Name: Schéma de flux de travail dune journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir dhémocultures (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez une méthode PCR rapide pour identifier les pathogènes bactériens et tester leur résistance aux antibiotiques à partir d'hémocultures en une seule journée. Cette approche améliore la prise en charge clinique des infections.

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PARTIE I: identification des agents pathogènes 1. Préparation de l'échantillon Note: Le flux de production moléculaire est décrite dans le protocole suivant doit être effectuée conformément aux recommandations pour l'assurance qualité dans le diagnostic moléculaire 3. <ol><li> Ajouter une fraction aliquote de 0,1 ml de culture de sang à 0,9 ml de NaCl 0,9% dans un tube réactionnel de 1,5 ml à devenir un échantillon dilué 1:10. (Diluer afin d'empêcher l'inhibition qPCR). </li><li> Centrifuger l'échantillon à 13 400 xg pendant 5 min pour obtenir un culot de l'ADN bactérien. </li><li> Remettre en suspension le culot bactérien dans 100 ul stérile déminéralisée H 2 O. </li><li> Conserver l'échantillon d'ADN à 4 ° C jusqu'à l'utilisation. </li></ol> 2. Essai d'identification: en temps réel de PCR ADNr 16S <ol><li> Préparer les mélanges de réaction comme suit. Le dosage se compose de quatre réactions séparées par échantillon. Chaque mélange comprend 12,50 maître ulmélange, 0,9 uM Amorce (5-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7, amorce 0,6 uM inverse (5-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 et un panel de sondes. La quantité de sondes est donnée pour chacune des quatre réactions séparées dans ci-dessous. </li><li> La première réaction comprend: <ul><li> 0,2 um sonde universelle (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 </li><li> 0,2 p uM sonde aeruginosa (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La seconde réaction comprend: <ul><li> 0,2 E. uM sonde coli (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 um Pseudomonas spp. la sonde (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) </li></ul></li><li> La troisième réaction comprend: <ul><li> 0,2 um Staphylococcus spp. la sonde (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. sonde aureus (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) </li><li> 0,2 um Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) </li></ul></li><li> La quatrième réaction comprend: <ul><li> 0,2 um sonde universelle (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) </li><li> 0,3 pM Streptococcus spp. la sonde (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) </li><li> 0,2 uM S. pneumoniae sonde (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) </li></ul></li><li> Ajouter stérile déminéralisée H 2 O pour atteindre un volume total de 20 pi. Ajouter 20 ul de chaque mélange réactionnel pour les puits d'une plaque de 96 puits PCR. </li><li> Ajouter 5 ul d'échantillon dans chaque puits. </li><li> Utilisez un film adhésif pour sceller la plaque de 96 puits PCR. </li><li> Exécutez la plaque sur le ABI PRISM 7900HT Système temps réel PCR en utilisant les suivantes conditions optimales de cyclage thermique: <ul><li> Préchauffage à 50 ° C pendant 10 min </li><li> Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 15 min </li><li> 42 cycles de <ul type="circle"><li> Dénaturation à 95 ° C pendant 15 s </li><li> Recuit à 60 ° C pendant 1 min </li></ul></li></ul></li></ol> 3. Analyse des résultats <ol><li> Régler le seuil de l'analyse Ct à 0,1 dans les paramètres d'analyse de tabulation. Cibler les configurations de base pour démarrer (Cycle): 6 et Fin (cycle): 15. </li><li> Enregistrez le cycle seuil (Ct) la valeur pour tous les échantillons. La valeur de coupure d'envisager un résultat PCR positif que peut être réglé à une valeur Ct de 35 ans. La quantité de bactéries présentes dans les cultures de sang variait de 10 7 à 10 11 UFC / ml, générant les valeurs Ct-dessous de 35. </li></ol> PARTIE II: antibiogramme 4. Isolement de bactéries à partir d'hémocultures positives 9 <ol><li> Aspirer 5 ml de bouillon à partir d'un flacon d'hémoculture positive et le transférer dans un tube séparateur de sérum. </li><li> Centrifuger le tube séparateur de sérum à 2000 xg pendant 10 min. </li><li> Éliminer le surnageant du tube de séparation du sérum. </li><li> Transfert bactères de la couche de gel du tube avec un écouvillon stérile dans une solution saline à 0,9% jusqu'à 0,5 McFarland une norme de suspension est obtenue. </li></ol> 5. L'inoculation des plaques Objectives Micro <ol><li> Diluer la suspension à 0,5 McFarland en double concentré de bouillon de Mueller-Hinton II pour former une suspension de 5 x 10 5 UFC / ml. </li><li> Ajouter cette suspension dans les puits d'une plaque de micro titre contenant une sélection des antibiotiques (tableau 1). </li><li> Incuber la plaque de titrage micro à 37 ° C pendant 6 h. </li><li> Conserver une partie aliquote de la suspension à 4 ° C (comme régulation de croissance négative). </li><li> Après 6 h d'incubation, transférer le contenu de chaque puits dans un tube stérile, ainsi que l'échantillon de croissance négatif de contrôle qui a été stocké à 4 ° C. </li><li> Centrifuger les tubes à 16000 xg pendant 5 min. </li><li> Retirez délicatement le surnageant, sans perturber le culot bactérien. </li><li> Reprendre le culot dans H déminéralisée stérile <li> Diluer les échantillons de 10 fois stérile déminéralisée H 2 O. </li></li></ol> 6. En temps réel de PCR ADNr 16S 10 <ol><li> Préparer le mélange de PCR comme suit: <ul><li> 12,50 pi iQ SYBR Green Supermix </li><li> 0,5 pM avant amorce 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 </li><li> 0,25 um 16S-2 amorce inverse (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 </li><li> stérile déminéralisée H 2 O à un volume total de 20 pi </li></ul></li><li> Ajouter 20 ul du mélange PCR pour les puits d'une plaque de 96 puits PCR. </li><li> Ajouter 5 ul d'échantillon dans chaque puits. </li><li> Utilisez un film adhésif pour sceller la plaque de 96 puits PCR. </li><li> Exécutez la plaque sur le MyiQ unique couleur en temps réel système de détection par PCR, en utilisant les suivantes conditions optimales de cyclage thermique: <ul><li> Dénaturation initiale à 95 ° C pendant 4 min </li><li> Initiale de recuit à 65 ° C pendant 30 s </li><li> 35 cycles de <ul><li> Dénaturation à 95 ° C pendant 15 s </li><li> Recuit à 60 ° C pendant 1 min </li></ul></li><li> Faire fondre analyse de la courbe (à partir de 60-95 ° C en 20 minutes avec des incréments de 0,57 ° C) </li></ul></li></ol> 7. Analyse des résultats <ol><li> Calculer la valeur de coupure Ct en utilisant l'une des formules suivantes (selon le type d'antibiotique). <ul><li> En général: Cut-off valeur Ct = valeur de Ct la croissance de contrôle positif + 0,5 x (valeur de Ct à contrôler la croissance négative - la valeur Ct de croissance de contrôle positif) </li><li> La pipéracilline, pipéracilline / tazobactam et la ceftazidime dans bacilles Gram-négatifs; Amoxicilline, oxacilline et le triméthoprime / sulfaméthoxazole dans S.aureus; Amoxicilline chez Enterococcus spp:. Cut-off valeur Ct = valeur de Ct la croissance de contrôle positif + 0,25 x (croissance Ct valeur négative de contrôle - la valeur Ct de croissance de contrôle positif) </li></ul></li><li> Utilisez l'échantillon incubé avec stérile déminéralisée H 2 O comme régulation de croissance positive.</li><li> Selon le micro-organisme, utilisez le contrôle de la croissance négative appropriée: <ul><li> Gram-négatif échantillon tiges incubées avec un mélange d'antibiotiques </li><li> Enterococcus spp. Échantillon stocké à 4 ° C </li><li> Exemple de S.aureus conservés à 4 ° C </li></ul></li><li> Déterminer la sensibilité (S) ou de la résistance (R) de la souche de l'antibiotique effectué comme suit: <ul><li> Une valeur Ct supérieur à la valeur de coupure Ct indique la sensibilité </li><li> Une valeur Ct inférieure à la valeur de coupure Ct indique la résistance </li></ul></li></ol> 8. Les résultats représentatifs Deux organismes modèles, à savoir un E. Gram négatif coli et un S. Gram-positif Staphylococcus, sont choisis de visualiser la procédure combiné pour la détection et l'identification de bactéries pathogènes et la détermination de son profil antimicrobien. La première partie du protocole comprend l'identification des agents pathogènes. Spesondes spécifiques sont conçus pour la détection de micro-organismes huit cliniquement pertinentes. En présence d'une cible inclus dans le panneau bactérienne, les courbes d'amplification sont générés et les valeurs de Ct sont calculés (Figure 2). La valeur de coupure d'envisager un résultat positif de PCR comme est fixé à une valeur Ct de 35 ans. Figure 2A, le profil d'identification d'une culture de sang E. coli-infectée est représenté. La sonde 16S universel est inclus dans deux mélanges réactionnels distincts et génère par conséquent deux courbes d'amplification (Ct de 25,20 et 25,95). Le troisième signal est dérivé de la sonde spécifique pour E. coli (Ct de 27,04). L'identification d'un S. Staphylococcus infecté par hémoculture est montré dans la figure 2B. La sonde 16S universel comporte des signaux d'amplification de 33,35 et 33,71. Les deux signaux restants sont dérivées à partir des sondes spécifiques pour Staphylococcus spp. et S. aureus (Ct de 32,48 et 30,59). La figure 3 est un exemple d'un complot d'amplification tests de sensibilité aux antibiotiques, ce qui représente la souche E. coli qui a été également montré la figure 2A. Chaque ligne représente un antibiotique que l'échantillon bactérien a été incubé avec. Un échantillon avec une faible valeur Ct est un échantillon dans lequel la croissance a lieu en présence d'un antibiotique, une résistance à l'antibiotique indiquant testée. Au contraire, une valeur élevée Ct représente un échantillon dans lequel aucune croissance s'est produite en raison du fonctionnement efficace de l'antibiotique, la sensibilité à l'antibiotique indiquant testée. Le tableau 1 illustre la détermination du profil de l'antimicrobien E. coli et S. aureus. Toutes les valeurs Ct sont signalés et, en utilisant les formules mentionnées dans le texte du protocole (7.1), deux seuils sont calculés les valeurs de Ctréglementée à la distinction entre résistance et la sensibilité. La souche est résistante à l'antibiotique si la valeur déclarée Ct est inférieure à la calcule la valeur seuil Ct (et vice versa). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Diagramme Figure 1. De l'identification des agents pathogènes et d'antibiotiques procédure des tests de sensibilité à l'aide en temps réel ADNr 16S par PCR. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 test d'identification:. Parcelles d'amplification et des valeurs seuils de cycle (les valeurs de Ct) Une hémoculture positive est détectée par le sonde universelle ADNr 16S, tandis que les sondes spécifiques sont utilisés pour l'identification de l'agent pathogène.. Parcelle d'amplification A. de la culture du sang contenant E. coli; parcelles d'amplification de la culture B. sang contenant S. aureus; Pseudomonas ae, Pseudomonaeruginosa; uni, 16S sonde universelle; Ecoli, Escherichia coli sonde; Pseudomonas sp, Pseudomonas spp. sonde; S. pneumoniae, Streptococcus pneumoniae sonde; Strep sp, Streptococcus spp. sonde; Entero, Enterococcus spp. sonde; S. aureus, Staphylococcus aureus sonde; Staph sp, Staphylococcus spp. Sonde. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3254/3254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Amplification parcelle Figure 3. Des tests de sensibilité aux antibiotiques d'un E. coli isoler (échantillon 1). Chaque courbe représente un antibiotique que la souche a été incubé avec. Un signal de début est provoquée par une charge bactérienne élevée, ce qui signifie que la souche a cultivé en présence de l'antibiotique testé et n'est donc résistant à l'antibiotique. Signaux en retard indiquent que la souche a pas cultivées en présence de l'antibiotique, en d'autres termes, il est sensible. <table border="1"><tbody><td> Exemple 1: E. coli </td><td></td><td></td><td> Exemple 2: S. Staphylococcus </td><td></td><td></td><tr><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td><td> AST </td><td> Ct </td><td> R / S </td></tr><tr><td> L'amoxicilline 8 mg / L </td><td> 16,83 </td><td> R </td><td> Amoxicilline 0,25 mg / L </td><td> 21,03 </td><td> R </td></tr><tr><td> L'amoxicilline-acide clavulanique 8/4 mg / L </td><td> 17,36 </td><td> R </td><td> Oxacilline 2 mg / L </td><td> 25,80 </td><td> S </td></tr><tr><td> Pipéracilline 16 mg / L </td><td> 16,67 </td><td> R </td><td> La vancomycine 2 mg / L </td><td> 25,20 </td><td> S </td></tr><tr><td> Pipéracilline-tazobactam 16 /4 mg / l </td><td> 24,15 </td><td> S </td><td> Gentamicine 4 mg / L </td><td> 25,86 </td><td> S </td></tr><tr><td> La ciprofloxacine 1 mg / L </td><td> 29,72 </td><td> S </td><td> Le triméthoprime-sulfaméthoxazole 2/38 mg / L </td><td> 24,62 </td><td> S </td></tr><tr><td> Ceftazidime 1 mg / L </td><td> 24,03 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ceftazidime 8 mg / L </td><td> 26,58 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gentamicine 4 mg / L </td><td> 29,83 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le triméthoprime-sulfaméthoxazole 2/38 mg / L </td><td> 27,60 </td><td> S </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Contrôle de la croissance négative (mélange d'antibiotiques) </td><td> 30,41 </td><td></td><td> Contrôle de la croissance négative (échantillon stocké à 4 ° C) </td><td> 27,42 </td><td></td></tr><tr><td> Contrôle de la croissance positive </td><td> 16,90 </td><td></td><td> Contrôle de la croissance positive </td><td> 20,22 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cut-off valeur Ct 1 * </td><td> 21,76 </td><td></td><td> Cut-off valeur Ct 1 *** </td><td> 23,82 </td><td></td></tr><tr><td> Cut-off valeur Ct 2 ** </td><td> 18,75 </td><td></td><td> Cut-off valeur Ct 2 **** </td><td> 22,02 </td><td></td></tr><tr><td> * Pour l'amoxicilline, l'amoxicilline-acide clavulanique, la ciprofloxacine, gentamicdans, le triméthoprime-sulfaméthoxazole ** Pour pipéracilline, pipéracilline-tazobactam, la ceftazidime </td><td></td><td></td><td> *** Pour la vancomycine et la gentamicine Pour l'amoxicilline ****, oxacilline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1. Détermination des tests de sensibilité aux antibiotiques des deux échantillons (E. coli et S. aureus). Les valeurs de Ct de la PCR-test ont été copiés dans ce fichier Excel, que ce qui peut calcule automatiquement les deux cut-off aleurs Ct de la régulation de croissance positive et négative, en utilisant les formules indiquées dans le texte du protocole. Si un antibiotique montre une valeur Ct inférieure à la valeur de coupure Ct, la souche est résistante à l'antibiotique, si la valeur Ct est plus élevé que le seuil, la souche est sensible.

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</ol>

Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Le protocole décrit ici permet l&#39;identification rapide des agents pathogènes et fournit un profil fonctionnel antimicrobien qui pourrait conduire à l&#39;administration précoce d&#39;antibiotiques adéquats, améliorant ainsi le pronostic des patients atteints d&#39;infections sanguines. En fonction des conditions demandées d&#39;un test, à savoir faible coût, un débit élevé, de demi-tour minimale de temps, les conditions de test peut être ajustée. Toute la procédure peut être effectuée dans un jour ouvrable. En outre, les deux parties du protocole peut être effectuée simultanément, ce qui réduit le temps de demi-tour sensiblement. Tel que présenté ici, le panneau d&#39;identification est une sélection des bactéries les plus cliniquement pertinente dans notre hôpital. Depuis le principe est le ciblage de la région du gène 16S, des sondes spécifiques pour d&#39;autres microorganismes peuvent être conçus et ajoutés à l&#39;essai. Le test complet a été à l&#39;origine destiné à l&#39;analyse rapide des cultures de sang, mais peut aussi être utilisé pour le traitement des odes échantillons de matériaux Ther. C&#39;est aussi le cas pour les antibiotiques qui ont été utilisées pour les tests de sensibilité aux antibiotiques: les antibiotiques plus ou autre peut être ajoutée, basée sur les profils de résistance locaux et des lignes directrices.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Merck Chemicals </td><td> 106404 </td><td> 0,9% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> Vacutainer SST Tube séparateur de sérum 5 ml </td><td> BD Diagnostic Systems </td><td> 367986 </td><td></td></tr><tr><td> Mueller-Hinton II bouillon </td><td> BD Diagnostic Dystems </td><td> 212322 </td><td> 44 g / L dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> Centrifuger Rotixa 50 RS </td><td> Andreas Hettich GmbH &amp; Co. KG </td><td> 4910 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuger 5415 D </td><td> Eppendorf </td><td> Supprimé </td><td></td></tr><tr><td> Primaires </td> &lt;td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> Sondes </td><td> Sigma-Aldrich/Applied Biosystems </td><td> na </td><td></td></tr><tr><td> TaqManEnvironmental master mix 2.0 </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr><tr><td> iQ SybrGreen Supermix </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 170-8880 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp optique Plaque de réaction de 96 puits </td><td> Applied Biosystems </td><td> N8010560 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp Film adhésif optique </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> iQ plaques à 96 puits PCR </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> 223-9441 </td><td></td></tr><tr><td> Microseal B joints adhésifs </td><td> Bio-Rad travailatories BV </td><td> MSB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> En temps réel système de détection par PCR </td><td> Applied Biosystems </td><td> ABI PRISM 7900HT </td><td></td></tr><tr><td> Real-Time PCR Detection System </td><td> Bio-Rad Laboratories BV </td><td> MyiQ unique couleur </td><td></td></tr></tbody></table>

schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Les bactériémies sont associées à des taux élevés de mortalité en raison de la manifestation probable de sepsis, sepsis sévère et du choc septique 1. Par conséquent, l&#39;administration rapide d&#39;une antibiothérapie adéquate est de première importance dans le traitement des infections sanguines. L&#39;élément essentiel dans ce processus est le timing, qui dépend fortement sur les résultats de l&#39;identification bactérienne et d&#39;antibiogramme. Ces deux paramètres sont couramment obtenus par la culture basée sur des tests, ce qui prend beaucoup de temps et prend en moyenne 24-48 heures 2, 4. L&#39;objectif de l&#39;étude était de développer basées sur l&#39;ADN des essais pour l&#39;identification rapide des infections sanguines, ainsi que les tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens. Le premier essai est un 16S ADNr eubactériennes-temps réel basé sur la PCR complétées par espèce ou du genre des sondes spécifiques 5. L&#39;utilisation de ces sondes, bactéries à Gram négatif, y compris Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosaet Escherichia coli, ainsi que les bactéries Gram-positives, y compris Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., et Streptococcus pneumoniae peuvent être distinguées. L&#39;utilisation de ce test multisonde, une première identification de l&#39;agent causal micro-organisme a été donné après 2 h. Deuxièmement, nous avons développé un test moléculaire pour semi-tests de sensibilité aux antibiotiques de S. aureus, Enterococcus spp. et (facultatif) aérobies Gram-négatifs 6. Cet essai a été basée sur une étude dans laquelle la PCR a été utilisée pour mesurer la croissance des bactéries 7. Les bactéries récoltées directement à partir d&#39;hémocultures sont incubées pendant 6 h avec une sélection d&#39;antibiotiques, et suite à une SYBR Green-temps réel basé sur la PCR détermine l&#39;inhibition de la croissance. La combinaison de ces deux méthodes pourraient orienter le choix d&#39;une thérapie appropriée aux antibiotiques, le même jour (figure 1). En conclusion, L&#39;analyse moléculaire de l &#39;identification et la sensibilité aux antibiotiques offre une alternative plus rapide pour la détection des agents pathogènes et pourrait améliorer le diagnostic des septicémies.

La conception d&#39;un système de flux de travail d&#39;une journée simple pour le diagnostique des pathogènes bactériens permet la reconnaissance rapide des infections du sang. L&#39;inclusion de huit cliniquement pertinentes cibles bactériennes et leurs profils de résistance aux antibiotiques offre au clinicien un premier aperçu sur le même jour, ce qui peut conduire à un traitement plus adéquat.

Schéma de flux de travail d&#39;une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d&#39;hémocultures

Les infections du flux sanguin sont associées à des taux de mortalité élevés en raison de la manifestation probable d'un sepsis, d'un sepsis sévère et d'un choc septique1. ...

L'objectif général de cette procédure est d'identifier et d'évaluer la sensibilité aux antibiotiques des isolats de culture sanguine en moins de temps que les méthodes conventionnelles. Cela est réalisé en premier lieu en identifiant l'isolat de la culture sanguine à l'aide d'un nouvel essai PCR MultiPro ciblant l'ADN ribosomique 16 s.Ensuite, l'isolat est incubé avec un panel d'antibiotiques pendant six heures. L'étape suivante consiste à déterminer la croissance ou l'inhibition de la croissance de l'isolat en présence de l'antibiotique à l'aide d'un dosage quantitatif par PCR de l'ADN ribosomique 16 S. En définitive, les résultats montrent que l'identification et le test de sensibilité aux antibiotiques d'un isolat de culture sanguine peuvent être obtenus plus rapidement grâce à cette combinaison de culture et de PCR.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles utilisant des systèmes automatisés Phoenix ou IIC, réside dans le fait qu'aucun état de culture préalable n'est requis, et que les résultats d'identification et de test de sensibilité aux antibiotiques peuvent être disponibles le même jour. La procédure sera démontrée par Vandy Hanson et les étudiants en doctorat GID de notre laboratoire. Diluez 100 microlitres de culture sanguine positive pour une croissance microbienne dans un tube à réaction contenant 900 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %. Ensuite, centrifugez l'échantillon à 13 400 ×g pendant cinq minutes afin de former un culot bactérien. Après la centrifugation,Reese, suspendre le culot dans 100 microlitres d'eau stérile déminéralisée. Conserver l'échantillon à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Une fois que tous les échantillons sont prêts, préparer les mélanges de réaction de PCR en temps réel afin d'amplifier l'ADN ribosomique 16 S spécifique des bactéries d'intérêt.Utilisez de l'eau désminéralisée pour ajuster les volumes à 20 microlitres par réaction. Répartissez 20 microlitres du mélange de PCR par puits dans une plaque PCR à 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres d'échantillon dans chaque puits et scellez la plaque PCR.Ensuite, exécutez la PCR sur le système de PCR en temps réel A BI Prism 7,900 HT pour analyser les résultats une fois la PCR terminée. Utilisez d'abord l'onglet des paramètres d'analyse pour régler le seuil d'analyse CT à 0,1. Réduisez ensuite les configurations de la ligne de base de manière à ce qu'elles commencent au cycle 6 et se terminent au cycle 15. Enregistrez la valeur CT pour chaque échantillon.La valeur seuil pour considérer un résultat de PCR comme positif peut généralement être fixée à une valeur de CT de 35. Dans cet exemple, le profil d'identification d'une culture sanguine infectée par E. coli est montré dans deux mélanges réactionnels. Des amorces universelles de l'ADN ribosomique 16 s ont été incluses et ont généré deux courbes d'amplification de CT 25,2 et 25,95.La troisième courbe d'amplification est obtenue à partir de la sonde spécifique à Coli. Aucune autre sonde spécifique n'a généré de signaux détectables. Une fois le pathogène identifié, un test d'antibiotiques peut être effectué.Commencez par transférer cinq millilitres de bouillon provenant d'une hémoculture positive dans un tube avec séparateur de sérum. Centrifugez l'échantillon à 2000 ×g pendant 10 minutes ; après la centrifugation, jetez le surnageant du tube. Ensuite, à l'aide d'un embout stérile en coton, transférez les bactéries de la couche gélatineuse du tube dans du chlorure de sodium à 0,9 %, jusqu'à obtention d'une solution présentant une turbidité équivalente à l'étalon de McFarland 0,5.Cela correspond à environ 1,5 fois 10 à la puissance huit unités formant des colonies par millilitre. Ensuite, diluez la suspension dans du bouillon Muller Hinton à concentration double pour obtenir une concentration d'environ cinq fois 10 à la puissance cinq unités formant des colonies par millilitre.Prélevez une aliquote de 50 microlitres par puits de la suspension dans une plaque de microtitration contenant déjà 50 microlitres par puits d'une sélection d'antibiotiques. Veillez à inclure des témoins positifs de croissance pour chaque échantillon en utilisant des puits contenant de l'eau à la place des antibiotiques. Recouvrez la plaque une fois terminé.Incubez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius pendant six heures pour permettre la croissance bactérienne. Veillez à conserver un aliquot de la suspension bactérienne à quatre degrés Celsius comme témoin négatif de croissance. Après l'incubation de six heures, transférez le contenu de chaque puits et de l'échantillon témoin négatif dans des tubes stériles séparés.Après une centrifugation de cinq minutes à 16 000 × g, retirez 80 µL de surnageant et redispensez les pastilles dans 80 µL d'eau stérile désminéralisée. Diluez les échantillons au ratio de 1 : 10 dans l'eau avant de les utiliser pour la PCR en temps réel de l'ADN ribosomique 16S.Préparez le mélange de PCR en utilisant le super mélange IQ cyber green et les amorces d'ADN ribosomique 16 s, puis effectuez des aliquotes de 20 microlitres par puits dans une plaque PCR 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque échantillon dans les puits et scellez la plaque.Ensuite, réalisez la PCR pour analyser les résultats. Calculez d'abord la valeur seuil de CT. En général, la valeur seuil de CT est égale au CT du témoin positif de croissance plus 0,5 fois le CT du témoin négatif de croissance moins le CT du témoin de croissance.Cependant, pour la pipéracilline associée à la tazobactam et la CEF dazadi chez les bacilles à Gram négatif, ainsi que pour l'amoxicilline, l'oxacilline et le triméthoprime associé à la sulfaméthoxazole chez le staphylocoque doré, ou encore à partir de l'amoxicilline chez l'entérocoque SPP, le facteur de multiplication de 0,5 doit être réduit à 0,25. La sensibilité ou la résistance des souches dans chaque échantillon peut être déterminée en comparant le CT de l'échantillon au CT de seuil.Une valeur de CT supérieure au seuil indique une sensibilité, tandis qu'une valeur de CT inférieure au seuil indique une résistance. Voici un exemple de courbe d'amplification pour un test de sensibilité aux antibiotiques. La souche d'Escherichia coli identifiée précédemment a été testée pour sa sensibilité à plusieurs antibiotiques, chacun représenté par une courbe distincte.Les échantillons présentant une faible valeur de CT sont des échantillons dans lesquels une croissance s'est produite en présence d'un antibiotique, indiquant une résistance à l'antibiotique testé. En revanche, une valeur de CT élevée correspond à un échantillon dans lequel aucune croissance n'a eu lieu, indiquant une sensibilité à l'antibiotique testé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures si elle est effectuée correctement.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Un protocole rapide pour l'identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d'une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d'hybridation in situ (FISH ANP).

Une procédure de 1,5 heure pour l&#39;identification des Enterococcus Espèces directement à partir d&#39;hémocultures

Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Une préparation de culot bactérien rapide à partir d'une culture de sang positif peut être utilisé comme échantillon pour des applications telles que l'identification par MALDI-TOF, la coloration de Gram, les tests de sensibilité aux antibiotiques et le test basé sur la PCR. Les résultats peuvent être transmis rapidement aux cliniciens pour améliorer les résultats des patients souffrant d'infections du courant sanguin.

Préparation d&#39;une hémoculture Pellet pour Rapid bactérienne identification et les tests de sensibilité aux antibiotiques

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’isolement et l’identification de bactéries résistantes aux antibiotiques à partir de l’eau et la caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques (ARG). L’utilisation de techniques basées sur la culture et non basées sur la culture (analyse métagénomique) fournit des informations complètes sur la diversité bactérienne totale et le pool total de différents ARG présents dans les eaux douces de Mumbai, en Inde.

Isolement et identification de bactéries résistantes aux antibiotiques d’origine hydrique et caractérisation moléculaire de leurs gènes de résistance aux antibiotiques

Nous présentons ici le principe, la structure et l’instruction du système intelligent de test de sensibilité antimicrobienne à haut débit / criblage des phages. Son application est illustrée par l’utilisation de Salmonella isolée de volailles dans le Shandong, en Chine, à titre d’exemple. L’indice Lar est calculé, et son importance dans l’évaluation de la résistance aux antimicrobiens est discutée de manière approfondie.

Application du système intelligent de test de sensibilité aux antimicrobiens/criblage des phages à haut débit et de l’indice Lar de résistance aux antimicrobiens

EUCAST a développé un protocole de test direct de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour les hémocultures automatisées. Cependant, sa dépendance à l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse peut être évitée en utilisant un protocole de préparation directe de l’inoculum dans un système automatisé d’identification microbienne. Cette approche permet de fournir des rapports AST dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.

Identification microbienne directe à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne pour faciliter la méthode RAST d’EUCAST sans spectrométrie de masse

Divers agents pathogènes bactériens peuvent provoquer des infections des voies respiratoires et entraîner de graves problèmes de santé s’ils ne sont pas détectés avec précision et traités rapidement. La détection rapide et précise de ces agents pathogènes par amplification isotherme médiée par boucle permet une gestion et un contrôle efficaces des infections des voies respiratoires en milieu clinique.

Détection rapide d’agents pathogènes bactériens à l’origine d’infections des voies respiratoires inférieures grâce à une amplification isotherme médiée par boucle à base de puce microfluidique

Ce protocole décrit une méthode LAMP basée sur une puce microfluidique entièrement intégrée, permettant la détection au point d'intervention de 15 pathogènes responsables d'infections respiratoires basses chez les patients en soins intensifs en moins d'une heure.

Détection rapide au point d'intervention des agents pathogènes responsables des infections des voies respiratoires inférieures chez les patients en unité de soins intensifs

Découvrez une méthode PCR rapide pour identifier les pathogènes bactériens et tester leur résistance aux antibiotiques à partir d'hémocultures en une seule journée. Cette approche améliore la prise en charge clinique des infections.

Schéma de flux de travail dune journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir dhémocultures (Vidéo) | JoVE Journal

Schéma de flux de travail d'une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d'hémocultures

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