Microscopie à balayage vidéo confocale et à taux Microendoscopy

Ce vidéo montre comment construire un microscope confocal à balayage fonctionnant à la fréquence vidéo en utilisant des composants standard disponibles dans le commerce. Un microscope confocal à balayage repose sur le mouvement coordonné de deux miroirs oscillants qui déplacent le faisceau à travers le plan raster : la lumière provenant du premier miroir est balayée horizontalement à travers le premier jeu de lentilles de relais, qui la focalise à nouveau en un point fixe sur le second miroir oscillant. Ce même mouvement de balayage est ensuite transmis à travers les lentilles de balayage et de tube, plaçant ainsi le faisceau lumineux désormais élargi sur l'ouverture arrière de l'objectif.

Le second miroir, dont le mouvement est lent par rapport à celui du premier miroir, balaye simultanément l'axe Y, permettant une action de balayage au-dessus et au-dessous du plan illustré, et créant ainsi une trame rectangulaire à la surface de l'échantillon. Le principal avantage de ce protocole par rapport à l'achat d'un microscope disponible commercialement réside dans son faible coût et dans la possibilité de personnaliser l'instrument selon les besoins spécifiques d'un projet d'imagerie. Lorsqu'on travaille avec un laser, il est essentiel de prendre des mesures de sécurité appropriées afin d'éviter toute blessure oculaire.

Veillez porter des lunettes de protection adaptées contre les lasers chaque fois que possible. Les spectateurs ou les chercheurs qui n'alignent pas activement le faisceau ou n'y travaillent pas doivent toujours porter des lunettes. Retirez toutes les montres ou bijoux brillants et réfléchissants.

Plus important encore, veillez toujours à suivre et contrôler le faisceau en arrêtant son trajet à l’aide d’un bloqueur de faisceau ou d’une carte professionnelle montée. Cela est particulièrement important lors de l’alignement des miroirs, car le trajet du faisceau peut être difficile à prédire. En outre, n’alignez jamais vos yeux au niveau du trajet du faisceau.

Éteignez le laser si vous devez traverser le plan du faisceau avant d'assembler le microscope. Assurez-vous que tout l'équipement nécessaire à la construction est disponible, notamment la table optique et les brides à 90 degrés, tous les miroirs, lentilles et dichroïques, ainsi que les pinces et supports de montage appropriés, les deux miroirs de balayage et le photodétecteur. Il est également utile de disposer d'un générateur de fonctions à portée de main pour tester l'action de balayage et manipuler les miroirs lors de l'alignement.

Il est également fortement recommandé de fixer la plaque d'essai pour assurer sa stabilité. Commencez la construction du microscope en plaçant le dispositif à fibre avec pigtails dans le support optique, puis placez cet ensemble au centre de la plaque d'essai optique. Cela correspond à l'origine du faisceau bleu tel qu'illustré ici.

Activez la source lumineuse. Utilisez les vis de réglage pour ajuster grossièrement le faisceau afin qu'il se propage en ligne droite à la fois horizontalement et verticalement. Placez un diaphragme iris devant le colimateur de fibre.

Ensuite, ajustez la hauteur de l'iris afin que le faisceau traverse le centre. Puis déplacez l'iris loin de l'ator le long du trajet du faisceau. Vérifiez l'alignement du faisceau.

Utilisez les deux vis de réglage pour repositionner le faisceau sur l'iris si nécessaire. Placez le miroir diic monté dans le trajet du faisceau, le faisceau laser étant positionné au centre du miroir. Faites pivoter le support du miroir afin de réfléchir le faisceau à environ 90 degrés, en veillant à ce que la hauteur du faisceau ne change pas.

Fixez le miroir à la table en serrant les vis du support. Ensuite, placez le miroir galvanométrique résonant monté sur son support dans le trajet du faisceau laser, en prenant soin de positionner le faisceau laser exactement au centre horizontal de la surface du miroir.

Effectuez une rotation du support du miroir afin de réfléchir le faisceau laser à un angle de 90 degrés. Ensuite, ajustez approximativement la réflexion sur le miroir pour maintenir la même hauteur verticale du faisceau laser. Puis, prenez deux diaphragmes et placez-les directement devant le galvanomètre résonant.

Ensuite, en utilisant le faisceau laser réfléchi par le miroir galvanométrique résonant comme référence, réglez leur hauteur verticale comme précédemment. Maintenant, en utilisant les trous filetés de la table optique comme guide visuel, serrez les deux diaphragmes en ligne droite. Ajustez le premier miroir du trajet, c'est-à-dire le miroir dichroïque, afin de centrer le faisceau sur le premier diaphragme.

Ensuite, ajustez le second miroir sur le trajet. Utilisez le galvanomètre résonant pour centrer le faisceau sur la seconde diaphragme. Ajustez itérativement ces deux miroirs jusqu'à ce que le faisceau soit aligné à travers les deux diaphragmes.

S'assurer que le faisceau laser réfléchi par le miroir galvanométrique résonant est toujours réfléchi à partir du centre approximatif du miroir. Si le faisceau est dévié, ajuster le support du colimateur de fibre et répéter les réglages en centrant le faisceau sur les deux diaphragmes ouverts. L'étape suivante consiste à placer les deux lentilles de relais qui permettront d'imaginer le premier plan télécentrique fixe sur le second plan télécentrique fixe.

Pour ce microscope particulier, les lentilles sélectionnées dans le premier relais ont la même distance focale F, donc la distance entre les deux miroirs ici est simplement de quatre F. Pour ce montage, F est égale à 90 millimètres, donc la position quatre F se trouvera à 360 millimètres du miroir de balayage. Pour s'assurer que les lentilles sont parfaitement centrées dans le trajet du faisceau, placez la première lentille dans le trajet du faisceau et observez le point du faisceau laser sur l'iris suivant dans le trajet du faisceau. Après la lentille, ajustez la hauteur de la lentille de sorte que le centre vertical du faisceau coïncide avec le centre de l'iris.

Ensuite, ajustez la position horizontale du faisceau pour centrer le faisceau sur l'iris. Répétez ce processus avec la deuxième lentille. Ensuite, le miroir balayeur sera mis en place et le microscope sera pivoté afin de faciliter le positionnement et l'alignement des pièces, qui devraient sinon être ajustés verticalement.

Pour trouver la position exacte du deuxième plan télécentrique, branchez le galvanomètre résonant O à son unité de balayage et mettez-le en marche. Utilisez une carte de visite pour suivre le trajet du faisceau de balayage à travers les deux lentilles. Le deuxième plan télécentrique se situera approximativement à quatre F du galvanomètre O et pourra être identifié comme l'endroit où le faisceau de balayage apparaît immobile.

Marquez du crayon l’emplacement sur la platine correspondant à cet endroit. Une fois le plan télécentrique identifié, réglez l’entrée du miroir de balayage à zéro volt et mettez sous tension le matériel de commande du miroir afin que celui-ci prenne sa position neutre. Positionnez ensuite le miroir galvanométrique de balayage standard exactement à l’emplacement du plan télé.

Réglez la position du miroir de sorte que le faisceau au plan télé frappe exactement le centre du miroir balayeur, puis serrez le support du miroir. Desserrez maintenant la vis de blocage tenant le miroir galvanométrique et faites-le pivoter afin de garantir que le faisceau se propage verticalement. Éteignez ensuite le laser et l'électronique de balayage.

Déconnectez la fibre et déconnectez les miroirs de balayage. Ensuite, à l'aide de supports de montage angulaires à 90 degrés, fixez la deuxième platine à la première.

Enfin, faites pivoter soigneusement l'ensemble du microscope afin que la nouvelle platine soit à plat, puis utilisez la pince pour fixer le microscope en position. Rebranchez ici le galvo et le laser, et n'oubliez pas de ramener le galvo à zéro volt. Le reste du dispositif, autrefois vertical, peut être facilement mis en place sur la platine horizontale.

Ensuite, nous allons installer le deuxième ensemble de lentilles de relais, appelées formellement lentille de balayage et lentille tube. Veuillez consulter le protocole écrit accompagnant pour des informations très importantes sur le choix de la combinaison appropriée de lentilles. Commencez par installer les lentilles.

Tout d'abord, disposez les miroirs nécessaires pour diriger le faisceau vers l'objectif. Placez le premier grand miroir de deux pouces près du bord de la platine et faites pivoter le support du miroir afin de réfléchir le faisceau laser d'environ 90 degrés, de manière approximative. Ajustez la réflexion sur le miroir pour maintenir la hauteur verticale du faisceau constante.

Ensuite, placez l'autre miroir de deux pouces sur le bord opposé de la platine afin de diriger le faisceau à un angle de 90 degrés, et utilisez les vis de réglage pour le fixer en place. Puis, installez deux diaphragmes et ajustez les deux miroirs comme précédemment pour centrer le faisceau. Placez ensuite l'objectif de balayage à sa distance focale du galvanomètre sur le trajet du faisceau, et ajustez sa position horizontale et verticale.

Pour centrer le spot laser sur le premier diaphragme situé entre les deux miroirs. Placer soigneusement la grande lentille tube de deux pouces à la distance appropriée par rapport à la lentille de balayage et ajuster sa position horizontale et verticale afin de centrer le faisceau sur le premier diaphragme. Dans ce montage, la lentille tube est placée à une distance de 75 millimètres plus 300 millimètres lorsque tous les composants sont en place.

Fixez le galva­no­mètre O à la sortie d'un générateur de fonctions électriques standard ou d'un circuit de commande, puis réglez les tensions crête à crête entre un et trois volts. Commencez ensuite à balayer les deux miroirs à l'aide d'une carte de visite. Positionnez le faisceau laser dans le plan fixe, à 300 millimètres après la lentille tubulaire.

Placer l'objectif dans le trajet du faisceau, en veillant à positionner l'ouverture arrière de l'objectif aussi près que possible du plan fixe. Installer la platine porte-échantillon, en s'assurant que le support translatable selon l'axe Z n'entre pas en contact avec le support de l'objectif lorsqu'il se déplace sur toute son amplitude. Pour configurer le dispositif confocal, commencer par déconnecter toutes les alimentations électriques et les fibres optiques, puis installer le diaphragme et le détecteur.

Faites pivoter l'ensemble du microscope afin qu'il repose à nouveau sur la platine, en tenant le miroir de balayage résonnant. Après avoir reconnecté la fibre au collimateur, au miroir de balayage standard, ainsi qu'aux câbles d'alimentation et de commande, appliquez une tension de zéro volt sur la tension de commande du galvanomètre de balayage standard, comme précédemment sur la platine. Placez un échantillon de colorant brillant en sandwich entre deux lamelles. Ensuite, allumez la source laser et mettez le colorant au point.

Réglez la puissance du laser pour rendre la fluorescence aussi brillante que possible à l’aide d’une carte de visite. Suivez l’émission fluorescente provenant de l’échantillon à travers l’objectif, puis à travers le système de balayage jusqu’au miroir dichroïque, qui reflète le faisceau laser et transmet l’émission fluorescente. Repérez ce signal fluorescent de l’autre côté du miroir dichroïque.

Assombrissez maintenant la pièce. Placez un miroir derrière le miroir dichroïque afin de réfléchir l'émission à un angle de 90 degrés. Ensuite, à l’aide d’un diaphragme muni d’un miroir, dirigez le faisceau de fluorescence aussi droit et parallèle que possible par rapport à la platine optique.

Ensuite, l'unité de trou d'ouverture confocale sera installée à l'aide de l'ensemble de montage en cage avec filtre spatial de Thor Labs. Ce schéma décrit le montage. Le miroir de balayage se situe dans des plans fixes qui sont en téléobjectif avec un objectif fixe.

Des paires de lentilles dans le plan de l'ouverture arrière situées entre les plans fixes servent à transmettre les faisceaux balayés. La première paire de lentilles possède des distances focales égales, formant une lunette un-à-un. La seconde paire de lentilles, appelée formellement lentille de balayage et lentille tube, n'a pas besoin d'avoir des distances focales égales et sert souvent de lunette agrandisseuse afin de garantir un remplissage excessif de l'ouverture arrière de l'objectif.

La lumière émise par l'échantillon repasse par le système de balayage et traverse le miroir dichroïque. Une lentille de courte focale ou une lentille d'objectif focalise la lumière d'émission à travers le diaphragme confocal, puis une lentille la collimate. Une dernière lentille focalise l'émission filtrée en mode confocal sur un photomultiplicateur.

Placer l'unité de filtrage spatial dans l'alignement du trajet du faisceau émis en prenant soin de centrer le support de la première lentille de focalisation sur le faisceau émis. Dans ce cas précis, une unité de filtrage spatial dotée d'un orifice de 100 microns a été sélectionnée. Ensuite, monter une lentille de courte distance focale dans l'unité et déplacer le support de translation en Z jusqu'à ce qu'un point focal net soit observable sur la surface de l'orifice.

Veillez à ce que l'ensemble de l'appareil soit orienté le long de la ligne droite définie par le faisceau fluorescent. Fixez l'appareil sur la platine optique. À l'aide des molettes de réglage du dispositif de translation, ajustez les deux axes afin d'effectuer une recherche en 2D sur la surface du support du diaphragme pour trouver le point où le signal fluorescent traversant le diaphragme est maximal.

Ensuite, placez l'objectif de recouvrement sur le support de cage. Après le diaphragme, utilisez une carte de visite pour repérer l'ion fluorescent qui traverse l'unité confocale, puis faites glisser l'objectif de recouvrement le long des montants jusqu'à ce que la fluorescence émise soit aussi collimatée que possible. Installez l'ensemble du tube photomultiplicateur. Placez une lentille de distance focale de 50 millimètres sur le trajet du faisceau de fluorescence émise et déterminez son point focal.

Marquez cette position sur la platine d'essai. Éteignez maintenant complètement le laser et positionnez le tube photomultiplicateur de sorte que sa fenêtre soit située aussi près que possible du point focal marqué. Ensuite, à l'aide de tubes de lentilles réglables, reliez l'ensemble à la lentille de focalisation.

Enroulez du ruban adhésif noir autour de tous les trajets de faisceau exposés suivant le diaphragme d'optique, allumez le laser en maintenant sa puissance extrêmement faible. Allumez soigneusement le tube photomultiplicateur en lisant sa tension sur l'oscilloscope. Au fur et à mesure que l'intensité du laser augmente, augmentez la tension jusqu'à ce qu'un signal en forme de pic ou un décalage continu (DC offset) soit visible sur l'écran de l'oscilloscope.

Confirmez que ce signal provient bien de la fluorescence en désactivant la puissance du laser ou en bloquant le trajet du faisceau afin d'observer une perte du signal. Enfin, alignez de manière itérative le diaphragme pour obtenir un signal maximal sur l'oscilloscope. En ajustant d'abord la position Z de la lentille de focalisation, puis en réglant le plateau de translation YZ, le montage du microscope fonctionnant à la fréquence vidéo est terminé.

Commencez par éteindre le tube photo-multiplicateur. Branchez ensuite les cartes de commande personnalisées des miroirs et de l'ordinateur selon le schéma décrit dans le protocole écrit joint. Ce système peut être adapté pour réaliser de l'endoscopie microscopique à balayage confocal.

En remplaçant la platine par une platine de maintien de fibre, veuillez consulter le texte accompagnant ou les détails. Le microscope confocal à balayage droit et le micro-endoscope finis doivent apparaître comme illustré ici. Les faisceaux laser et d'émission ont été dessinés à titre indicatif.

Pendant le fonctionnement de la micro-endoscopie, un support de fibre maintient la fibre d'image en place pour les expériences. Ce support de fibre pourrait être facilement remplacé par une platine XY pour divers usages. Une plateforme de microscope droit, illustrée ici, présente une image de test représentative d'un « m » minuscule imprimé sur une carte de visite blanche, capturée à l'aide d'une carte d'acquisition vidéo à cadence élevée afin de générer des images à partir du signal entrant. Décoloré.

Le papier blanc contient des agents fluorescents facilement excités par la lumière UV et bleue, ce qui provoque un fond lumineux derrière l'obscurité. La lettre M et un filtre d'émission centré à 515 nanomètres ont été choisis pour recueillir cette émission fluorescente. Une légère distorsion de l'image peut être observée, en particulier près des bords latéraux du cadre de l'image.

Cette distorsion résulte du motif de balayage sinusoïdal du miroir gvo de huit kilohertz et est décrite en détail dans le document accompagnant. Ce film montre des données à fréquence vidéo obtenues en balayant une carte de visite. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez maintenant bien comprendre comment construire et aligner un microscope confocal à balayage à fréquence vidéo.

N'oubliez pas que le travail avec la lumière laser peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l'élimination de tous les bijoux réfléchissants ainsi que l'évitement de travailler avec les yeux au niveau du trajet du faisceau doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.