Schéma de flux de travail d'une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d'hémocultures

L’objectif global de cette procédure est d’identifier et d’évaluer la sensibilité aux antibiotiques des isolats d’hémoculture en moins de temps qu’avec les méthodes conventionnelles. Pour ce faire, il faut d’abord identifier l’isolat d’hémoculture. À l’aide d’un nouveau test PCR de ribosomal 16 s, DNA MultiPro.

Ensuite, l’isolat est incubé avec un panel d’antibiotiques pendant six heures. L’étape suivante consiste à déterminer la croissance ou la croissance de l’inhibition de l’isolat en présence de l’antibiotique à l’aide d’un test quantitatif ribosomique 16 s D-N-A-P-C-R. En fin de compte, les résultats montrent que l’identification et le test de sensibilité aux antibiotiques d’un isolat d’hémoculture peuvent être obtenus plus rapidement grâce à cette combinaison de culture et de PCR.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles utilisant des systèmes automatisés Phénix ou IIC, est qu’aucun état de culture préalable n’est requis et que les résultats de l’identification et des tests de sensibilité aux antibiotiques peuvent être disponibles dans la même journée. Vandy Hanson et les doctorants de notre laboratoire dilueront 100 microlitres d’hémoculture positive pour la croissance microbienne dans un tube réactionnel contenant 900 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 13, 400 fois G pendant cinq minutes pour granuler les bactéries après la centrifugation.

Reese, suspendez le granulé dans 100 microlitres d’eau déminéralisée stérile. Installez l’échantillon à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement. Une fois que tous les échantillons sont prêts, préparez les mélanges de réaction PCR en temps réel pour amplifier l’ADN ribosomique 16 s spécifique des bactéries d’intérêt.

Utilisez de l’eau déminéralisée pour ajuster les volumes à 20 microlitres par réaction. Aliquote 20 microlitres de mélange PCR par puits dans une plaque PCR de 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’échantillon dans chaque puits et scellez la plaque PCR.

Ensuite, exécutez la PCR sur le système de PCR en temps réel A BI Prism 7, 900 HT pour analyser les résultats une fois la PCR terminée, utilisez d’abord l’onglet des paramètres d’analyse pour ajuster l’analyse CT à 0,1. Affinez ensuite les configurations de base pour commencer le cycle six et terminer le cycle 15. Notez la valeur CT de chaque échantillon.

La valeur seuil pour considérer un résultat de PCR comme positif peut généralement être fixée à une valeur CT de 35. Dans cet exemple, le profil d’identification d’une hémoculture infectée par E. coli est illustré dans deux mélanges réactionnels. Des amorces d’ADN ribosomique universelles 16 s ont été incluses et ont généré deux courbes d’amplification de CT 25.2 et 25.95.

La troisième courbe d’amplification est dérivée de la sonde spécifique pour Coli. D’autres sondes spécifiques n’ont pas généré de signaux détectables. Une fois que l’agent pathogène a été identifié, des tests antibiotiques peuvent être effectués.

Commencez par transférer cinq millilitres de bouillon d’une hémoculture positive dans un tube séparateur de sérum. Centrifuger l’échantillon à 2000 fois G pendant 10 minutes après la centrifugation, jeter l’agent supan du tube. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige stérile, transférez les bactéries de la couche de gel du tube dans du chlorure de sodium à 0,9 % jusqu’à l’obtention d’une solution avec une turbidité de 0,5 étalon McFarland.

Cela correspond à environ 1,5 fois 10 à la huitième unité formant colonie par millilitre. Ensuite, diluez la suspension dans une double concentration Muller Hinton. Deux bouillons pour obtenir une concentration d’environ cinq fois 10 à cinq unités formant colonie par millilitre.

Aliquote 50 microlitres par puits de la suspension dans une plaque de microtitration contenant déjà 50 microlitres par puits d’une sélection d’antibiotiques. Assurez-vous d’inclure des contrôles de croissance positifs pour chaque échantillon en utilisant des puits avec de l’eau au lieu d’antibiotiques. Couvrez l’assiette lorsque vous avez terminé.

Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant six heures pour permettre la croissance bactérienne. Assurez-vous de conserver une aliquote de la suspension bactérienne à quatre degrés Celsius comme contrôle de la croissance négative. Après six heures d’incubation, transférez le contenu de chaque puits et de l’échantillon témoin négatif dans des tubes stériles séparés.

Après une centrifugation de cinq minutes à 16 000 fois. G, retirer 80 microlitres de surnageant et remettre les granulés en suspension dans 80 microlitres d’eau déminéralisée stérile. Diluez les échantillons à une à 10 dans de l’eau avant de les utiliser pour une PCR en temps réel de l’ADN à 16 s.

Préparez le mélange PCR à l’aide du super mélange IQ cyber green et des amorces d’ADN ribosomique 16 s et de l’aliquote de 20 microlitres par puits dans une plaque PCR de 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque échantillon dans les puits et scellez la plaque.

Ensuite, exécutez la PCR pour analyser les résultats. Tout d’abord, calculez la valeur seuil CT. En général, le TC de coupure est égal au TC du témoin de croissance positif plus 0,5 fois le TC du témoin de croissance négatif moins le TC du témoin de croissance.

Cependant, pour la pipéracilline, la pipéracilline avec le tazobactam et le CEF dazadi dans les bâtonnets à Gram négatif, ainsi que pour l’amoxicilline, l’oxacilline et le triméthoprime avec le sulfaméthoxazole dans le staphylocoque doré ou à partir de l’amoxicilline. Dans le cas de l’entérocoque SPP, le facteur de multiplication de 0,5 doit être réduit à 0,25. La susceptibilité ou la résistance des déformations dans chaque échantillon peut être déterminée en comparant le TC de l’échantillon au TC de coupure.

Une valeur CT supérieure à la limite indique une susceptibilité tandis qu’une valeur CT inférieure à la limite indique une résistance. Voici un exemple de graphique d’amplification de la sensibilité aux antibiotiques. La sensibilité de la souche E. coli identifiée précédemment a été testée pour sa sensibilité à plusieurs antibiotiques, chacun représenté par une courbe distincte.

Les échantillons avec une faible valeur CT sont des échantillons dans lesquels une croissance s’est produite en présence d’un antibiotique indiquant une résistance à l’antibiotique testé. Au contraire, une valeur CT élevée représente un échantillon dans lequel aucune croissance n’a eu lieu, ce qui indique une sensibilité à l’antibiotique testé une fois maîtrisé. Cette technique peut être réalisée en neuf heures si elle est exécutée correctement.