Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Cette vidéo montre comment construire un microscope confocal à balayage vidéo à l’aide de composants standard prêts à l’emploi. Un microscope confocal à balayage repose sur le mouvement coordonné de deux miroirs de balayage pour traduire le faisceau à travers le plan raster : la lumière du premier miroir est balayée horizontalement à travers le premier ensemble de lentilles relais, ce qui la focalise vers un point stationnaire sur le deuxième miroir de balayage. Le même mouvement de balayage est ensuite traduit à travers les lentilles de balayage et de tube, plaçant le faisceau lumineux maintenant élargi sur l’ouverture arrière de l’objectif.

Le deuxième miroir, dont le mouvement est lent par rapport au premier, balaie simultanément l’axe Y, ce qui permet une action de balayage au-dessus et au-dessous du plan illustré et crée une trame rectangulaire sur la surface de l’échantillon. Le principal avantage de ce protocole par rapport à l’achat d’un microscope disponible dans le commerce est son faible coût et la possibilité de personnaliser l’instrument en fonction des besoins spécifiques d’un projet d’imagerie. Lorsque vous travaillez avec n’importe quel laser, il est essentiel de prendre des mesures de sécurité appropriées pour éviter les blessures à l’œil.

Assurez-vous de porter les lunettes de sécurité laser appropriées dans la mesure du possible. Les spectateurs et/ou les chercheurs qui n’alignent pas ou ne travaillent pas activement avec le faisceau doivent toujours porter des lunettes. Retirez toutes les montres ou bijoux brillants et réfléchissants.

Plus important encore, assurez-vous de suivre et de contrôler le faisceau à tout moment en terminant son chemin à l’aide d’un bloc de faisceau ou d’une carte de visite montée. Ceci est particulièrement important lors de la doublure des miroirs, car la trajectoire du faisceau peut être difficile à prévoir. De plus, ne mettez jamais vos yeux au niveau de la trajectoire du faisceau.

Éteignez le laser si vous devez traverser le plan du faisceau avant d’assembler le microscope. Assurez-vous que tout l’équipement nécessaire à la construction est disponible, y compris la plaque d’essai optique et les supports à 90 degrés, tous les miroirs, lentilles et dichroïques, ainsi que les pinces et le matériel de montage appropriés, les miroirs de balayage et le photodétecteur. Il est également utile d’avoir un générateur de fonctions à portée de main pour tester l’action de balayage et manipuler les miroirs pendant l’alignement.

Il est également fortement suggéré de boulonner la planche d’essai pour plus de stabilité. Commencez la construction du microscope en plaçant le fibre en queue de cochon dans la monture optique et en plaçant cet ensemble au milieu de la plaque d’essai optique. Cela correspond à l’origine du faisceau bleu comme indiqué ici.

Allumez la source de lumière. Utilisez les vis de réglage pour ajuster grossièrement le faisceau de sorte qu’il se déplace en ligne droite à la fois horizontalement et verticalement. Placez un iris devant l’assembleur de fibres.

Ensuite, ajustez la hauteur de l’iris de manière à ce que le faisceau passe par le centre. Éloignez ensuite l’iris de l’ateur le long de la trajectoire du faisceau. Vérifiez l’alignement de la poutre.

Utilisez les deux vis de réglage pour repositionner le faisceau sur l’iris si nécessaire. Placez le miroir diic monté dans le trajet du faisceau avec le faisceau laser positionné au centre du miroir. Faites pivoter le support de miroir pour refléter le faisceau à environ 90 degrés, en vous assurant que la hauteur du faisceau ne change pas.

Fixez le miroir à la table en serrant les vis du support. Placez ensuite le miroir métrique galvan résonnant monté dans la trajectoire du faisceau laser. En prenant soin de s’assurer que le faisceau laser est positionné exactement au centre horizontal de la surface du miroir.

Faites pivoter le support du miroir pour réfléchir le faisceau laser à un angle de 90 degrés. Ensuite, ajustez grossièrement la réflexion sur le miroir pour maintenir la même hauteur verticale du faisceau laser. Ensuite, prenez deux iris et placez-les directement devant la fille résonnante.

Ensuite, à l’aide du faisceau laser réfléchi par le miroir résonnant comme référence, réglez leur hauteur verticale comme précédemment. Maintenant, à l’aide des trous de vis sur la plaque d’essai optique comme guide vers l’œil, fixez les deux iris en ligne droite. Ajustez le premier miroir dans la trajectoire, qui est le dichroïque pour centrer le faisceau sur le premier iris.

Ajustez ensuite le deuxième miroir dans le chemin. La fille résonnante pour centrer le faisceau sur le deuxième iris. Ajustez itérativement ces deux miroirs jusqu’à ce que le faisceau soit aligné à travers les deux iris.

S’assurer que le faisceau laser réfléchi par le miroir résonnant est toujours réfléchi à partir du centre approximatif du miroir. Si le faisceau est dévié, ajustez le support de l’assembleur de fibres et répétez les ajustements avec le faisceau centré sur les deux iris ouverts. L’étape suivante consiste à placer les deux lentilles relais qui imageront le premier plan télécentrique stationnaire sur le deuxième plan télécentrique stationnaire.

Pour ce microscope particulier, les lentilles sélectionnées dans le premier relais ont la même distance focale F, de sorte que la distance entre les deux miroirs ici est simplement de quatre F.Pour cette configuration, F est égal à 90 millimètres, donc les quatre positions F seront à 360 millimètres du miroir de balayage. Pour vous assurer que les lentilles sont centrées avec précision dans le trajet du faisceau, placez la première lentille dans le trajet du faisceau et regardez le point du faisceau laser sur le prochain iris dans le trajet du faisceau. En suivant l’objectif, ajustez la hauteur de l’objectif de sorte que le centre vertical du faisceau soit au centre de l’iris.

Ensuite, ajustez la position horizontale du faisceau pour centrer le faisceau sur l’iris. Répétez ce processus avec le deuxième objectif. Ensuite, le miroir de balayage sera installé et le microscope sera tourné pour faciliter le placement et l’alignement simples des pièces qui devraient autrement être ajustées verticalement.

Pour trouver la position exacte du deuxième plan télécentrique, branchez le gal O résonnant sur son unité de balayage et allumez-le. Utilisez une carte de visite pour suivre la trajectoire du faisceau de balayage à travers les deux lentilles. Le deuxième plan télécentrique sera situé à environ quatre F de la gal O résidente et pourra être identifié comme l’endroit où le faisceau de balayage apparaît stationnaire.

Marquez la planche à pain sous cet emplacement avec un crayon. Une fois que le plan télécentrique a été identifié, réglez l’entrée du miroir de balayage sur zéro volt et allumez le matériel de commande du miroir afin que le miroir se stabilise à sa position neutre. Positionnez ensuite le miroir galil de balayage standard à l’emplacement exact du téléplan.

Ajustez la position du miroir de sorte que le faisceau au niveau du téléplan frappe exactement le centre du miroir de balayage et serrez le support de miroir. Desserrez maintenant la vis de verrouillage qui maintient le miroir gal et faites-la pivoter, assurez-vous que le faisceau se propage verticalement. Éteignez maintenant le laser et les appareils électroniques de balayage.

Déconnectez la fibre et déconnectez les miroirs de balayage. Ensuite, à l’aide de supports de montage de plaque d’essai à 90 degrés. Fixez la deuxième planche à pain à la première.

Enfin, faites pivoter soigneusement l’ensemble du microscope de manière à ce que la nouvelle planche d’essai soit posée à plat et utilisez la pince pour fixer le microscope en position. Reconnectez le gal o et le laser ici et n’oubliez pas de ramener le gal O à zéro volt. Le reste de la configuration auparavant verticale peut être facilement réalisé sur la plaque d’essai plate.

Ensuite, nous allons configurer le deuxième ensemble d’objectifs relais, officiellement appelé objectif de balayage et objectif de tube. Veuillez consulter le protocole écrit ci-joint pour des informations très importantes sur le choix de la bonne combinaison de lentilles. Commencez par configurer les objectifs.

Tout d’abord, disposez les miroirs nécessaires pour diriger le faisceau vers la lentille de l’objectif. Placez le premier grand miroir de deux pouces près du bord de la planche à pain et tournez le support de miroir pour refléter le faisceau laser à environ 90 degrés environ. Ajustez la réflexion sur le miroir pour maintenir la même hauteur de faisceau vertical.

Placez ensuite l’autre miroir de deux pouces sur le bord opposé de la planche à pain pour diriger le faisceau à un angle de 90 degrés et utilisez les vis de réglage pour le fixer en place. Ensuite, installez deux iris et ajustez les deux miroirs comme précédemment pour centrer le faisceau. Placez ensuite l’objectif de balayage à sa distance focale par rapport au gal dans le trajet du faisceau et ajustez sa position horizontale et verticale.

Pour centrer le spot laser sur le premier iris entre les deux miroirs. Placez soigneusement la grande lentille du tube de deux pouces à la distance appropriée de l’objectif de balayage et ajustez sa position horizontale et verticale pour centrer le faisceau sur le premier iris. Dans cette configuration, la lentille du tube est placée à une distance de 75 millimètres plus 300 millimètres avec tous les composants en place.

Fixez le gal O à la sortie d’un générateur de fonction électrique standard ou d’un circuit de commande, et réglez les tensions de crête à crête sur un à trois volts. Ensuite, commencez à scanner les deux miroirs à l’aide d’une carte de visite. Localisez le faisceau laser dans le plan stationnaire, 300 millimètres après la lentille du tube.

Placez la lentille de l’objectif dans la trajectoire du faisceau, en veillant à positionner l’ouverture arrière de la lentille de l’objectif aussi près que possible du plan stationnaire. Configurez la platine d’échantillonnage, en vous assurant que la monture de l’axe Z traduisible ne heurte pas la monture de l’objectif lorsqu’elle est transmise sur toute sa plage. Pour configurer le confocal, le sténopé et le détecteur, commencez par déconnecter toutes les alimentations et la fibre optique.

Faites pivoter l’ensemble du microscope de manière à ce qu’il repose à nouveau sur la planche à pain, en tenant le miroir de balayage résonnant. Après avoir reconnecté la fibre au collimateur et au miroir de balayage standard, aux câbles d’alimentation, d’alimentation et de commande, placez zéro volt sur la tension de commande pilotant le gal de balayage standard comme auparavant sur la scène, placez un échantillon d’un sandwich de colorant brillant entre deux lamelles de couverture. Allumez ensuite la source laser et faites la mise au point sur le colorant.

Ajustez la puissance du laser pour rendre la fluorescence aussi brillante que possible à l’aide d’une carte de visite. Tracez l’émission fluorescente de l’échantillon à travers la lentille de l’objectif à travers le système de balayage jusqu’au miroir dichroïque, qui réfléchit le faisceau laser et transmettra l’émission fluorescente. Trouvez ce signal fluorescent de l’autre côté du miroir dichroïque.

Maintenant, tamisez les lumières de la pièce. Placez un miroir derrière le miroir dichroïque pour réfléchir l’émission à un angle de 90 degrés. Ensuite, à l’aide d’un iris avec un miroir, dirigez le faisceau de fluorescence aussi droit et parallèle que possible à la plaque d’essai.

Ensuite, l’unité de sténopé confocal sera configurée à l’aide de l’ensemble de montage de cage de filtre spatial de Thor Labs. Ce schéma décrit la configuration. Le miroir de balayage se trouve sur des plans fixes qui sont téléélectriques avec un objectif fixe.

Des paires de lentilles du plan d’ouverture arrière entre les plans fixes agissent pour relayer les faisceaux balayés. La première paire de lentilles a une lentille à focale égale formant un télescope un-à-un. La deuxième paire de lentilles, connue officiellement sous le nom de lentille de balayage et de lentille de tube, n’a pas besoin d’être égale et de distance focale égale et sert souvent de télescope d’expansion de faisceau pour s’assurer que l’ouverture arrière de l’objectif est trop remplie.

La lumière émise par l’échantillon retourne à travers le système de balayage et passe à travers le miroir dichroïque. Une lentille à courte focale ou une lentille d’objectif focalise la lumière d’émission à travers le sténopé confocal, qui est ensuite assemblé par une lentille. Une lentille finale focalise l’émission confocale filtrée sur un tube photomultiplicateur.

Placez l’unité de filtre spatial dans l’alignement du trajet du faisceau d’émission en prenant soin de centrer la première monture d’objectif de mise au point sur le faisceau d’émission. Dans ce cas, une unité de filtrage spatial d’une taille de sténopé de 100 microns a été sélectionnée. Ensuite, montez un objectif à courte focale dans l’appareil et faites glisser la monture de translation Z jusqu’à ce qu’une mise au point claire puisse être observée sur la surface du sténopé.

Assurez-vous que l’ensemble de l’unité est orienté le long de la ligne droite définie par le faisceau fluorescent. Fixez l’appareil à la plaque d’essai. Maintenant, à l’aide des boutons de réglage de la platine de translation, ajustez les deux axes pour effectuer une recherche 2D sur la surface de montage du sténopé afin de trouver le point où le signal fluorescent à travers le sténopé est maximisé.

Ensuite, placez la lentille de revêtement sur le support de cage Après le sténopé à l’aide d’une carte de visite, trouvez l’ion fluorescent qui traverse l’unité confocale et faites glisser la lentille de revêtement le long des poteaux jusqu’à ce que la fluorescence émise soit aussi agrégée que possible. Configurez l’ensemble du tube photomultiplicateur. Placez une lentille de 50 millimètres de distance focale dans la trajectoire du faisceau d’émission fluorescente et trouvez son point focal.

Marquez cette position sur la planche à pain. Éteignez maintenant complètement le laser et positionnez le tube photomultiplicateur de manière à ce que sa fenêtre soit située aussi près que possible du point focal marqué. Ensuite, à l’aide de tubes d’objectif réglables, connectez l’ensemble à la lentille de mise au point.

Enroulez du ruban adhésif sombre autour de tous les trajets de faisceau exposés en suivant le sténopé, allumez le laser en maintenant sa puissance extrêmement faible. Allumez le tube photomultiplicateur en lisant attentivement sa tension sur l’oscilloscope. Au fur et à mesure que l’intensité du laser augmente, augmentez la tension jusqu’à ce qu’une lecture de pointe et/ou un décalage DC puissent être vus sur l’écran de l’oscilloscope.

Vérifiez que ce signal provient bien de la fluorescence en coupant l’alimentation du laser ou en bloquant le trajet du faisceau pour observer une perte de signal. Enfin, alignez de manière itérative le sténopé pour un signal maximal sur l’oscilloscope. En manipulant d’abord la position Z de l’objectif de mise au point, puis en ajustant la platine de translation YZ, le matériel du microscope à fréquence vidéo est terminé.

Tout d’abord, éteignez le tube multiplicateur photo. Maintenant, branchez les miroirs, les tableaux de contrôle personnalisés et l’ordinateur comme schématisé dans le protocole écrit ci-joint. Ce système peut être adapté pour la réalisation de micro-endoscopie à balayage confocal

En remplaçant l’étage par un étage de maintien de fibre, veuillez consulter le texte ou les détails ci-joints. Le microscope confocal à balayage vertical et le micro-endoscope terminés devraient apparaître comme illustré ici. Les faisceaux laser et d’émission ont été dessinés comme un guide pour l’œil.

Pendant le fonctionnement de la micro-endoscopie, un support de fibre maintient la fibre d’image en place pour les expériences. Ce support fibre peut être facilement remplacé par un étage XY pour les utilisations. Une plate-forme de microscope droit illustrée ici est une image de test représentative prise d’un M minuscule imprimé sur une carte de visite blanche à l’aide d’une carte d’acquisition d’images à fréquence vidéo pour générer des images à partir du signal entrant. Blanchi.

Le livre blanc contient une force fluorée qui est facilement excitée par les UV et la lumière bleue, ce qui donne un arrière-plan lumineux derrière l’obscurité. Une lettre M et un filtre d’émission centré à 515 nanomètres ont été choisis pour collecter cette émission fluorescente. Une légère distorsion de l’image peut être observée, en particulier près des bords latéraux du cadre de l’image.

Cette distorsion résulte du motif de balayage sinusoïdal du miroir gvo de huit kilohertz et est examinée en détail dans le document d’accompagnement. Cette vidéo présente des exemples de données de débit vidéo obtenues en scannant une carte de visite. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la construction et de l’alignement d’un microscope à balayage confocal à fréquence vidéo.

N’oubliez pas que travailler avec la lumière laser peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que retirer tous les bijoux réfléchissants ainsi que d’éviter de travailler avec les yeux au niveau de la ligne de faisceau doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.