Name: Test dactivation des basophiles pour lenquête des IgE dans les mécanismes dhypersensibilité médicamenteuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Apprenez le test d'activation des basophiles pour détecter l'hypersensibilité médicamenteuse IgE-médiée. Cette méthode utilise des conjugués médicament-protéine caractérisés par chromatographie d'exclusion stérique.

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Ce travail a été financé par le Fonds autrichien pour la science (FWF) accorder P18820-B13. Déclaration d&#39;éthique: L&#39;étude a été approuvée (PLUS_Ethik_090514) par le Comité d&#39;éthique pour l&#39;expérimentation avec des êtres humains et / ou les animaux à l&#39;Université de Salzbourg se conformer aux Declaraction Helsinki révisée de 1983 et tous les patients participant ont donné leur consentement éclairé écrit.

1. Préparation des conjugués de drogue <ol><li> Dissolvez 10 mg dans 1 ml de dH O 2 DF dans un tube de 1,5 ml de réaction. Dans la procédure utilisation ultérieure 95 ul de cette solution DF. Pour conjuguer PP à la HSA dissoudre 30,4 mg PP dérivés (304 g / mol) dans 500 pi 0,3 M d'hydroxyde de sodium (NaOH). </li><li> Ajouter 430,6 ul dH 2 O et 100 ul 0,5 m 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) tampon pH 6,5 à 95 ul de DF dissous. Ajouter 33,1 ul dH 2 O et 140 ul de 2 M MES tampon pH 2,9 à l'échantillon PP. </li><li> Ajouter 57,5 ul d'une solution fraîchement préparée de N-éthyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide solution mère (EDC) dissous dans dH 2 O avec une concentration de 100 mg / ml à l'échantillon DF, ou une solution de 10 ul d'EDC l'échantillon PP. Vortex les échantillons pendant 1 minute. </li><li> Ajouter 16,9 pi de solution de HSA avec une concentration de 118 mg / ml à chaque échantillon. </li><li> Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante tout en agitant à 300 tours / min. </li><li> Dialyser le DF et les échantillons de PP 3 fois contre 2 litres de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,4 pendant plusieurs heures chacune. Effectuez toutes les étapes de dialyse à 4 ° C. </li><li> Centrifuger l'échantillon de 10 minutes à 14000 xg et recueillir les DF surnageant contenant ou PP conjugué à la HSA. </li><li> Vérifiez surnageant pour les protéines en effectuant une SDS-PAGE, utilisant des gels à 12%. Charge d'environ 12 mg de HSA conjugué dans un slot de gel. </li></ol> 2. Déterminer le taux de couplage de la drogue conjugués (figure 2) <ol><li> Pour l'analyse du taux de couplage de DF et PP conjugués par HPSEC utiliser un 100 mM tampon phosphate de sodium pH 6,5 contenant 150 mM de NaCl et de l'azide de sodium à 0,05%. Utilisez un x 7,8 à 300 mm TSK-Gel-G2000 colonne SWXL. </li><li> Effectuer la détection des signaux en utilisant une ligne couplée RI et le système de détecteur UV. </li><li> Préparer un échantillon standard HSA avec une concentration de 1 mg / ml dans dH 2 O. Pour étalonnage du détecteur d'injecter 50 ul HSA solution standard. </li><li> Calculer la RI RI k constante et l'UV UV k constant pour le détecteur. Utilisez la zone de formules RI = RI k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] et la zone UV UV = k * [(DA / DC) HSA * c (HSA)] avec (dn / dc) = HSA 0,185 et (DA / DC) = 0.518 HSA 5. </li><li> Préparer DF et PP standards dérivés à des HPSEC que les montants de 5, 10 et 30 nmol de ces deux normes peuvent être facilement injectées. </li><li> Calculer les valeurs moyennes de (dn / dc) et de la drogue (DA / DC) des médicaments pour les deux normes. Pour DF, un (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 et un (DA / DC) de 39,000 ± 0,493 a été déterminé. Pour PP, un (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 et un de (DA / DC) ± 2,464 53,155 a été déterminée. </li><li> Injecter conjugués drogue sur HPSEC et de déterminer leur RI et UV domaines de pointe. </li><li> Calculer la concentration de DF, dérivé PP, et HSA en résolvant les équations deux zones RI = RI k * [(dn / dc) des médicaments * c (médicament) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] UV région et UV = k * [(DA / DC) de drogue * c (médicament) + (DA / DC) HSA * c (HSA)] pour les inconnues. </li></ol> 3. BAT à l'aide de médicaments conjugués <ol><li> Préparer sept coupes cytométrie de flux et de les étiqueter selon leur contenu: le contrôle sans tache, le contrôle négatif, contrôle positif, et conjugués de drogue. </li><li> Pipeter 50 pi de tampon de stimulation B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) dans les flacons réservés pour le contrôle sans tache et négatifs. Comme contrôle positif, utiliser 50 ul d'une solution anti-FceRI fournies par le kit Flow2 CAST. Ajouter la quantité appropriée de solution de conjugué à l'flacons réservés pour les conjugués de drogue en créant une série de dilution 1:10 de 0,02 -20 pg / ml DF et PP conjugué conjugué (concentrations finales dans un volume d'essai de 200 pi). Ces expériences de titration doit être réalisée pour déterminer la concentration d'activation des basophiles optimale pour chaque échantillon de patient. </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de stimulation à chaque tube de sang EDTA et 50 patients ul du tout. Mélanger les échantillons soigneusement. </li><li> Pipeter 20 ul Flow2 réactif de révélation CAST contenant des anti-CCR3 anticorps marqués à la phycoérythrine (PE) et des anticorps anti-CD63 marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à chaque tube et mélanger à nouveau. Ne pas pipeter réactif de révélation dans l'échantillon non coloré! </li><li> Incuber les échantillons pendant 45 minutes dans un bain d'eau à 37 ° C. </li><li> Arrêtez la réaction sur la glace pendant 5 minutes. </li><li> Lyse érythrocytes en ajoutant 2,0 ml de réactif CAST Flow2 lyse à chaque flacon et le vortex doucement. Incuber les échantillons dans l'obscurité pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 500 xg et le surnageant décanter avec précaution. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de lavage Flow2 CAST et de stocker la glace jusqu'à la cytométrie de flux. </li><li> Ajustez la tension s le cytomètre en flux dearam è tres de diffusion vers l'avant et de côté (FSC, SSC) tout en acquérant de l'échantillon non colorées. </li><li> Porte des cellules prédit que les lymphocytes de la parcelle SSC-FSC à l'intrigue SSC-PE. Les basophiles sont identifiés par un PE-anticorps anti-CCR3 anticorps comme CCR3 Salut lo SSC et les porte dans l'intrigue FITC-PE. L'anticorps anti-CD63 détecter les basophiles activés est marqué au FITC. </li><li> Régler le seuil à maximum 2,5% de basophiles CD63 comme Salut dans le contrôle négatif. Un échantillon est considéré positif pour l'activation des basophiles, si basophiles&gt; 5% sont CD63 salut et l'indice de fluorescence moyenne (IFM) de l'échantillon divisé par le MFI du contrôle négatif dépasse 2 (figure 3). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Cette expérience évalue BAT comme un outil bénéfique pour détecter hypersensibilité médicamenteuse IgE-dépendante. Conjugués de protéines d'AINS sont utilisés pour l'activation des basophiles. Par HPSEC avec RI et de l'état d'agrégation détection UV, le degré de couplage et de rendement effectif des conjugués sont déterminées. Comme la figure 4 montre, 43,5% des conjugués DF resté monomères avec un degré de couplage de 5,0 DF / HSA. Pour les agrégats un degré de couplage de 9,5 a été déterminée. Le conjugué propyphenazone a été démontré que des monomères constitués de 68,5% avec un degré de couplage de 21,2. Le degré de couplage des agrégats était de 27,9. Au total, le degré de couplage déterminée de conjugués DF DF était de 7,6 et que des conjugués PP était de 23,2. BAT réalisé avec des conjugués dans des conditions optimisées (concentration des conjugués, le temps de stimulation) permis d'étudier les réactions IgE-dépendante dans l'hypersensibilité aux AINS. Comme le montre la figure 5, seul le PP a été conjugué à même de déclencher l'activation des basophiles visualisés par une régulation positive de l'expression en surface CD63: 20,6% des basophiles ont été activés caractérisée par un journal de changement dans l'intensité de fluorescence. L'IMF a augmenté par un facteur de 4,9 par 386 (témoin négatif) à 1893. En revanche, en utilisant le conjugué DF seulement 3,1% des basophiles ont été activés, qui était inférieur à 5% de coupure. Aussi l'IMF n'a augmenté que d'un facteur 1,1 (limite 2,0) à partir de 197 (témoin négatif) à 210. La validité de dosage est donnée par (i) &lt;5% d'activation des basophiles dans le contrôle négatif, (ii) un journal de changement dans l'intensité de fluorescence d'une sous-population des basophiles, et (iii)&gt; 50% basophiles activés (contrôle positif). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Couplage des dérivés DF et PP à la HSA. Après dissolution de la drogue, l'eau, tampon MES, et EDC (réactif de couplage) sont ajoutés. Les échantillons sont vortexés pendant 1 minute avant de HSA est pipeté aux solutions de drogue. Dans les 2 heures d'agitation à température ambiante, la drogue de façon covalente se lient à la SAH. Monomères ainsi que des agrégats peuvent en résulter. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Calcul des degrés d'accouplement. Tout d'abord, les constantes k RI et UV k sont déterminés. Par conséquent, HSA standard avec une concentration connue est injecté dans le système HPSEC. (Dn / dc) et (DA / DC) de HSA sont donné des valeurs de 0,185 et 0,518, respectivement 5. Les domaines de pointe sont utilisées pour calculer les constantes. Deuxièmement, pour chaque médicament trois normes sont injectés afin de déterminer la drogue et de la concentration et les zones spécifiques du RI UV. Depuis l'IR k et k constantes UV sont connus à partir des étapes précédentes, les dérivés de médicaments spécifiques (dn / dc) et (DA / DC) peut être calculé. Troisièmement, la drogue-SAH conjugués sont injectés dans HPSEC. Les aires des pics obtenus sont utilisés pour calculer les concentrations de médicament et HSA par de pointe en résolvant les deux équations à deux inconnues. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 3"> Figure 3. Gating basophiles. Cellules prédit que les lymphocytes sont diffusion latérale fermée par rapport prodiffusion (SSC-FSC parcelle). Les basophiles sont identifiés comme CCR3 Salut lo CSE à partir des lymphocytes gated (SSC-CCR3-PE parcelle). Les basophiles sont analysés pour l'activation (CD63 Salut) dans la parcelle CD63-FITC-CCR3-PE. Le contrôle négatif est utilisé pour définir le seuil maximal des basophiles 2,5% restants CD63 Salut. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 4"> Figure 4. Degrés de couplage Déterminé des conjugués drogue. Du RI et les signaux UV montrent deux pics représentant les agrégats (élution à volume faible rétention) et les monomères (élution à un volume élevé de rétention) des médicaments-SAH conjugués. Les pourcentages de monomères et d'agrégats (déterminé à partir des signaux IR) et de leurs degrés de couplage sont représentés (n = 1). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 5"> Figure 5. Basophiles Activatile test. Résultats de la drogue conjugué activé échantillons, les contrôles négatifs, et les contrôles positifs sont indiqués dans le CD63-FITC-CCR3-PE parcelles (n = 1).

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

BAT est un bien établis mais pas encore la méthode couramment utilisée pour le diagnostic des IgE maladies allergiques 6,7. Pour hypersensibilité médicamenteuse, toutefois, son application est compromise tant que composés de faible poids moléculaire ne sont pas capables de réticuler récepteurs IgE, une condition préalable à l&#39;activation des basophiles 8. Par conséquent, les médicaments sous enquête doivent être couplés de manière covalente à des protéines porteuses appropriées (par exemple, HSA). Surtout, le degré de couplage (ie le nombre de molécules de médicament par protéine porteuse) doit être contrôlée afin de garantir l&#39;activité immunologique (ie IgE récepteurs de réticulation) de conjugués. Théoriquement, deux haptènes par molécule porteuse doit être suffisante pour le récepteur d&#39;IgE de réticulation et aussi peu que cinq molécules DF par HSA a été démontré pour déclencher la libération du médiateur dans un test basé sur des cellules 4. Les deux conjugués, PP-HSA et HSA-DF, ont été déterminés à afficher un degré de couplage suffisamment élevée (HPSEC) et d&#39;être immunologiquement actives rendant réactifs appropriés pour l&#39;utilisation des MTD. Une autre question peut être que les métabolites de médicaments peuvent jouer un rôle, comme un métabolite plutôt que de la molécule mère peut provoquer la réaction d&#39;hypersensibilité. En cas de DF, cette possibilité a été préalablement évalué en détail l&#39;aide de cinq Phase I majeurs métabolites et une variante de liaison 4. Les facteurs importants pour la maîtrise de la technique décrite notamment la qualité de l&#39;échantillon de sang (&lt;12 heures depuis la collecte de sang, le nombre de basophiles détectée&gt; 500) et l&#39;optimisation des conditions de stimulation (temps, dose). En outre, les soi-disant non-répondeurs qui n&#39;ont même pas réagir avec le contrôle positif (anticorps dirigé contre le récepteur des IgE) doivent être identifiés. Par conséquent, les critères de validation ont d&#39;inclure un anticorps anti-FceRI comme témoin positif. Un avantage important de l&#39;utilisation de conjugués drogue est le fait qu&#39;elles apparaissent non toxique, contrairement aux médicaments purs, comme le montre pour DF-HSA conjugué par la co-stimulation avec des anticorps anti-FceRI BAT 4. Pur DF, en revanche, affiche des effets cytotoxiques à une concentration de 1,25 mg / ml causant des problèmes avec l&#39;interprétabilité des MTD 9. Généralement, les tests de cytotoxicité potentielle est fortement recommandé pour tous les médicaments nouvellement produites conjugué. Ici, nous avons montré le potentiel de la PP-HSA conjugué utilisé dans les MTD pour révéler une hypersensibilité médiée par les IgE. En revanche, DF hypersensibilité n&#39;est pas associé avec les IgE démontrée par l&#39;absence d&#39;activation des basophiles en réponse à DF-HSA conjugué. Surtout, en cas d&#39;incertitude concernant un mécanisme IgE-médiée, conjugués doivent être évaluées pour l&#39;activité immunologique par des systèmes de test in vitro de cellules à base comme cela a été montré pour DF 4. Utilisation de la configuration décrite de conjuguer médicaments à bas poids moléculaire covalente à la protéine porteuse appropriée molécules d&#39;un certain nombre de réactions d&#39;hypersensibilité, y compris contre les drogues antibiotiques, d&#39;autres AINS, contraste radiologique des médias, des relaxants musculaires, des anesthésiques, etc peuvent être étudiés pour une participation d&#39;une IgE mécanisme. Par conséquent, les MTD peuvent servir comme un complément aux méthodes existantes de diagnostic (test cutané, des tests de provocation orale).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif / appareil </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm gel TSK -G2000SWXL colonne </td><td> Bioscience Tosoh </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifugeuse de paillasse </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Sel de sodium de diclofénac </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> Flow2 Kit CAST </td><td> Laboratoires Bühlmann </td><td> FK-CCR </td><td> Efficace kit CAST Juin 14, 2011 Flow2 est maintenant un sort de débit </td></tr><tr><td> HP1100 système HPLC </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albumine sérique humaine </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifugeuse de laboratoire </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-éthyl-N&#39;-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> Comprimés PBS </td><td> AppliChem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Dérivés propyphenazone </td><td> Département de Biologie Moléculaire, Université de Salzbourg, Autriche </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> L&#39;azide de sodium </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Carbonate acide de sodium </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Sodium hydroxyde </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Le phosphate de sodium </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Matrice de détecteurs Triple </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex personnels V-1 plus </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> 1012 Bain-marie </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

test d&#39;activation des basophiles pour l&#39;enquête des ige dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Des réactions d&#39;hypersensibilité contre le non-stéroïdiens anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que propyphenazone (PP) et le diclofénac (DF) peut se manifester comme de type I-like réactions allergiques 1. En pratique clinique, le diagnostic d&#39;hypersensibilité médicamenteuse est principalement effectué par les antécédents du patient, comme les tests cutanés ne sont pas fiables et les tests de provocation orale porte des risques mortels pour les 2 patients. Par conséquent, les preuves d&#39;un sous-jacent IgE pathomécanisme est difficile à obtenir. Ici, nous présentons une méthode in vitro basée sur l&#39;utilisation des basophiles humains issus de patients hypersensibles aux médicaments qui imite la réaction allergique effectrices in vivo. Comme les basophiles de drogue chez les patients allergiques porter des molécules d&#39;IgE spécifiques pour le médicament coupable, ils deviennent activés lors de réticulation du récepteur d&#39;IgE et la libération des molécules effectrices allergiques. L&#39;activation des basophiles peut être contrôlé par la détermination de la régulation positive de l&#39;expression en surface CD63 en utilisant la cytométrie en flux 3. Dans le cas de médicaments de faible poids moléculaire, conjugués sont conçus pour permettre la reticulation des récepteurs IgE sur les basophiles. Comme le montre la figure 1, deux représentants des AINS, PP et DF, sont liés de manière covalente à l&#39;albumine sérique humaine (HSA) par un groupe carboxyle réagir avec le groupe amino primaire des résidus lysine. DF porte un groupe carboxyle intrinsèques et, par conséquent, peut être utilisé directement 4, alors un groupe contenant carboxyle dérivé du PP a dû être synthétisés organochemically avant l&#39;étude 1. Le degré de couplage des composés de faible poids moléculaire de la molécule de protéine porteuse et leur répartition spatiale est important de garantir réticulation de deux molécules réceptrices IgE. Le protocole décrit ici s&#39;applique chromatographie d&#39;exclusion haute performance de taille (HPSEC) équipé d&#39;un indice de réfraction séquentielle (RI) et ultra violet (UV) système de détection pour la détermination du degré de couplage. Comme la méthodologie décrite peut être appliquée pour d&#39;autres drogues, le test d&#39;activation des basophiles (BAT) porte le potentiel d&#39;être utilisé pour la détermination des IgE dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse. Ici, nous déterminons que PP hypersensibilité IgE médiée et hypersensibilité DF comme non IgE médiée par BAT.

De test d&#39;activation des basophiles est un outil puissant pour la détection des allergies IgE-dépendante<em&gt; In vitro</em&gt;. Ici, un protocole optimisé pour le test d&#39;activation des basophiles est utilisée pour étudier hypersensibilité médicamenteuse. Une méthode pour la production efficace de covalentes drogue-protéine conjugués et leur caractérisation physico-chimique est décrite.

Test d&#39;activation des basophiles pour l&#39;enquête des IgE dans les mécanismes d&#39;hypersensibilité médicamenteuse

Les réactions d'hypersensibilité aux anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que la propyphenazone (PP) et le diclofénac (DF) peuvent se manifester sous la forme de réactions de type I...

L'objectif général de l'expérience suivante est de détecter l'hypersensibilité médicamentée médiée par les IgE à l'aide du test d'activation des basophiles, en utilisant des conjugués bien caractérisés entre un médicament et une protéine porteuse HAPinisée. Cette approche repose tout d'abord sur la liaison chimique du médicament, via un groupe carboxy intrinsèque ou introduit par voie organochimique, aux résidus de lysine de l'albumine sérique humaine. Ensuite, les conjugués sont caractérisés physico-chimiquement afin de déterminer précisément le degré de couplage, par chromatographie d'exclusion stérique haute performance (H-P-S-E-C) associée à une détection séquentielle par indice de réfraction et par ultraviolets.Ensuite, les conjugués médicamenteux bien caractérisés sont utilisés pour stimuler les basophiles de donneurs hypersensibles aux médicaments. En fin de compte, le test d'activation des basophiles, ou BAT, peut être utilisé pour évaluer les mécanismes impliquant l'IgE dans l'hypersensibilité médicamenteuse. Je m'appelle Michael Steiner, du groupe de recherche en allergologie de l'Université de Salzbourg en Autriche.Aujourd'hui, nous aimerions vous présenter une technique permettant d'évaluer le rôle des anticorps IgE spécifiques aux médicaments dans les réactions d'hypersensibilité aux médicaments. Ici, nous décrivons la procédure à l'aide de deux représentants largement utilisés de médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens, à savoir le propone et le diclofénac. Toutefois, cette méthode pourrait être utilisée pour le diagnostic de routine des allergies aux médicaments de type immédiat.En général, ajoutez 10 microlitres d'une solution mère fraîchement préparée de N-éthyl, N'-3-diméthylaminopropylcarbodiimide, ou EDC, à l'échantillon de propafénone ou PP. Vortexez l'échantillon pendant une minute. Ensuite, ajoutez 16,9 microlitres de solution d'albumine sérique humaine ou HSA à une concentration de 118 milligrammes par millilitre à l'échantillon, puis incubez l'échantillon pendant deux heures à température ambiante sous agitation à 300 tours par minute.Une fois l'agitation terminée, dialyser les échantillons trois fois contre deux litres de PBS pendant plusieurs heures à chaque fois, à quatre degrés Celsius. Puis centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante à 14 000 ×g, et recueillir le surnageant S contenant les AINS conjugués à l'HSA. Vérifier la présence de protéines dans le surnageant en réalisant une électrophorèse SDS-PAGE en utilisant des gels à 12 %.Charger environ 12 microgrammes de conjugué d'HSA dans un puits de gel pour l'analyse du taux de couplage des conjugués d'AINS par chromatographie d'exclusion stérique haute performance ou H-P-S-E-C. Diluez d'abord l'échantillon témoin d'HSA à une concentration de un milligramme par millilitre dans de l'eau déminéralisée. Pour l'étalonnage du détecteur, injectez 50 microlitres de solution témoin d'HSA.Ensuite, à l’aide d’une colonne TSK gel G 2000 SSW XL de 7,8 par 300 millimètres et d’un système de détection en ligne par indice de réfraction (IR) et par UV, calculez la constante d’indice de réfraction, notée K_IR, et la constante UV, notée K_UV, pour le détecteur. À l’aide de ces deux formules, diluez des étalons de dérivés de PP pour la H-P-S-E-C dans de l’eau déminéralisée à des concentrations de 5, 10 et 30 en quantités adaptées aux animaux afin de faciliter l’injection, puis calculez les valeurs moyennes de DN/DC du médicament et de DA/DC du médicament pour les deux étalons.À l’aide de ces deux formules, injectez maintenant les conjugués médicamenteux sur la H-P-S-E-C et déterminez leurs aires de pic en RI et en UV. Ensuite, à l’aide des deux mêmes équations, calculez la concentration des dérivés de PP et de l’HSA pour les échantillons inconnus. Étiquetez d’abord sept tubes de cytométrie en flux en fonction de leur contenu : témoin non coloré, témoin négatif, témoin positif et conjugués médicamenteux.Ensuite, pipetez 50 microlitres de tampon de stimulation des basophiles dans les vials réservés au témoin non coloré et au contrôle négatif. Ajoutez 50 microlitres de la solution anti-FC epsilon R un du kit flow two cast dans le vial du contrôle positif. Ajoutez maintenant du conjugué PP à une concentration de 0,02 à 20 microgrammes par millilitre dans les vials du conjugué médicamenteux selon une série de dilutions 1:10, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de stimulation et 50 microlitres de sang total au EDTA du patient dans chaque tube.Mélangez soigneusement les échantillons. Ensuite, pipetez 20 microlitres du flux. Ajoutez dans chacun des tubes contenant le conjugué médicamenteux et les témoins positif et négatif un réactif de coloration composé d'anticorps anti-CCR3 marqués avec du PE et d'anticorps anti-CD63 marqués avec du ZI, puis mélangez.Incubez à nouveau les échantillons pendant 45 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, pour arrêter la réaction, placez les échantillons sur de la glace pendant cinq minutes. Puis, lysez les érythrocytes en ajoutant deux millilitres du réactif de lyse Flow Two Cast à chaque flacon.Incuber les échantillons à l'abri de la lumière pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, après avoir mis en pellet les échantillons pendant cinq minutes à 500 ×g à température ambiante, décantez soigneusement le surnageant, resuspendez les cellules dans 500 µL de tampon de lavage pour cytométrie en flux, puis conservez les échantillons sur de la glace jusqu'à l'analyse en cytométrie en flux.Utilisez l'échantillon non coloré pour ajuster les paramètres de tension du cytomètre en flux. Ensuite, sélectionnez les cellules prédites comme étant des lymphocytes dans le tracé de dispersion latérale par rapport à la dispersion avant. Comme dans cette figure d'exemple, les basophiles sont d'abord identifiés comme ayant une forte expression de CCR trois et une faible dispersion latérale.Semblable à ce diagramme de dispersion. Après avoir sélectionné les cellules dans le tracé EPE ajusté, les basophiles activés peuvent être davantage identifiés par leur expression de CD63 marqué avec FITC. Après avoir fixé le seuil à un maximum de 2,5 % de basophiles CD63 élevé dans le témoin négatif, un échantillon peut être considéré comme positif pour l'activation des basophiles si plus de 5 % des basophiles sont CD63 élevé et si le MFI de l'échantillon divisé par le MFI du témoin négatif dépasse deux.Cette méthode évalue le BAt comme un outil utile pour détecter la protéine d'hypersensibilité aux médicaments dépendante des IgE. Des conjugués d'AINS sont utilisés pour l'activation des basophiles par H-P-S-E-C avec détection de l'agrégation par RI et UV. Le degré de couplage et le rendement effectif des conjugués sont déterminés comme illustré sur cette figure.43,5 % des conjugués DF sont restés monomériques avec un degré de couplage de 5,0 DF par HSA pour les agrégats. Un degré de couplage de 9,5 a été déterminé comme indiqué ici. On a montré que le conjugué PPP se composait de 68,5 % de monomères avec un degré de couplage de 21,2.Le degré de couplage des agrégats était de 27,9. Au total, le degré de couplage déterminé des conjugués DF était de 7,6 df et celui des conjugués PPP de 23,2. L'analyse BAT réalisée avec les conjugués dans des conditions optimisées permet d'étudier les réactions dépendantes des IgE dans l'hypersensibilité aux AINS.Comme illustré ici, seul le conjugué PP a été capable de déclencher l'activation des basophiles, visualisée par une surexpression. De l'expression membranaire du CD63. 20,6 % des basophiles ont été activés, caractérisés par un logarithme d'intensité de fluorescence, et l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) a augmenté d'un facteur de 4,9, passant de 386 pour le témoin négatif à 1893.En revanche, en utilisant le conjugué DF, seulement 3,1 % des basophiles ont été activés, ce qui est inférieur au seuil de 5 %. De plus, l'IMF a augmenté d'un facteur de seulement 1,1, passant de 197 pour le témoin négatif à 210. La validité du test est démontrée par une activation des basophiles inférieure à 5 % dans le témoin négatif.Deux, un décalage logarithmique de l'intensité de fluorescence d'une sous-population de basophiles et trois, plus de 50 % de basophiles activés pour le témoin positif. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des tests d'activation des basophiles, et surtout, de la façon de distinguer les réactions d'hypersensibilité aux médicaments médiées par les IgE de celles qui ne le sont pas. En outre, vous devriez comprendre comment étendre l'applicabilité du test d'activation des basophiles aux allergies médicamenteuses, au-delà de son utilisation déjà établie dans les allergies aux pollens, aux aliments et aux venins d'insectes.

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