#39;ARN à la colonne ensemble avec la vitesse de MicroSpin. Cette méthode est simple, rapide et fiable et est carrIed dans quelques étapes qui sont détaillées dans la description fournie par le fabricant. Norovirus est la deuxième à rotavirus est la cause la plus fréquente de la diarrhée. Diagnostic norovirus devrait être disponible dans toutes les études sur la pathogenèse de la diarrhée ainsi que dans les foyers ou les cas de diarrhée individuels. À l&#39;heure actuelle le diagnostic norovirus mais est limitée à seulement quelques centres en raison de l&#39;absence de méthodes simples de diagnostic. Ce diagnostic et le traitement des retards 1, 2, 3. En outre, en raison des coûts de transport et réglementé de tampons corrosifs à l&#39;intérieur et entre les pays l&#39;utilisation de ces kits manufacturés pose des problèmes logistiques. En conséquence, dans ce protocole, nous décrivons une alternative, économique, en interne la méthode qui est basée sur la bôme d&#39;origine et al. La méthode 4 qui utilise les propriétés d&#39;acides nucléiques de liaison de particules de silice ainsi que les propriétés anti-nucléase de thiocyanate de guanidinium . <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Pour la détection et la genogrouping (GI et GII) des isolats de NoV échantillons de selles, de plusieurs protocoles de RT-PCR en utilisant des objectifs différents ont été développés. Le consensus est que le RT-PCR en utilisant la chimie TaqMan serait la meilleure technique moléculaire pour le diagnostic, car il combine une grande sensibilité, la spécificité et la reproductibilité avec un débit élevé et la facilité d&#39;utilisation. On décrit ici un dosage cible de la région de lecture ouvert trame 1 (ORF1) de jonction-ORF2; la région la plus conservée du génome de NoV et donc le plus approprié pour le diagnostic. Pour l&#39;analyse génétique en outre une RT-PCR conventionnelle qui vise le très variable N-terminal-shell de la protéine majeure de la capside (région C) en utilisant des amorces décrites à l&#39;origine par Kojima et al. 5 est détaillé. Le séquençage du produit de PCR de la PCR conventionnelle permet la différenciation des génotypes appartenant à la GI et GII génogroupes.

Un One-Step RT-PCR pour la détection et l&#39;identification génogroupe des isolats de norovirus dans les selles des enfants, qui utilise des amorces et des sondes TaqMan spécifiques au cadre de lecture ouvert 1 (ORF1)-ORF2 région de jonction, la région la plus conservée du génome de Norovirus est décrit. Un non-commerciale, rentable méthode d&#39;extraction d&#39;ARN est détaillé.

Détection et Genogrouping des norovirus dans les selles des enfants en Taqman en une seule étape de RT-PCR

Les norovirus (NoV) sont la principale cause d'épidémies de gastroentérites aiguës sporadiques dans le monde chez les humains de tous âges. Ils constituent une cause importante de...

Détection du neurovirus dans l'ARN extrait par RT-PCR en temps réel en une étape avec des sondes TECHMAN spécifiques. Mais aujourd'hui, nous allons parler du neurovirus. Ceci se déroule à Lima, au Pérou, et concerne un groupe de l'université ainsi que de l'université Johns Hopkins.Il s'avère que le norovirus est probablement l'une des causes les plus négligées de diarrhée. Notre équipe a découvert que le norovirus arrive en deuxième position après le coronavirus en ce qui concerne les hospitalisations d'enfants pour diarrhée, ainsi qu'en termes de nombre de cas de diarrhée dans la population. Alors pourquoi le NOROVIRUS n'a-t-il pas été diagnostiqué auparavant ?Eh bien, la raison en est qu'il s'agit d'un virus à ARN que nous ne pouvons pas cultiver, ce qui nécessite des méthodes biologiques moléculaires spéciales pour le diagnostiquer. Ces méthodes utilisées sont la RT-PCR, et cela va démontrer comment utiliser la RT-PCR pour diagnostiquer le neurovirus. Méthode maison Ciag GUINE boom et al. 1989, nous avons utilisé une méthode maison de G guine ATE pour l'extraction de l'ARN viral à partir d'échantillons de selles.Cette méthode constitue une alternative au kit commercial de purification d'ARN viral. Les deux méthodes reposent sur les propriétés de liaison des acides nucléiques par les particules de silice. Associées aux propriétés anti-nucléases de la guanidinium thiocyanate, elles permettent la préparation de la suspension de silice pour l'extraction d'ARN.Pour préparer les particules de silice, prenez 30 grammes de dioxyde de silicium, ajoutez 250 millimètres d'eau déminéralisée et mettez le silicium en suspension par agitation. Après 24 heures de décantation, retirez 215 millilitres du surnageant et remettez en suspension par aspiration dans 250 millilitres d'eau déminéralisée, puis agitez à nouveau pour suspendre le silicium. Après encore 24 heures, éliminez le surnageant par aspiration et ajustez le pH de la suspension de silice à pH 2,0 à l'aide d'acide chlorhydrique. Placez la suspension de silice dans des flacons en verre et effectuez une extraction en autoclave avec du guin et de la silice.Nous allons maintenant examiner l'extraction de l'ARN viral à l'aide des particules de silice préparées lors d'une étape précédente. Conserver à moins 70 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Pour préparer une suspension fécale à 10 %, prendre environ 0,1 gramme de selles et compléter à un millilitre de PBS avant l'extraction.Vortexer les échantillons à faible charge pendant cinq secondes, puis centrifuger à 4 000 tr/min pendant 10 minutes. Dans chaque réaction, inclure un échantillon de selles positif pour le neurovirus comme témoin positif et de l'eau traitée au DEPC dans un tube de microcentrifugeuse. Mélanger les éléments suivants : un millilitre de tampon L6, 20 microlitres des particules de silice préparées et 200 microlitres d'extrait fécal.Vortexez brièvement et laissez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes. Faites une centrifugation pendant 15 secondes. Lavez ensuite le culot deux fois avec le tampon L deux, puis effectuez deux lavages avec de l'éthanol à 70 % et un lavage avec de l'acide on.Séchez le culot dans un bloc chauffant sec à 56 degrés Celsius pendant cinq minutes. Hydratez l'ARN dans le culot de silice en ajoutant 50 microlitres d'eau distillée sans ARN. Ajoutez un microlitre de RNA sin vortex et laissez à 56 degrés Celsius pendant 15 minutes.Centrifuger pendant trois minutes à vitesse maximale et recueillir le surnageant contenant l'ARN. Quantifier les échantillons à l'aide d'une technique sans goutte et conserver l'ARN extrait à moins 70 degrés Celsius. Utiliser ultérieurement une extraction commerciale de l'ARN viral.Nous allons maintenant démontrer l'extraction d'ARN à partir de selles en utilisant le kit commercial Kay Amp Viral RNA. Le kit contient les éléments suivants : colonne MinPin au gel de silice, tampon A-V-L, A-W1, A-W2, A-VE et l'ARN vecteur. Brièvement, la procédure est la suivante.Mélanger une portion du tampon A VL avec de l'ARN vecteur et vortexer. Prélever la solution dans des tubes de 1,5 millilitre contenant 114 microlitres de suspension de selles et mélanger par agitation postérieure. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Faire une courte centrifugation des échantillons.Ajouter de l'éthanol aux échantillons et mélanger par agitation manuelle pendant 15 secondes. Ensuite, centrifuger brièvement, appliquer la solution sur la colonne de centrifugation placée dans un tube de collecte de deux minimales. Faire une centrifugation.Ensuite, placer la colonne de centrifugation dans un nouveau tube de collecte. Laver la colonne avec l'ARN fixé en utilisant le tampon A W1 sans ARN vecteur par centrifugation. Placer la colonne dans un tube de collecte propre de deux millilitres et laver la colonne avec le tampon.Placer la colonne à broche dans un tube microcentrifugeur propre de 1,5 millilitre et effectuer une centrifugation à vitesse maximale dans une centrifugeuse W2. Ensuite, éluer l'ARN à l'aide du tampon A VE et conserver l'ARN viral à moins 70 degrés Celsius jusqu'à son utilisation. Détection du neurovirus dans l'ARN extrait par PCR en temps réel en une étape, à l'aide de sondes spécifiques Techman. Pour préparer un mélange pour la souris, groupe génétique un et groupe Dina deux, maintenir le mélange d'enzyme RT sur de la glace pendant le dosage. Le kit contient les éléments suivants : eau PCO, maîtrise, deux œufs, amorces et sondes pour Dina.Groupes de primers et sonde pour Dina groupe deux. Et enfin, vortexer le mélange d'enzyme RT H avant utilisation, ajouter de l'eau PCR au mélange maître, deux X primers coke G un sens et anti-sens, ainsi que la sonde anneau un A et un B pour UniGroup. Un mélange musculaire et primers COG G deux pour VA sens et sonde.Prélevez deux microlitres pour le mélange maître du groupe Theo deux. Et enfin, ajoutez une enzyme artix aux deux mélanges maîtres du groupe INO. Vortexez, puis ajoutez 10 microlitres du mélange maître approprié dans les puits de réaction.Dans un autre bloc, ajoutez cinq microlitres d'ARN non dilué, cinq microlitres d'ARN témoin positif G1 et G2, et cinq microlitres de témoin négatif dans les roues de réaction correspondantes. Faites une courte centrifugation de 10 secondes à 6 000 g. À l'étape un, le logiciel affiche la configuration avancée.Et dans l'écran des propriétés de l'expérience, l'expérience est identifiée comme étant un norovirus. Le type d'expérience est la présence ou l'absence sur l'écran cible. Saisissez le nom de la cible que vous souhaitez détecter dans la plaque de réaction PCR.Gina, groupe un et deux, rapporteur fam et éteigneur Tamara sur l'échantillon et l'écran de réplication. Saisissez le nombre d'échantillons ainsi que de contrôles positifs et négatifs inclus sur la plaque de réaction, puis sélectionnez les échantillons ou la cible à configurer dans la méthode d'exécution. Commencez par une transcription inverse à 50 degrés Celsius pour la synthèse de l'ADN complémentaire.Ensuite, augmentez la température à 95 degrés Celsius pour activer une polymérase à démarrage chaud. Commencez le cyclage par une durée de 95 degrés Celsius, suivie d'une étape combinée d'hybridation et d'amplification à 60 degrés Celsius. Répétez le cyclage 45 fois, puis revenez à la configuration de la plaque.Cliquez sur «&nbsp;Enregistrer un modèle&nbsp;» et enregistrez l'expérience. Cliquez sur «&nbsp;Démarrer l'exécution&nbsp;». L'écran du tracé d'amplification vous permet de visualiser l'amplification des échantillons pendant que votre instrument collecte les données figées au cours d'une exécution, ainsi que le contraste du tracé.Fluorescence du cycle normalisée et numéro du cycle. Lors des premiers cycles de PCR, il y a peu de changement du signal fluorescent. Ceci définit la ligne de base.Une augmentation de la fluorescence par rapport à la ligne de base indique la détection de l'accumulation de la cible. Un seuil de fluorescence fixe doit être défini au-dessus de la ligne de base. Le paramètre cycle seuil CT est défini comme le numéro de cycle fractionnaire auquel la fluorescence franchit le seuil fixe.L'écran du tracé d'amplification est utile pour identifier et examiner des amplifications anormales, telles qu'une augmentation de la fluorescence dans les puits témoins négatifs ou l'absence de fluorescence détectable à un cycle attendu. La méthode du kit est fiable, mais nécessite une quantité énorme de temps et de ressources. Ici, nous avons présenté une méthode tout aussi fiable, économique, et utilisant des réactifs facilement disponibles localement, évitant ainsi la dépendance à l'égard de matériaux achetés à l'étranger, ce qui permettra in fine un diagnostic plus accessible et un traitement rapide des causes virales les plus fréquentes de gastro-entérite chez les enfants. En utilisant la méthode économique interne d'extraction des acides nucléiques, qui a donné des résultats similaires à ceux-ci.Obtenu avec le kit commercial de Kerogen, associé au TAC MAN, R-T-P-C-R, développé dans notre laboratoire. Nous pouvons détecter un large éventail d'infections par des neurovirus. Ce test s'est révélé utile pour le diagnostic de routine, car il élimine le traitement des produits post-amplification, réduisant ainsi la durée du test.Outre le diagnostic, le protocole peut également être utilisé pour clarifier l'épidémiologie de l'infection par les neurovirus, ce qui en fait un outil utile pour le contrôle sanitaire de cette maladie.

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