L'utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

L’objectif global de l’expérience suivante est d’effectuer une co-culture à long terme d’Hemophilus influenza non typable ou NTHI avec des tissus épithéliales respiratoires humains primaires à l’aide du modèle épithélial épithélial épidé épidémique. Ceci est réalisé en inoculant la surface apicale avec NTHI pour permettre aux bactéries d’adhérer et de pénétrer dans les tissus dans un deuxième temps. Les inserts sont lavés toutes les 24 heures avec du DPBS préchauffé pour imiter le flux normal de mucus et pour éliminer les déchets de mucine et tous les débris cellulaires.

Ensuite, les tissus sont récoltés au moment souhaité et la survie de la NTHI associée aux cellules totales ou internalisée est déterminée. Enfin, cette méthode permet d’évaluer les caractéristiques spécifiques de la souche de survie des NTHI dans les tissus au fil du temps, en fonction du nombre de bactéries viables. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des infections à long terme par l’hémophilus influenza non typable.

Il peut également être utilisé dans l’étude d’autres agents pathogènes humains tels que Moraxella Alis, démontrant que cette procédure sera par le Dr Doin, un boursier postdoctoral dans mon laboratoire. Retirez la plaque de transport de son emballage et préparez-vous à commencer l’expérience. Vaporisez la plaque de transport avec de l’éthanol à 70 % et placez la plaque dans l’enceinte de biosécurité.

Aliquote un millilitre de quatre degrés Celsius, voies respiratoires épi, milieu de maintenance dans chaque puits d’une plaque à six puits. Ensuite, après avoir retiré le ruban adhésif, ouvrez la plaque et retirez la gaze recouvrant les inserts des voies respiratoires épi. À l’aide d’un mouvement de torsion, utilisez une pince à épiler pour libérer un insert de l’aros.

Placez l’insert dans l’un des puits de la plaque à six puits si nécessaire. À l’aide d’un coton-tige stérile, retirez délicatement les aros de l’insert, en évitant de toucher la membrane. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée sous les inserts.

Et puis placez la plaque à six puits dans un incubateur. Lavez les inserts tous les jours comme suit, préchauffez le DPBS avec du calcium et du magnésium et remplissez un embout avec le DPBS. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, prélevez un insert à pipette doucement de 200 microlitres de DPBS préchauffé sur le tissu.

Ensuite, basculez l’insert pour répartir uniformément le DPBS sans toucher le tissu. Ensuite, inclinez l’insert en biais et placez une pointe de pipette P 1000 contre l’anneau en plastique qui maintient la membrane au bas de l’insert. Ensuite, aspirez soigneusement la solution tampon et placez la solution dans un tube cryogénique pour une étude ultérieure.

Enfin, aspirez le milieu d’entretien de base et remplacez-le par un millilitre de milieu frais. Préchauffez plus de DPBS avec du calcium et du magnésium. Ajoutez trois millilitres de DPBS préchauffé dans un tube de 15 millilitres, puis remettez en suspension des colonies individuelles de grippe non typable ou de NTHI cultivées pendant la nuit sur de la gélose au chocolat dans le tube.

Maintenant, agitez vigoureusement le tube pendant au moins 10 secondes, puis mesurez la densité optique. Continuez à ajouter des colonies uniques de NTHI jusqu’à ce que la concentration bactérienne atteigne une DO de 600 nanomètres d’environ 0,7. Ensuite, lavez chaque insert des voies respiratoires EPI avec du DPBS préchauffé comme auparavant, puis ajoutez 28 microlitres de suspension bactérienne à la surface apicale de chaque insert.

Éviter d’inoculer le milieu d’entretien basal. Ensuite, remettez la plaque dans l’incubateur pour quantifier la NTHI en préchauffant d’abord, puis en surface, en faisant sécher les plaques de gélose au chocolat. Ensuite, diluez en série l’inoculum NTHI à l’aide de PBS stérile avec 0,1 % de gélatine ou de PBSG.

Déposez 10 aliquotes d’un microlitre de l’inoculum sur les plaques, puis incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, déterminez les UFC par millilitre en comptant la dilution qui a 15 à 30 colonies distinctes dans chaque goutte, et en recalculant jusqu’à votre inoculum viable réel de NTHI pour récolter le total des bactéries associées aux cellules. Rincez trois fois la surface apicale des voies respiratoires épidébriques avec 200 microlitres de DPBS sans calcium ni magnésium.

Ensuite, inclinez l’insert et rincez tout produit d’entretien restant de la membrane basale. Placez l’insert lavé dans une assiette fraîche à six puits et ajoutez 250 microlitres de solution stérile à 1 % de saponine sur la surface apicale de chaque tissu. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 10 minutes pendant que la plaque est en incubation.

Mettre en place des tubes pour la dilution en série en remplissant chaque tube de dilution avec 900 microlitres de PBSG. Ensuite, frottez le tissu de la membrane avec une pointe de pipette P 1000 en utilisant un mouvement de va-et-vient, suivi d’un mouvement circulaire pour retirer le tissu des bords de l’insert. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette P 1000 stérile de grand calibre, placez la suspension dans un tube einor vide de 1,5 millilitre.

Ajoutez maintenant 250 microlitres de DPBS sur la surface apicale de l’insert, puis examinez l’insert à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé pour déterminer s’il reste du tissu à prélever. Ajoutez la suspension au tube einor et complétez vigoureusement avec 500 microlitres de DPBS. Vortex la suspension cellulaire pendant une minute.

Puis à l’aide d’une seringue stérile d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 26. Aspirez la suspension dans la seringue à travers l’aiguille. Passez lentement la suspension à travers l’aiguille trois fois, en prenant soin de ne pas créer de bulles.

Ensuite, faites tourbillonner vigoureusement la suspension pendant une minute supplémentaire. Ensuite, utilisez une pointe de pipette de grand diamètre pour transférer 100 microlitres de suspension dans le premier tube de dilution. Agitez vigoureusement le tube pendant cinq secondes, puis faites une à 10 gouttes de dilution en série sur des plaques de gélose au chocolat.

Ensuite, incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone pour un comptage de bactéries viables pour récolter les bactéries internalisées. Lavez uniquement trois fois chaque insert avec 200 microlitres de DPBS. Remplacez le milieu d’entretien basal par un milieu contenant 100 microgrammes par millilitre de sulfate de gentamycine, puis ajoutez 300 microlitres de milieu d’entretien contenant de la gentamycine sur la surface apicale.

Remettez les inserts dans l’incubateur pendant une heure pendant que les inserts sont en incubation, préchauffez certains DPBS. Retirez ensuite le milieu d’entretien contenant de la gentamycine de la surface apicale. Ensuite, lavez abondamment la surface apicale et la membrane basale des inserts avec le DPBS préchauffé.

Enfin, répétez la procédure de nettoyage et de récolte qui vient d’être démontrée avant d’effectuer des dilutions en série et un placage des bactéries internalisées dans cette figure. Comparaison d’images au microscope électronique à balayage de tissus épidéo-respiratoires non infectés à gauche avec des tissus épidéo-respiratoires infectés par NTHI cinq jours à droite. On peut voir que la co-culture à long terme avec NTHI n’entraîne pas de dommages significatifs aux tissus apicals, ce qui souligne l’utilité du modèle épidéo-respiratoire

Ici, un graphique décrivant le nombre de NTHI internalisés au fil du temps au cours d’une co-culture des voies respiratoires épidémiologiques est présenté. La souche R 2, 8, 6, 6 a été inoculée à environ une fois 10 de la septième UFC par insert. Ensuite, les bactéries internalisées ont été récoltées et dénombrées à chaque point temporel indiqué.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une co-culture à long terme de NTHI avec les tissus respiratoires hormonaux primaires à l’aide du modèle A PRE.