Name: Linduction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Apprenez à induire et surveiller l'hypersensibilité de type retardé chez les rats Lewis en activant des cellules TEM spécifiques à l'antigène. Cette méthode permet d'étudier les réponses inflammatoires in vivo.

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Nous remercions le Dr Alexander Flügel (Martinsried, Allemagne) pour nous avoir fourni la GFP-étiquetée, l&#39;ovalbumine spécifiques lignée cellulaire T utilisé dans ce protocole.

1. La stimulation des lymphocytes T spécifiques d&#39;ovalbumine Repos ovalbumine cellules T spécifiques sont stimulés avec de l&#39;ovalbumine en présence des thymocytes irradiés de rats Lewis (30 Gy) comme des cellules présentatrices d&#39;antigènes (APC), en milieu de stimulation (Préparer dans du DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamines + + 2ME sérum de rat + ovalbumine, à la concentration finale noté dans la liste des matériaux.) Préparation de sérum de rat <ol><li> Nous prenons sérum du rat nous sacrifier en tant que donateurs thymus. </li><li> Les rats sont profondément anesthésiés par inhalation d&#39;halothane et autant de sang que possible est dessiné par perfusion cardiaque (5-10 ml par rat) en utilisant 10 ml et les seringues 23 G 1 &quot;aiguilles, après laquelle les rats sont immédiatement décapités pour assurer la mort. </li><li> Le sang est autorisé à se coaguler pendant 10 min à 37 ° C suivi de 10 min sur la glace. </li><li> Le caillot est retiré et le liquide restant filé. </li><li> Le sérum est recueilli, stérilisée par filtration et conservés à -20 ° C. </li></ol> Préparation des cellules présentatrices d&#39;antigènes <ol><li> Prenez le thymus d&#39;un rat décapité à l&#39;aide d&#39;instruments stériles et placez-le dans du PBS contenant de la pénicilline et la streptomycine (PBS-PS), sur la glace. </li><li> Prenez le thymus pour une hotte de culture de tissus, de le nettoyer de caillots de sang et autres tissus contaminant et le couper en petits morceaux dans une passoire cellule (Fisher # 08-771-2) placé dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 10 ml de PBS- PS. </li><li> Chaque pièce est pressé à travers le tamis de cellules en utilisant le dos d&#39;un piston de la seringue stérile de 1 ml. Recueillir la suspension seule cellule dans un tube de 50 ml sur la glace. </li><li> Rincer la crépine cellule avec plus de 20-40 ml de PBS-PS. Centrifuger la suspension à 1250g et resuspendre le culot dans du PBS-PS, 5 ml / thymus, sur la glace. </li><li> Irradier cette suspension (30 Gy) dans un irradiateur gamma et immédiatement laver deux fois avec 50 ml de PBS-PS. Remarque: Le meilleur des donateurs du thymus sont de jeunes rats adultes, des semaines 5-7 ans. Les rats jusqu&#39;à 10 semaines peuvent être utilisés mais le nombre de cellules diminue avec le temps. Sexe n&#39;est pas important, bien que certaines personnes disent que les hommes sont mieux donateurs thymus. Nous utilisons toujours les femmes parce que tous nos animaux sont logés dans la même chambre et nous ne voulons pas les mâles et les femelles dans la même pièce. </li></ol> La stimulation <ol><li> Lavez les lymphocytes T une fois et les compter. </li><li> Compter les cellules présentatrices d&#39;antigène. </li><li> Mélanger 3 x 10 6 ovalbumine cellules T spécifiques de 150 x 10 6 TTB dans un plat de 10 cm de Pétri contenant 10 ml de milieu de stimulation. </li><li> Incuber pendant 48 heures à 37 ° C. </li></ol> 2. Le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques d&#39;ovalbumine <ol><li> Les rats que nous utilisons en tant que bénéficiaires sont des femmes de 70 à 10 semaines. </li><li> Comptez le nombre de lymphocytes T, ils doivent être grands et ronds. Les cellules présentatrices d&#39;antigène sera mort. </li><li> Centrifuger les lymphocytes T et les remettre en suspension à 10 x 10 6 cellules / ml dans le PBS. </li><li> Injecter 1 ml par voie intrapéritonéale en utilisant 3 ml et les seringues 23 G 1 &quot;aiguilles. </li></ol> 3. Défi avec l&#39;antigène dans l&#39;oreille <ol><li> Deux jours après le transfert adoptif, injecter 20 ul d&#39;une solution à 1 mg / ml d&#39;ovalbumine (antigène = lieu) dans une oreille et une solution saline (ou antigène non pertinent) dans l&#39;autre oreille. Ne pas filtrer la solution d&#39;antigène que vous risquez de perdre des agrégats qui améliorent la réaction inflammatoire. Remarque: Les rats doivent être anesthésiés pour éviter les mouvements. Si vous êtes droitier, tenez l&#39;oreille entre le pouce et l&#39;index gauche, l&#39;index étant à l&#39;intérieur de l&#39;oreille et le rat en face de vous. </li><li> Injectez la solution dans le pavillon de l&#39;oreille à l&#39;aide 27G ½ &quot;aiguilles. Essayez d&#39;injecter tous les rats exactement au même endroit. </li></ol> 4. Mesure de la SRD <ol><li> Les oreilles vont commencer à tourner rouge et gonflent en tant que signe d&#39;inflammation. Mesurer l&#39;épaisseur de chaque oreille avec un micromètre à ressort (pour le modèle par exemple PK-0505 de Mitutoyo). </li><li> Prendre 5-6 mesures pour chaque oreille à chaque point dans le temps et calculer la moyenne. </li><li> Le gonflement maximal devrait se produire entre 24 et 72 heures. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

La stimulation antigénique peut également être effectuée à d&#39;autres sites, par exemple dans la peau du dos (2). Nous avons cependant trouvé que la contestation. Utilisation du pavillon de l&#39;oreille, comme le montre cette vidéo, permet la mesure la plus précise de la réaction de DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, par Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM final, dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Pénicilline &amp;#8211; Streptomycine &amp;#8211; L-Glutamine</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM respectivement, concentration finale, dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1 % final, dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Vitamines RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1 % final, dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Bêta-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M final, dans le milieu de stimulation</td></tr><tr><td>Sérum de rat syngénique</td><td></td><td></td><td>1 % final. Voir l'explication dans le protocole.</td></tr><tr><td>Ovalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml final, dans le milieu de stimulation.</td></tr></tbody></table>

l&#39;induction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Type de l&#39;hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-lymphocytes T effecteurs mémoire qui infiltrent le site de l&#39;injection d&#39;un antigène contre lequel le système immunitaire a été amorcée. La réaction inflammatoire est caractérisée par une rougeur et une enflure du site de stimulation antigénique. C&#39;est un modèle pratique pour déterminer l&#39;efficacité in vivo d&#39;immunosuppresseurs. SRD cutanée peut être induite soit par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques d&#39;antigènes ou par l&#39;immunisation active avec un antigène, et les suivantes défi intradermique avec l&#39;antigène pour induire la réaction inflammatoire dans une zone de peau donnés. Réponses DTH peuvent être induites à des antigènes différents, par exemple pour l&#39;ovalbumine, la tuberculine, anatoxine tétanique, ou hémocyanine de patelle. Ces réactions peuvent aussi être induite contre les autoantigènes, par exemple pour la protéine de myéline de base (MBP) chez le rat avec l&#39;encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par le MBP, un modèle animal de sclérose en plaques (1). Ici nous démontrons comment induire une réaction adoptifs SRD chez le rat Lewis. Nous allons d&#39;abord stimuler les cellules T spécifiques de l&#39;ovalbumine, in vitro et injecter ces cellules activées par voie intrapéritonéale à des rats naïfs. Après avoir laissé les cellules in vivo pour s&#39;équilibrer pendant 2 jours, nous mettra au défi les rats avec de l&#39;ovalbumine dans le pavillon d&#39;une oreille, tandis que l&#39;autre oreille wil recevez saline. La réaction inflammatoire sera visible 3-72 heures plus tard et l&#39;épaisseur de l&#39;oreille va être mesurée comme une indication de la gravité de SRD.

Type de l&#39;hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-effectrices T mémoire (TEM) des lymphocytes. Ici nous démontrons comment activer les cellules spécifiques de l&#39;antigène TEM, induisent SRD adoptifs chez le rat Lewis et de surveiller la réponse inflammatoire.

L&#39;induction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats

L'hypersensibilité retardée (HDR) est une réaction inflammatoire médiée par des lymphocytes T à mémoire effecteurs CCR7+ qui infiltrent le site d'injection de...

Je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Et dans les prochains jours, je vais vous montrer la procédure d'induction et de mesure de la réaction d'hyper-sensibilité retardée adaptative chez des rats Louis.Cette procédure dure cinq jours, et je vais vous montrer comment activer des lymphocytes T spécifiques d'un antigène, puis, deux jours plus tard, comment les injecter initialement à des rats naïfs. Deux jours après, nous allons provoquer une réaction chez les rats en injectant l'antigène dans les oreilles, antigène auquel ces lymphocytes T sont spécifiques. Et un jour plus tard, nous mesurerons le degré d'inflammation chez ces rats.Pour obtenir du sérum pour ma culture tissulaire, je dois prélever le sang. Pour cela, je réalise une ponction cardiaque. Je place mon index gauche sur le plexus solaire et j'atteins le cœur en passant entre les côtes avec mon aiguille, puis j'aspire autant de sang que possible.Et à partir d'un seul prélèvement, selon le jour et l'efficacité, nous pouvons obtenir entre deux et dix millilitres de sang d'un rat donné. La

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Cette vidéo montre le score d'induction et cliniques d'un modèle animal de sclérose en plaques: chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale chez des rats DA. La maladie, provoquée par les rats immunisant avec une émulsion contenant la moelle épinière de rats et de toute l'adjuvant complet de Freund, présente des signes cliniques ressemblant à la maladie humaine.

Induction et notation clinique de chronique récurrente encéphalomyélite allergique expérimentale

Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-lymphocytes T effecteurs mémoire. Ici nous démontrons comment provoquer SRD actifs chez le rat Lewis et de surveiller la réponse inflammatoire.

L&#39;induction et le suivi des actifs d&#39;hypersensibilité de type retardé (DTH) chez les rats

Ici nous démontrons une méthode pour induire et d'enregistrer les progrès d'un retard de type hypersensibilité (SRD) réaction de l'oreille chez le rat. Elle est suivie par une démonstration de la préparation du tissu de l'oreille chez le rat pour l'imagerie à deux photons de la réponse cellulaire effecteur / T mémoire.

Imagerie Les cellules T effectrices de mémoire dans l&#39;oreille après induction de SRD adoptifs

Cette vidéo montre comment provoquer hypophysite auto-immunes chez la souris SJL et comment évaluer sa gravité par histopathologie.

L&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale chez la souris SJL

Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l&#39;antigène

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Effets de l’exposition de formaldéhyde à un modèle de Rat de la dermatite atopique induite par le traitement néonatale capsaïcine

Ce protocole utilise des peptides mixtes G6PI pour construire des modèles de polyarthrite rhumatoïde qui sont plus proches de celui de la polyarthrite rhumatoïde humaine dans les cellulesT CD4 et cytokines. Des lymphocytes T tueurs naturels invariants de haute pureté (principalement iNKT2) avec des phénotypes et des fonctions spécifiques ont été obtenus par induction in vivo et purification in vitro pour l'immunothérapie adoptive.

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Apprenez à induire et surveiller l'hypersensibilité de type retardé chez les rats Lewis en activant des cellules TEM spécifiques à l'antigène. Cette méthode permet d'étudier les réponses inflammatoires in vivo.

L'induction et la surveillance des parents adoptifs hypersensibilité de type retardé chez les rats

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