Évaluation longitudinale des souris Limb perte osseuse Hind après un traumatisme médullaire utilisant Novel, In vivo Méthodologie

Cette procédure décrit une méthode innovante permettant de détecter et de quantifier la perte temporelle de la densité osseuse des membres postérieurs chez la souris après une lésion de la moelle épinière. Cela est réalisé en réalisant d'abord une lésion de transection spinale chez une souris anesthésiée, en conditions stériles et conformes aux autorisations du comité d'éthique. Ensuite, après une période de récupération, l'animal est réanesthésié et des images radiographiques sont obtenues du tibia et du fibula des deux membres postérieurs droit et gauche.

Cela est effectué une fois par semaine jusqu'à 40 jours après la blessure. Ensuite, une analyse d'image des radiographies est réalisée. La dernière étape consiste à effectuer une évaluation post-mortem de la densité osseuse sur les os des membres postérieurs prélevés.

En fin de compte, les résultats montrent comment la lésion de la moelle épinière induit une perte rapide et progressive de la densité osseuse dans les membres postérieurs de la souris. Cette méthode novatrice offre une excellente résolution spatiale et temporelle en utilisant des doses de rayons X inférieures à celles employées par d'autres modalités d'imagerie. L'ostéoporose est une affection potentiellement mortelle qui touche les personnes vivant avec une lésion de la moelle épinière.

Ce que nous proposons est une nouvelle méthode à utiliser dans les études animales sur les lésions de la moelle épinière, qui permet à un chercheur de suivre longitudinalement, sur de longues périodes, la perte osseuse associée à l'ostéoporose. Cela est important pour deux raisons. Premièrement, cela offrira l'opportunité d'étudier les mécanismes qui régissent le développement de l'ostéoporose.

Deuxièmement, cela nous offre un moyen de tester de nouvelles interventions destinées à prévenir ou éventuellement à inverser le développement de l'ostéoporose chez les patients souffrant d'une lésion de la moelle épinière. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'ostéoporose induite par une lésion de la moelle épinière, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la perte osseuse liée à l'âge survenant chez les femmes ménopausées, ainsi qu'à d'autres diminutions de la densité osseuse provoquées par un traumatisme. L'inactivité des membres résultant d'une immobilisation, suite à une fracture ou à d'autres lésions, peut entraîner une perte osseuse importante pendant le processus de guérison. L'application d'une imagerie aux rayons X à faible dose, longitudinale et sur l'animal entier, pourrait ouvrir de nouvelles voies vers le développement de thérapies conçues pour minimiser ou prévenir ces problèmes.

Réaliser la chirurgie de lésion de la moelle épinière selon les procédures sander et conformément aux lignes directrices du comité institutionnel local de soins aux animaux et d'utilisation. Ensuite, à partir du jour 10, après la chirurgie de la moelle épinière et tous les 10 jours jusqu'au jour 40, évaluer les fémurs et tibias droits et gauches d'animaux vivants anesthésiés ayant subi une transection de la moelle épinière ainsi que des témoins âgés non lésés appariés, en effectuant un balayage à l'aide du système ivus Lumina XR. Avant le balayage, initialiser l'appareil Lumina XR afin que la caméra interne atteigne la température de fonctionnement de moins 90 degrés Celsius.

Placer un animal anesthésié sur la plateforme à l'intérieur du Lumina xr. Insérer ensuite un objectif à fort grossissement afin de pouvoir focaliser sur les régions fémorale et tibiale. Vérifier que le sujet est correctement positionné dans le champ de vision.

Si nécessaire, ouvrez la porte et repositionnez l'animal. Le positionnement correct de l'animal est indiqué ici. Une fois l'animal correctement positionné, la fonction de radiographie peut être exécutée.

Effectuez une sélection dans la liste déroulante d'énergie adaptée à l'animal. Ensuite, ouvrez le panneau de contrôle. Activez la fonction rayons X en cochant l'option rayons X, puis acquérez l'image aux rayons X.

Le fémur et le tibia entiers doivent être visibles, comme illustré ici. Étant donné que le logiciel d'image vivante affiche par défaut des images radiographiques transformées, assurez-vous d'afficher les images radiographiques brutes en accédant au menu des outils de correction de filtrage et en supprimant la coche située à côté de l'absorption radiographique. Les données d'images brutes sont automatiquement enregistrées sur le disque dur.

Des fichiers TIFF représentatifs sont également enregistrés. Après l'acquisition d'images, la souris est ensuite replacée dans sa cage d'origine et laissée se remettre sous l'observation de l'expérimentateur. Le processus est ensuite répété avec la souris suivante.

Tout d'abord, ouvrez le logiciel en double-cliquant sur l'icône de l'image vivante dans la boîte de dialogue qui apparaît. Sélectionnez le dossier souhaité et cliquez sur OK. Chargez une image aux rayons X en cliquant sur le bouton Parcourir.

Le navigateur d'images vivantes affiche les données sélectionnées ainsi que l'identifiant de l'utilisateur. Informations sur les étiquettes et informations sur la configuration de la caméra. Pour ouvrir les données, double-cliquez sur la ligne de données. L'image et la palette d'outils s'affichent.

Les données ouvertes sont mises en évidence en bleu dans le navigateur. Ensuite, cliquez sur les outils de région d'intérêt (ROI). Dans la palette d'outils des outils de ROI, ouvrez la liste déroulante de type et sélectionnez la ROI de mesure.

Pour charger les trois ROI utilisés dans cette expérience, cliquez sur l'icône carrée et chargez les carrés. À l'aide d'une règle, mesurez la longueur du fémur, puis ajustez la longueur des deux carrés à un huitième de la longueur totale du fémur. Réglez la largeur des carrés à un vingt-quatrième de la longueur totale du fémur.

Maintenant, à l’aide de la règle, mesurez un huitième de la distance à partir de l’extrémité proximale du fémur et placez un rectangle de manière à ce qu’il soit centré à cet endroit. Déplacez le deuxième rectangle vers l’extrémité distale du fémur et positionnez-le de sorte qu’il soit centré dans la région trabéculaire du genou. Ensuite, mesurez la longueur du tibia.

Réglez la longueur de la zone à un huitième de la longueur totale du tibia. Réglez la largeur à un trentième de la longueur totale du tibia. Enfin, positionnez la zone de manière à ce qu'elle soit centrée et située à une distance égale à un huitième de la longueur totale du tibia par rapport à l'extrémité proximale du tibia, comme illustré ici.

Ensuite, cliquez sur l'icône de mesure ; les mesures d'intensité des régions d'intérêt apparaissent sur l'image radiographique et le tableau des mesures des régions d'intérêt s'affiche. Exportez ce tableau vers l'emplacement souhaité sous forme de fichier CSV. Cela permettra d'ouvrir le tableau à l'aide d'Excel.

Répétez cette étape avec toutes les images enregistrées devant être analysées. Enfin, regroupez toutes les données dans un seul fichier Excel. La signification statistique est déterminée par un test T de Student à l’aide d’un logiciel tel que Microsoft Excel ou Sigma Plot 11.0. Si désiré, les résultats peuvent être comparés à ceux obtenus à partir de l’analyse post-mortem de la densité osseuse par absorptiométrie à rayons X à double énergie, en utilisant les protocoles standard pour cette méthode.

La perte relative de densité osseuse chez une souris, au niveau du tibia et du fémur après une lésion de la moelle épinière par rapport aux souris naïves, est détectable à l’aide de la méthode décrite ci-dessus. Cette figure montre la perte de densité osseuse après une lésion de la moelle épinière dans le tibia proximal, à 10, 20, 30 et 40 jours après la lésion. Par rapport aux souris naïves appariées par âge, on observe une diminution significative de 12 % de la densité osseuse du tibia dès 10 jours, avec une perte pouvant atteindre 15 % à 40 jours.

Ici, nous observons la perte de densité osseuse après une lésion de la moelle épinière au niveau du fémur proximal, à 10, 20, 30 et 40 jours après la lésion. Par rapport à des sujets naïfs appariés par âge, une diminution de 7 % de la densité osseuse au niveau du fémur proximal a été observée à 40 jours post-lésion. Ce graphique montre la perte de densité osseuse après une lésion de la moelle épinière au niveau du fémur distal, à 10, 20, 30 et 40 jours après la lésion.

Par rapport aux témoins âgés non traités, une perte de densité osseuse au niveau du fémur distal pouvait être observée dès 10 jours après la lésion et persistait pendant le reste de l'expérience. Cette image représentative de données d'absorptiométrie à rayons X à double énergie montre la teneur en minéraux osseux et la densité minérale osseuse. Les fémurs prélevés ont été analysés 40 jours après la lésion médullaire.

Pour comparer l'efficacité de la méthode décrite dans ce protocole à d'autres méthodes actuellement disponibles, cette figure présente une analyse par absorptiométrie à rayons X à double énergie de la teneur en minéraux osseux en grammes dans le fémur de souris ayant subi une lésion de la moelle épinière, 40 jours après la chirurgie, comparées à des souris contrôles appariées en âge. Une perte significative de 12 % de la teneur en minéraux osseux chez les souris présentant une lésion de la moelle épinière par rapport aux souris contrôles a été observée.

Ici, nous observons une analyse par tomodensitométrie à double énergie, avec géométrie extra abor, de la densité minérale osseuse en milligrammes par centimètre carré, au niveau du fémur chez des souris ayant subi une lésion de la moelle épinière, 40 jours après la lésion, comparées à des souris naïves appariées. La perte de densité minérale osseuse n'a pas changé de manière significative, mais suit une tendance similaire à celle de la teneur minérale osseuse une fois maîtrisée. Cette procédure peut être réalisée en 20 à 30 minutes, mais n'oubliez pas qu'il est important de positionner correctement les membres postérieurs.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une idée de la manière d'effectuer une évaluation longitudinale in vivo de la densité osseuse suite à une lésion de la moelle épinière à l'aide du dispositif Caliper Instruments Lumina XR.