Schéma de flux de travail d'une journée pour la détection de pathogènes et des bactéries tests de résistance antimicrobienne à partir d'hémocultures

L'objectif général de cette procédure est d'identifier et d'évaluer la sensibilité aux antibiotiques des isolats de culture sanguine en moins de temps que les méthodes conventionnelles. Cela est réalisé en premier lieu en identifiant l'isolat de la culture sanguine à l'aide d'un nouvel essai PCR MultiPro ciblant l'ADN ribosomique 16 s.

Ensuite, l'isolat est incubé avec un panel d'antibiotiques pendant six heures. L'étape suivante consiste à déterminer la croissance ou l'inhibition de la croissance de l'isolat en présence de l'antibiotique à l'aide d'un dosage quantitatif par PCR de l'ADN ribosomique 16 S. En définitive, les résultats montrent que l'identification et le test de sensibilité aux antibiotiques d'un isolat de culture sanguine peuvent être obtenus plus rapidement grâce à cette combinaison de culture et de PCR.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que celles utilisant des systèmes automatisés Phoenix ou IIC, est qu'aucun état de culture préalable n'est requis, et que les résultats d'identification et de test de sensibilité aux antibiotiques peuvent être disponibles le même jour. La procédure sera démontrée par Vandy Hanson et les étudiants en thèse du GID de notre laboratoire. Diluez 100 microlitres de culture sanguine positive pour une croissance microbienne dans un tube à réaction contenant 900 microlitres de chlorure de sodium à 0,9 %, puis centrifugez l'échantillon à 13 400 ×g pendant cinq minutes afin de former un culot bactérien après la centrifugation.

Reese, suspendre le culot dans 100 microlitres d'eau stérile déminéralisée. Conserver l'échantillon à quatre degrés Celsius jusqu'à utilisation ultérieure. Une fois que tous les échantillons sont prêts, préparer les mélanges de réaction de PCR en temps réel afin d'amplifier l'ADN ribosomique 16 s spécifique des bactéries d'intérêt.

Utilisez de l'eau déminéralisée pour ajuster les volumes à 20 microlitres par réaction. Répartissez 20 microlitres du mélange de PCR par puits dans une plaque PCR de 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres d'échantillon dans chaque puits et scellez la plaque PCR.

Ensuite, exécutez la PCR sur le système de PCR en temps réel A BI Prism 7,900 HT pour analyser les résultats une fois la PCR terminée. Utilisez d'abord l'onglet des paramètres d'analyse pour régler le seuil d'analyse CT à 0,1. Réduisez ensuite les configurations de la ligne de base afin qu'elles commencent au cycle 6 et se terminent au cycle 15. Enregistrez la valeur CT pour chaque échantillon.

La valeur seuil pour considérer un résultat de PCR comme positif peut généralement être fixée à une valeur de CT de 35. Dans cet exemple, le profil d'identification d'une culture sanguine infectée par E. coli est présenté dans deux mélanges réactionnels. Des amorces universelles de l'ADN ribosomique 16 s ont été incluses et ont produit deux courbes d'amplification de CT 25,2 et 25,95.

La troisième courbe d'amplification est dérivée de la sonde spécifique à Coli. D'autres sondes spécifiques n'ont pas généré de signaux détectables. Une fois le pathogène identifié, un test d'antibiotiques peut être effectué.

Commencez par transférer cinq millilitres de bouillon provenant d'une hémoculture positive dans un tube séparateur de sérum. Centrifugez l'échantillon à 2000 ×g pendant 10 minutes ; après la centrifugation, éliminez le surnageant du tube. Ensuite, à l'aide d'un swab stérile en coton, transférez les bactéries de la couche gélatineuse du tube dans du chlorure de sodium à 0,9 %, jusqu'à obtention d'une solution présentant une turbidité équivalente à l'étalon de McFarland 0,5.

Cela correspond à environ 1,5 fois 10 à la puissance huit unités formant des colonies par millilitre. Ensuite, diluez la suspension dans du bouillon Muller Hinton à concentration double pour obtenir une concentration d'environ cinq fois 10 à la puissance cinq unités formant des colonies par millilitre.

Prélevez une aliquote de 50 microlitres par puits de la suspension dans une plaque de microtitration contenant déjà 50 microlitres par puits d'une sélection d'antibiotiques. Veillez à inclure des témoins positifs de croissance pour chaque échantillon en utilisant des puits contenant de l'eau au lieu d'antibiotiques. Couvrez la plaque une fois terminé.

Incubez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius pendant six heures pour permettre la croissance bactérienne. Veillez à conserver un aliquot de la suspension bactérienne à quatre degrés Celsius comme témoin négatif de croissance. Après l'incubation de six heures, transférez le contenu de chaque puits et de l'échantillon témoin négatif dans des tubes stériles séparés.

Après une centrifugation de cinq minutes à 16 000 ×g, retirez 80 microlitres de surnageant et remettez en suspension les culots dans 80 microlitres d'eau stérile déminéralisée. Diluez les échantillons au 1/10 dans l'eau avant de les utiliser pour une PCR en temps réel ciblant l'ARNr 16 S.

Préparez le mélange de PCR en utilisant le super mélange IQ cyber green et les amorces d'ADN ribosomique 16 s, puis aliquotez 20 microlitres par puits dans une plaque PCR à 96 puits. Ajoutez ensuite cinq microlitres de chaque échantillon dans les puits et scellez la plaque.

Ensuite, réalisez la PCR pour analyser les résultats. Calculez d'abord la valeur seuil de CT. En général, la valeur seuil de CT est égale au CT du témoin positif de croissance ajouté à 0,5 fois le CT du témoin négatif de croissance, moins le CT du témoin de croissance.

Cependant, pour la pipéracilline associée à la tazobactam et la CEF dazadi chez les bacilles à Gram négatif, ainsi que pour l'amoxicilline, l'oxacilline et le triméthoprime associé à la sulfaméthoxazole chez le staphylocoque doré, ou encore à partir de l'amoxicilline chez l'entérocoque SPP, le facteur de multiplication de 0,5 doit être réduit à 0,25. La sensibilité ou la résistance des souches dans chaque échantillon peut être déterminée en comparant le CT de l'échantillon au CT de seuil.

Une valeur de CT supérieure au seuil indique une sensibilité, tandis qu'une valeur de CT inférieure au seuil indique une résistance. Voici un exemple de courbe d'amplification pour la sensibilité aux antibiotiques. La souche d'E. coli identifiée précédemment a été testée pour sa sensibilité à plusieurs antibiotiques, chacun représenté par une courbe distincte.

Les échantillons présentant une faible valeur de CT sont des échantillons dans lesquels une croissance s'est produite en présence d'un antibiotique, indiquant une résistance à l'antibiotique testé. En revanche, une valeur de CT élevée correspond à un échantillon dans lequel aucune croissance n'a eu lieu, indiquant une sensibilité à l'antibiotique testé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en neuf heures si elle est effectuée correctement.