L'induction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats

Je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Et dans les prochains jours, je vais vous montrer la procédure d'induction et de mesure de la réaction d'hyper-sensibilité retardée adaptative chez des rats Louis.

Cette procédure dure cinq jours, et je vais vous montrer comment activer des lymphocytes T spécifiques d'un antigène, puis, deux jours plus tard, comment les injecter initialement à des rats naïfs. Deux jours après, nous allons provoquer une réaction chez les rats en injectant l'antigène dans les oreilles, antigène auquel ces lymphocytes T sont spécifiques. Et un jour plus tard, nous mesurerons le degré d'inflammation chez ces rats.

Pour obtenir du sérum pour ma culture tissulaire, je dois prélever le sang. Pour cela, je réalise une ponction cardiaque. Je place mon index gauche sur le plexus solaire et j'atteins le cœur en passant entre les côtes avec mon aiguille, puis j'aspire autant de sang que possible.

Et à partir d'un seul prélèvement, selon le jour et l'efficacité, nous pouvons obtenir entre deux et dix millilitres de sang d'un rat donné. La raison pour laquelle nous avons besoin de sérum dans la culture est que nous souhaitons faire croître des cellules, à savoir des cellules de rat Louis, dans un sérum syngénique. Il s'agira donc de sérum de rat Louis.

Je transfère ensuite le sang dans un tube, mais je prends soin de retirer l'aiguille de la seringue afin d'éviter l'hémolyse, car je souhaite utiliser mon sérum pour ma culture tissulaire par la suite. Maintenant, je vais retirer le thymus puisque le cœur a cessé de battre et que le rat est mort.

Je vaporise donc d'abord avec de l'éthanol à 70 % pour m'assurer qu'aucun poil ne se disperse et n'entre dans mon organe, car je dois l'utiliser pour la culture tissulaire. J'utilise des instruments stérilisés au autoclave pour effectuer la dissection. J'incise donc d'abord la peau.

Une fois que j'ai retiré la peau, je coupe soigneusement de chaque côté de la cage thoracique afin de ne pas endommager le thymus, qui se situe juste au-dessus du cœur. Le thymus apparaît ici comme un organe pâle, presque blanc, situé juste au-dessus du cœur. Je le prélève donc en veillant à récupérer tout l'organe, sans toutefois être trop minutieux quant à son extraction propre, car je le nettoierai ultérieurement sous la hotte.

Et je la place simplement dans un tube contenant du PBS que j'ai supplémenté avec de la pénicilline et de la streptomycine. Pour éviter toute croissance bactérienne, je vais maintenant réaliser une suspension monocellulaire de mon cyte. Pour cela, j'utiliserai un tamis cellulaire de 70 microns.

Et je vais utiliser, bien sûr, tout équipement stérile. Je transfère le thymus dans une boîte de Pétri. Et comme vous pouvez le voir, ce n'est pas très propre.

Le thymus est un organe blanchâtre sur lequel se trouvent des ganglions lymphatiques et des caillots sanguins. Je vais donc les retirer. Ensuite, je vais ajouter environ 10 ml de PBS supplémenté avec des antibiotiques dans mon tamis cellulaire afin de le préparer à recevoir le thymus une fois qu'il sera nettoyé.

Pour le nettoyer, j'élimine simplement toutes les impuretés de mon thymus. Mon thymus est désormais presque entièrement propre ; je vais donc le prendre avec ma pince et le découper en petits morceaux à l’aide de mes ciseaux au-dessus du tamis cellulaire, puis introduire tous les petits morceaux de thymus dans le tamis cellulaire. Une fois cette étape terminée, j’utiliserai le piston d’une seringue d’un millilitre, stérile bien sûr, afin d’obtenir une suspension simple de cellules en pressant les morceaux de tissu à travers le tamis cellulaire.

Et les cellules isolées vont passer à travers et se retrouver dans mon PBS à l'extérieur du cell trainer. J'ai donc fait passer mes cellules à travers le cell trainer et vous pouvez constater que le PBS n'est plus limpide. Il est maintenant rempli de ma suspension de cellules isolées que je vais transférer dans un tube de 50 ml que je maintiens sur glace.

Et je vais répéter la procédure plusieurs fois en rechargeant mon filtre à cellules avec du PBS, en appuyant davantage avec le piston de ma seringue et en transférant dans mon tube jusqu'à ce que j'aie entre 30 et 40 ml de PBS dans mon tube. Voici à quoi ressemble le filtre à cellules une fois que j'ai terminé. Maintenant que j'ai récupéré toutes les cellules, je vais les centrifuger pendant environ 10 minutes à 1200 tr/min.

Voici les cellules que j'ai sorties de la centrifugeuse et le culot est assez important, ce qui est attendu après une seule centrifugation. Je vais maintenant éliminer le surnageant. Le culot reste bien sûr au fond du tube. Pour faciliter la suspension, je vais broyer le culot pendant qu'il est encore presque sec.

Et pour cela, je tape simplement avec mon doigt assez fort jusqu'à ce que vous voyiez que le tissu pulmonaire est complètement désagrégé et que nous avons, nous retrouvons une suspension monocellulaire. Je vais maintenant resuspendre mes cellules dans du PBS stérile et j'ajoute cinq millilitres de PBS par fragment. Et comme je n'ai qu'un seul fragment, j'ajoute simplement cinq millilitres.

Et ceci est la suspension que je vais introduire dans l'irrigateur à l'origine. Le niveau d'irrigation que j'utilise est de 30 degrés afin de m'assurer que les cellules soient encore vivantes mais qu'elles mourront en quelques heures. Ainsi, elles peuvent encore traiter l'antigène, mais elles n'entacheront pas ma culture.

Si nous examinons les cellules T que nous souhaitons activer, nous constatons qu'elles n'ont pas du tout un aspect sain. Certaines ont commencé à mourir. Elles présentent des formes étranges et ne sont plus retrouvées.

Ainsi, ces cellules sont prêtes à être activées. Elles sont en réalité très sensibles à l'antigène après les sites temporels. Il est extrêmement important de les laver rapidement, car certaines d'entre elles seront mortes et pourraient libérer des composés toxiques dans la solution.

Donc, j'ajoute, je complète le tube jusqu'à 50 mils avec ma solution PBS. Et en même temps, je vais transférer les lymphocytes T en attente de stimulation. Je vais les transférer dans un autre tube de 50 mils afin de pouvoir centrifuger les deux tubes simultanément.

Voici donc le sang que j'ai prélevé il y a un moment, que j'ai laissé pendant 10 minutes à 37 degrés, puis mis sur de la glace. Comme vous pouvez le constater, il est complètement coagulé. J'ai donc besoin du sérum contenu dans ce sang.

Pour le recueillir dans la première étape à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, je vais détacher le caillot du tube et recueillir tout le liquide, qui contiendra le sérum qui m’intéresse, ainsi que certaines cellules qui n’ont pas été piégées dans le caillot. Ce liquide sera transféré dans un autre tube ; lors du transfert, de petits morceaux de caillot peuvent parfois accompagner le liquide, mais cela ne pose pas un grand problème, car je dois de toute façon éliminer les cellules encore présentes dans ce liquide.

Je vais donc centrifuger mon petit tube contenant le liquide. Cela permettra d'éliminer les cellules ainsi que tout caillot éventuel. Je vais maintenant faire tourner la partie liquide du sang afin de séparer les cellules du sérum. Une rotation de deux minutes sera suffisante.

Le sérum a maintenant été centrifugé, donc je vais prélever le sérum en le séparant des cellules. Ce n'est pas un exemple parfait, car le sérum devrait être jaunâtre, alors que celui-ci est rougeâtre, ce qui indique une hémolyse. Ce résultat n'est donc pas tout à fait idéal, mais je vais quand même vous montrer comment je le filtre.

J'utilise une seringue munie d'un filtre de 0,2 micron afin de filtrer mon sérum pour m'assurer qu'il est stérile. Toutefois, en raison de l'hémolyse, je n'utiliserai pas ce sérum pour ma stimulation. J'emploierai plutôt le sérum de rat de Louis qui avait été congelé lors d'une expérience précédente.

Voici les tubes de culture des lymphocytes T à gauche et des cellules présentatrices d'antigène à droite. Je vais maintenant éliminer le surnageant des deux tubes. Comme précédemment, je vais briser les culots en tapotant avec mon doigt afin de m'assurer que les cellules reviennent à une suspension monocellulaire.

Et je vais faire cela pour les deux populations de cellules, les cellules T et les cellules présentatrices d'antigène. Après cela, je vais les mettre en suspension et je vais les compter. Ensuite, je vais mélanger 3 millions de cellules T avec 150 millions de cellules présentatrices d'antigène, et je vais les placer dans des boîtes de Pétri de 10 centimètres de diamètre.

Et dans un volume total de 10 mils, voici deux tubes de sérum. Celui de droite est celui que j'ai préparé aujourd'hui et il est rougeâtre en raison de l'hémolyse, tandis que celui de gauche est un tube que j'ai préparé il y a quelques jours et que j'ai conservé congelé. Il est jaunâtre, ne présente aucune hémolyse et est beaucoup meilleur.

C'est celui que je vais utiliser pour ma culture tissulaire aujourd'hui. J'ai suffisamment de cellules pour stimuler six boîtes de Pétri, donc je vais ajouter 30 mL de milieu dans les cellules présentatrices d'antigène et 30 mL du même milieu dans les cellules T. Ensuite, dans le tube contenant les cellules présentatrices d'antigène, je vais ajouter l'antigène, qui est de l'albumine.

Ma solution mère est à un milligramme par ml et je souhaite une concentration finale dans mes boîtes de Pétri de 10 microgrammes par ml. Dans le milieu T-cell, je vais ajouter le sérum de rat Louis. J'en ajouterai une quantité suffisante pour obtenir, au final dans mes boîtes de Pétri, 1 % de sérum de rat.

Je vais homogénéiser ma suspension de cellules présentatrices d'antigènes, puis je vais transférer cinq millilitres de cette suspension cellulaire dans chacune de mes boîtes de Pétri. Lorsque vous prélèverez votre suspension de cellules présentatrices d'antigènes, vous remarquerez toujours une petite agrégation de tissu adipeux et fibreux. C'est tout à fait normal.

Il est présent à chaque fois lors de nos préparations de site. Il n'y a rien à craindre. Je m'en débarrasse donc simplement si j'y parviens, sinon je le laisse simplement dans la boîte de Pétri.

Cela n'affecte en rien ma culture cellulaire. Une fois que j'aurai transféré toutes les CPA dans mes boîtes de Pétri, je répéterai la procédure avec les lymphocytes T. Je vais donc ajouter cinq millilitres de suspension de lymphocytes T dans chacune de ces boîtes de Pétri.

Maintenant, toutes mes cellules se trouvent dans les boîtes de Pétri, et il est très important de les mélanger soigneusement afin que chaque lymphocyte T ait la possibilité d'entrer en contact avec une cellule présentatrice d'antigène. Pour cela, j'empile mes boîtes de Pétri et je vais les mélanger en traçant des huit invisibles. Je répète cette opération plusieurs fois pour m'assurer que toutes les cellules sont bien homogénéisées.

Et une fois que j'aurai terminé tout le mélange, je placerai ces boîtes dans un incubateur sous atmosphère humide à 37 degrés C et 5 %CO2. Elles ont été en incubation pendant 48 heures. Le milieu a légèrement changé de couleur, il est désormais plus orangé, et les cellules ont été correctement activées.

Je vérifie donc un par un tous les boîtes de Pétri au microscope. Les cellules très grosses sont les lymphocytes T activés et les très petites sont les cellules présentatrices d'antigène mortes. La stimulation est très bonne, car on peut voir que les lymphocytes T sont énormes.

Et si je déplace un peu la boîte de Pétri, oups, vous voyez sur le côté gauche ici, maintenant elle est au centre, il y a un gros agrégat de cellules et ce sont des cellules en train de se diviser activement. Je vais donc maintenant mettre toutes les cellules dans des tubes de centrifugation afin de pouvoir les centrifuger, les compter, puis en injecter 10 millions aux rats. La stimulation ayant été si bonne, je n'ai pas besoin de toutes ces cellules T pour en injecter à un seul rat.

Donc, ce que je vais faire, c'est n'utiliser que des cellules provenant de deux boîtes de Pétri. Je vais les centrifuger séparément afin d'injecter 10 millions à un rat et conserver le reste des cellules. Je vais les mettre en culture pour les congeler dans quelques jours.

Et le milieu de culture est le milieu habituel de culture des lymphocytes T auquel on ajoute le facteur de croissance des lymphocytes T et du sérum de cheval. Eh bien, les lymphocytes T sont non adhérents, donc je n'ai pas besoin de faire grand-chose. Je m'assure simplement que la majorité des cellules sont transférées avec le milieu.

Ensuite, ce que je ferai à la fin, c'est rincer toutes les boîtes à pétri avec du milieu neuf pour m'assurer de récupérer toutes les cellules. Dix millilitres de milieu, le même que celui utilisé pour la stimulation, puis je pense à chaque boîte, mais les lymphocytes T sont déjà passés lors de la première fois où j'ai prélevé le milieu. Normalement, le milieu sort de cette boîte, ce n'est pas absolument nécessaire, mais comme ces cellules sont précieuses, je ne veux en perdre aucune.

Je vais donc les centrifuger. Cela permettra d'éliminer certaines cellules mortes et de commencer principalement avec les cellules viables. Je souhaite leur ajouter un milieu frais.

Je vais donc à nouveau centrifuger à 1 500 tr/min pendant environ huit minutes. Je laisse toujours le frein activé, car je me contente de ramener les cellules. Nous centrifugeons donc brièvement les deux échantillons, et dans l'un d'eux, j'obtiens de petits culots.

Cela provient des deux boîtes de Pétri. Et voici le culot des quatre boîtes de Pétri. Les culots sont importants car ils contiennent non seulement les lymphocytes T activés, mais aussi les cellules présentatrices d'antigène.

Maintenant, je vais vider le surnageant et, pour les cellules que je vais injecter ici, j'ajouterai un millilitre de milieu, que j'utiliserai pour réaliser l'injection proprement dite. Pour les autres cellules, je les mettrai en suspension dans cent microlitres de milieu de culture contenant un facteur de croissance pour les lymphocytes T et du sérum de cheval. Ce sont ces cellules-là que je vais injecter.

Et pour ces cellules, je vais les placer dans deux flacons de 50 ml chacun. Dans chaque flacon, je vais ajouter 10 % de facteur de croissance des lymphocytes T, qui est du sérum de foie. J'ajoute également 10 % de sérum de cheval activé par la chaleur.

Ensuite, je vais ajouter la majeure partie du milieu dont j'ai besoin. Je ne pipette pas en montant et en descendant, car les lymphocytes T n'aiment pas être trop manipulés par pipetage. J'ajoute donc uniquement la quantité minimale absolument nécessaire, puis je complète simplement et ils sont prêts.

Ils sont prêts à être placés dans l'incubateur, je les vérifie chaque jour. Je devrai probablement les diviser après 24 heures, sinon après 40 à 48 heures, c'est certain. Mais je les surveillerai quotidiennement.

Ils ont tendance à se développer très rapidement en présence de facteur de croissance pour les lymphocytes T. Ils doivent donc être divisés au moins toutes les 48 heures, probablement plus tôt. Je vérifierai également la couleur du milieu de culture.

Maintenant, elles sont activées, donc complètement activées. C'est le meilleur moment pour les injecter au rat. Et dans deux jours, nous soumettrons le rat à une provocation au niveau de l'oreille.

Si nous attendons que les cellules, si nous attendons quelques jours pour que les cellules reviennent au repos, elles retournent rapidement vers le site de l'inflammation. Je vais donc maintenant les placer dans l'incubateur à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2, et j'utiliserai une aiguille de calibre 25 pour injecter le rat init. Maintenant que les cellules ont été injectées in situ, je vais laisser le rat ici et je vais provoquer une réaction dans les oreilles 48 heures plus tard.

Il y a quelques jours, j'ai injecté des lymphocytes T spécifiques de l'albumine marqués avec la GFP dans un rat. Aujourd'hui, je vais provoquer une réaction chez ce même rat au niveau de l'oreille. Dans l'oreille droite, j'injecterai de l'albumine.

Et dans l'oreille gauche, je vais simplement injecter du PBS. La dose de volin que j'injecte est de 20 microgrammes dans 20 microlitres. Et l'albumine que j'utilise est un mélange un pour un d'albumine marquée par le Texas red et d'albumine non marquée.

Donc, voici les toilettes sur lesquelles je vais vous montrer comment je vais procéder à l'injection. J'ai donc ma main gauche, étant droitier. J'ai retiré le gant de ma main gauche afin de pouvoir placer un doigt sous l'oreille et l'autre au-dessus, pour tendre la peau et voir précisément où se trouve l'aiguille, puis pénétrer entre les deux couches de peau dans l'air, qui est très fine.

Pour cela, j'utilise des aiguilles de calibre 27 afin d'avoir un instrument extrêmement fin à insérer. Ainsi, si je retourne l'échantillon, on voit clairement où est allé le Texas red et où est allé le PBS. Nous sommes désormais à 42 heures après le défi de l'année, et je vais utiliser un micromètre à ressort pour mesurer l'épaisseur de l'oreille.

Je vais donc mesurer les deux oreilles, l'oreille droite qui a été stimulée avec l'albumine et l'oreille gauche qui n'a pas été stimulée. Et la différence d'épaisseur entre les oreilles nous donnera une indication de l'intensité de l'inflammation. Ce que je vous ai montré ici correspond à l'ensemble de la procédure permettant de réaliser une réaction d'hypersensibilité retardée adaptative chez le rat.

J'ai donc montré comment activer des lymphocytes T spécifiques d'un antigène in vitro, comment les transférer adoptivement dans des rats, puis comment provoquer une réaction chez ces rats et mesurer le degré d'inflammation. Dans le laboratoire de Chand, nous utilisons couramment cette procédure pour tester l'effet de bloqueurs des canaux potassiques sur l'inflammation chez le rat.