Name: Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Apprenez à isoler les cellules NK du sang humain par sélection négative avec le kit RosetteSep StemCell Technologies. Cette méthode garantit une haute pureté et viabilité cellulaire pour vos recherches en immunologie.

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Un protocole détaillé est inclus avec chaque cocktail Rosette isolement Sep et est disponible en ligne sur le site StemCell technologies 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Les cellules isolées en utilisant cette technique peut encore être séparées en différentes populations en utilisant d&#39;autres kits de séparation des cellules.

PBS supplémenté avec 2% de FCS et de solutions Histopaque doit être porté à la température ambiante avant le début de la procédure.

enrichissement des cellules nk du sang humain avec le kit de rosettesep stemcell technologies

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) sont de grands lymphocytes cytotoxiques granulaires qui appartiennent au système immunitaire inné et jouent un rôle majeur dans la lutte contre le cancer et les infections, mais sont également impliqués dans les premiers stades de la grossesse et le rejet de greffe. Ces cellules sont présentes dans le sang périphérique, d&#39;où ils peuvent être isolés. Les cellules peuvent être isolées en utilisant la sélection positive ou négative. Pour la sélection positive, nous utilisons des anticorps dirigés contre un marqueur de surface présents uniquement sur les cellules d&#39;intérêt alors que pour la sélection négative, nous utilisons des cocktails d&#39;anticorps ciblés pour des marqueurs de surface présents sur toutes les cellules, mais les cellules d&#39;intérêt. Cette dernière technique présente l&#39;avantage de laisser les cellules d&#39;intérêt exempt d&#39;anticorps, réduisant ainsi le risque d&#39;activation des cellules indésirables ou de différenciation. Dans cette vidéo-protocole, nous démontrons comment séparer les cellules NK du sang humain par une sélection négative, en utilisant le kit de RosetteSep StemCell Technologies. La procédure consiste à obtenir du sang périphérique humain (sous une revue institutionnelle approuvée par le conseil protocole pour protéger les sujets humains) et le mélanger avec un cocktail d&#39;anticorps qui se lient à des marqueurs absents sur les cellules NK, mais présent sur toutes les autres cellules mononucléaires périphériques présents dans le sang (par exemple, les lymphocytes T, les monocytes ...). Les anticorps présents dans le cocktail sont conjugués à des anticorps dirigés contre la glycophorine A érythrocytes de suite. Toutes les cellules non désirées et les globules rouges seront donc pris au piège dans les complexes. Le mélange de sang et un cocktail d&#39;anticorps est ensuite diluée, superposé sur un gradient Histopaque, et centrifugé. Les cellules NK (&gt; 80% pur) peuvent être collectées à l&#39;interface entre les Histopaque et le plasma dilué. Cocktails similaires sont disponibles pour l&#39;enrichissement des autres populations cellulaires, telles que les lymphocytes T humains.

Les cellules tueuses naturelles sont une petite population de lymphocytes. Ici, nous montrons comment isoler ces cellules du sang humain par une sélection négative, en utilisant un kit de StemCell Technologies. Les cellules obtenues sont viables et épargnée par les anticorps, et donc prêt à être utilisé pour un certain nombre de procédures.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

Les cellules natural killer (NK) sont de grands lymphocytes cytotoxiques granulaires appartenant au système immunitaire inné et jouent des rôles majeurs dans la lutte contre le cancer ...

Bonjour, je suis Christine Beaton. Je suis chercheuse assistante dans le laboratoire de George Chen au Département de physiologie et de biophysique de l'Université de Californie à Irvine. Aujourd'hui, je vais vous montrer comment sélectionner négativement des cellules natural killer à partir de sang humain en utilisant les kits en cocktail de Stem Cell Technologies.La raison pour laquelle nous utilisons ce kit de Stem Cell Technologies est qu'il nous permet d'obtenir une pureté cellulaire très élevée, et la sélection négative nous permet d'isoler des cellules qui n'ont pas été liées à un anticorps. Ainsi, aucune réaction inattendue ne se produit avec ces cellules. Le fonctionnement du kit Tsep repose sur l'utilisation d'anticorps qui se lient à toutes les cellules présentes dans le sang auxquelles on n'est pas intéressé.Dans mon cas, les cellules T, les cellules B, les monocytes, puis vous avez les anticorps qui vont se lier à la glycophorine A des globules rouges ; ce qu’ils ont fait, c’est lier un anticorps dirigé contre une cellule blanche à un anticorps dirigé contre un globule rouge. Ce qui va donc se produire, c’est la formation d’un complexe composé d’une cellule blanche indésirable et de plusieurs globules rouges. Étant donné que les globules rouges ont une densité plus élevée que les cellules blanches, une fois que vous placez votre cocktail mixte contenant le sang et vos anticorps sur un gradient et que vous effectuez une centrifugation, les globules rouges vont descendre au fond du tube et entraîner avec eux toutes les cellules blanches que vous ne souhaitez pas conserver. Ainsi, en surface, ce que vous allez recueillir, ce sont vos cellules tueuses naturelles pures, ou presque pures, qui n’ont en aucun cas été liées à un anticorps.Commençons donc l'isolement des cellules NK à partir d'un tube de sang humain. Il s'agit d'un prélèvement sanguin fraîchement effectué dans un tube contenant de l'héparinate de sodium. Je vais utiliser le cocktail d'enrichissement pour cellules NK humaines Roset ep comme gradient.Plus tard dans mon expérience, j'utiliserai le pack histopaque 10 77, qui a une densité de 1,077, et j'ai également préparé un flacon de PBS supplémenté avec 2 % de sérum de veau fœtal. Je m'assure que ces composants atteignent la température ambiante avant de les utiliser, car je les conserve au réfrigérateur. Je vais donc prendre tout le tube de sang et le verser dans un tube conique de 50 ml.Ainsi, puisqu’il s’agit d’un récipient sous vide, il y a un vide à l’intérieur ; pour l’ouvrir sans éclaboussure, je repère l’encoche sur le couvercle du bouchon et je le soulève délicatement pour laisser entrer de l’air dans mon tube. Et quand, une fois que le vide est rompu dans le tube, je peux retirer plus facilement le bouchon, puis, à l’aide d’une pipette de 10 ml, je vais pipeter tout le contenu sanguin du tube. J’espère donc obtenir environ 10 ml de sang.Ici, j'ai 9,5 ml de sang et je vais verser ces 9,5 ml entiers dans ce tube Falcon de 50 ml. Ensuite, la pipette contenant le sang est placée directement dans le sac pour déchets biologiques ; pour le tube, j'ajoute toujours de l'eau de Javel, je le ferme, puis je le place dans le sac pour déchets biologiques. Voici à quoi ressemble le sang avant l'ajout du cocktail d'anticorps.Je vais maintenant ajouter le cocktail d'anticorps au sang, puisque j'ai environ 9,5 ml de sang et que je dois ajouter 50 microlitres de cocktail par ml de sang. Je vais donc ajouter 450 microlitres du cocktail à mon sang. Ensuite, je vais mélanger délicatement, et presque immédiatement, vous allez voir apparaître l'agrégation. Comme vous pouvez le voir maintenant, l'agrégation est visible.Ainsi, la fuite croisée entre les globules blancs indésirables et les globules rouges se produit actuellement. Je vais régler une minuterie sur 20 minutes et laisser le tube en place dans la hotte pendant 20 minutes. Le sang a maintenant incubé pendant 20 minutes avec le cocktail de sous-rosettes.Je vais donc le diluer au demi avec le PBS plus du sérum de veau fœtal. Et je vais déposer ce mélange sur deux portions de 15 millilitres d'Histopaque 1077. Ensuite, je vais centrifuger mon échantillon pendant 20 minutes.J'ai donc environ 10 ml de sang plus un cocktail d'anticorps. Je vais donc ajouter 10 ml de PBS contenant 2 % de sérum de veau fœtal. Il s'agit donc d'une dilution au demi. Je devrai mélanger délicatement, car comme vous pouvez le constater lorsque j'ajoute le PBS au sang, celui-ci ne se mélange pas immédiatement. Pour cela, je mélange simplement délicatement. J'ai maintenant un mélange équivalent de PBS et de sang, et c'est ce mélange que j'ajouterai à mes 15 millilitres de Histo-Paque.Et je vais le recouvrir soigneusement pour éviter de mélanger le sang avec le milieu histo. Pour cela, au lieu d'utiliser une pipette de 25 M qui préleverait tout le sang, je vais utiliser une pipette de 10 ml et procéder en plusieurs étapes. Pour faciliter le recouvrement, je tiens mon tube contenant le milieu histo presque horizontalement.Je vais déposer un peu de sang sur le tube et l'amener jusqu'au pack histopaque. Ensuite, je vais superposer très lentement le sang sur le pack histopaque. Une fois que j'ai une bonne couche de sang, je peux effectivement commencer à transférer un peu plus rapidement et ramener progressivement mon tube en position verticale.À présent, j'ai déposé mes 20 mils au total de mélange de sang avec le cocktail d'anticorps et du PBS sur deux 15 mils de histogel. Et si vous observez la jonction du tube, vous commencez à voir lentement de petits agrégats de globules rouges s'enfoncer progressivement dans le gradient, et nous allons centrifuger les réticulocytes simplement pour accélérer le processus. Ainsi, en 20 minutes, tous les globules rouges seront au fond du tube.Et il y a un point très important lorsqu'on effectue une gt : il faut désactiver le frein, car un freinage trop rapide pourrait perturber vos ingrédients. Nous désactivons donc toujours le frein, puis je vais lancer mon fils RI pendant 20 minutes et lui permettre d'accomplir son travail. L'ingrédient a maintenant été centrifugé pendant 20 minutes.Nous avons donc les différentes couches de cellules. Nous commençons au fond du tube ici. Voici tous les globules rouges et les cellules qui ne nous intéressent pas.Au-dessus, on observe une couche claire de gradient et, au-dessus de celle-ci, une couche jaunâtre de plasma. Les cellules qui nous intéressent aujourd'hui, les cellules NK, forment ce fin dépôt blanc entre les couches de gradient et de plasma.Cette couche est donc très, très fine, car les cellules NK ne représentent qu'une minorité des cellules sanguines. Je vais maintenant prélever cette couche de cellules NK à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Cette couche sera ensuite transférée dans un nouveau tube Falcon de 50 ml vide.Je vais donc à la couche et je la prélève. Bien sûr, il y a très peu de cellules. Lorsque vous avez beaucoup de cellules, vous pouvez obtenir la couche très proprement, mais quand il y a si peu de cellules.Et comme il est recommandé sur la notice du fabricant, ils conseillent de prélever une partie du gradient avec les cellules afin d'éviter de les perdre. Je prélève donc à la pipette tant que je vois des cellules. Une fois que toutes les cellules ont été prélevées, vous devriez observer un contraste net entre le réactif clarifié et le plasma jaunâtre.Je pense donc que j'ai récupéré toutes mes cellules maintenant. Si vous observez le gradient, vous ne voyez rien de blanc et d'irrégulier à l'interface entre le histopaque et le plasma. J'ai donc retiré toutes les cellules NK visibles du gradient, les ai placées dans un nouveau tube Falcon de 50 ml, et j'ai immédiatement ajouté dans le tube du PBS supplémenté avec 2 % de sérum de veau fœtal.Donc, je l'ai rempli jusqu'à 50 ml et je vais centrifuger les cellules pour les mettre en culot. Ce sera le premier lavage. Je vais répéter la procédure une deuxième fois afin de laver les cellules au total deux fois.Ensuite, les cellules seront prêtes pour toute procédure souhaitée, qu'il s'agisse de les mettre en culture ou de les utiliser pour une coloration en cytométrie en flux. Vous devriez obtenir une pureté d'au moins 80 % de cellules NK, voire plus. J'ai obtenu jusqu'à 98 % de pureté avec cette procédure.Aujourd'hui, je vous ai présenté une technique très rapide et fiable pour isoler les cellules tueuses naturelles à partir de sang humain, en utilisant les kits TS de Stem Cell Technologies. Et bien sûr, si vous souhaitez isoler d'autres types cellulaires à partir de sang humain, de rat ou de souris, vous pouvez utiliser l'un des nombreux kits d'isolement de cellules T. Ils en proposent pour les cellules T, les cellules B, et même pour des sous-types de cellules T, par exemple.

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Nous décrivons ici une méthode pour développer efficacement et de purifier de grands nombres de cellules NK humaines et d'évaluer leur fonction.

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Cette vidéo montre la méthode d’analyse du métabolisme énergétique dans les cellules NK humaines activées à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Différents inhibiteurs des complexes de la chaîne de transport d’électrons ont un impact sur la synthèse de l’ATP, qui est mesurée par le taux de consommation d’oxygène ou OCR, fournissant des informations sur le métabolisme cellulaire et la bioénergétique.

Surveillance en temps réel du métabolisme énergétique dans les cellules NK humaines à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire

Ce protocole décrit le développement, l'expansion et l'imagerie in vivo des cellules NK dérivées de CSEh et iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

Une méthode simple et fiable est décrit ici pour analyser un ensemble de fonctions des cellules NK telles que la dégranulation, la cytokine et la production de chimiokines dans les différents sous-ensembles de cellules NK.

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

L’objectif de cette étude était de formuler des technologies permettant la transduction réussie de gène dans les cellules primaires de le natural killer (NK). L’induite par le dextran de transduction des gènes de l’homme ou les résultats de cellules NK primaires de souris à une efficacité accrue les expression de gène. Cette méthode de transduction gène améliorera la manipulation génétique de cellules NK.

Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

Une méthode axée sur la cytométrie de flux pour déterminer quantitativement l’activité cytotoxique des humains les cellules tueuses naturelles est montrée ici.

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Nous présentons ici un protocole pour produire en série-silençage génique des cellules NK en utilisant un système de différenciation exempte d’engraissement pour étude mécanistique in vitro et in vivo.

Un nouveau système exempt d’alimentation pour la Production de masse des cellules tueuses naturelles murins In Vitro

Un protocole d’étude des événements induits par FcγRIIIa par des anticorps thérapeutiques dans des cellules tueuses naturelles humaines est décrit ici. Cette plate-forme de stimulation artificielle permet d’interroger les fonctions effectrices en aval telles que la dégranulation, la production de chimiokines / cytokines et les voies de signalisation médiées par les parties FcγRIIIa et Fc des anticorps impliqués dans la liaison.

Évaluation des événements des cellules tueuses naturelles humaines provoquées par l’engagement de FcγRIIIa en présence d’anticorps thérapeutiques

Le présent protocole montre comment différencier les cellules CD3−/CD45+CD56+ présentant une cytotoxicité légère des cellules souches à potentiel élargi humain (CSEPH) dans des conditions de culture 3D et 2D. Cela permet une validation phénotypique de routine sans la destruction du microenvironnement complexe.

Production de cellules tueuses naturelles à partir de cellules souches humaines à potentiel élargi

Ici, nous présentons une méthode pour différencier et étendre les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) humain dérivé de l’iPSC avec une meilleure destruction contre diverses tumeurs malignes. Ce protocole démontre la différenciation et l’expansion des cellules CAR-NK dérivées d’iPSC optimisées pour les tueurs naturels (NK) et la mesure de l’activité antitumorale contre diverses lignées cellulaires tumorales.

Progrès dans les cellules tueuses naturelles exprimant le récepteur de l’antigène chimérique dérivé de cellules souches pluripotentes humaines induites

Apprenez à isoler les cellules NK du sang humain par sélection négative avec le kit RosetteSep StemCell Technologies. Cette méthode garantit une haute pureté et viabilité cellulaire pour vos recherches en immunologie.

Enrichissement des cellules NK du sang humain avec le Kit de RosetteSep StemCell Technologies

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