Name: Une méthode pour létiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez une méthode d'étiquetage vasculaire chez la souris embryonnaire par injection de colorant fluorescent dans la veine faciale. Cette technique permet de visualiser la structure tridimensionnelle des vaisseaux sanguins.

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1. Marqué à la fluorescéine dextrane et GSL I-isolectine B 4 injections veine faciale à l'étiquette vascularisation embryonnaire <ol><li> Préparer FITC-dextran (50ug/mL) en tampon phosphate salin (PBS) ou GSL 1 - isolectine B 4 (20ug/200uL) dans du PBS dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et chaud à 37 ° C. Ajouter 100 ul de stock 1,25 vert rapide / PBS à la solution de FITC-dextran (volume total 1 ml) et 180uL de stock 1,25 Fast Green / PBS à l'une GSL - isolectine B 4 (200uL volume total), de sorte que la solution est visiblement bleu. </li><li> Disséquer E14.5 E18.5-embryons et le sac vitellin, en laissant le pédoncule allantoïdien (artère ombilicale et la veine) intacte. </li><li> Transfert des embryons à un nouveau plat Petrie (60 X 15 mm) et les plonger dans du PBS à température ambiante. </li><li> Position de l'embryon de fournir une vue sagittale de la tête / le visage. Utiliser la micro pince à disséquer délicatement saisir l'embryon, à la tête. </li><li> Utiliser une aiguille 30G, injecter 50ul FITC-dextran (50ug/mL) ou GSL 1 - isolectine B 4 (20ug de 200uL PBS) dans la veine faciale pointant l'aiguille vers l'arrière de la tête. </li><li> Lorsque le colorant est visible dans la veine ombilicale, retirez l'aiguille et séparer l'embryon de la tige allantoïdien (artère ombilicale et la veine). </li><li> Après injection, permettent de rester dans l'embryon du PBS à température ambiante pendant 2-3 minutes afin que le colorant circule dans tout l'embryon. </li></ol> 2. Whole-Mont d'analyse de la vascularisation cutanée <ol><li> Après avoir laissé le colorant de circuler dans tout l'embryon, prélever des échantillons de peau provenant de régions des membres, le dos et l'estomac, etc 8,9. </li><li> Laver la peau de l'échantillon dans du PBS froid, et de fixer à 4% PFA / PBS pendant 2 heures 8,9. Lavez 3 fois pendant 10 minutes dans chacune des 4 ml flacon transparent avec 2 ml de PBS froid. </li><li> Échantillon de peau Placer sur un microscope de diapositives et ajouter 100 l de montage de médias à chaque diapositive et un couvercle en verre. </li><li> Autoriser diapositives à sécher dans un espace de rangement sombre. </li><li> Passez à l'étape la section «Acquisition d'image» 2. </li></ol> 3. Multi-couleur étiquetage du thymus et de la vascularisation du cœur et des cellules périvasculaires cryocoupes (Continuer à partir de la section 1, l'étape 7) <ol><li> Embryon de toute «Flash geler» dans l'azote liquide. Les embryons peuvent être conservés et à -80 ° C jusqu'à l'analyse. </li><li> Alternativement, disséquer le thymus, les rincer dans du PBS 4 ° C, et fixer dans 2 ml de paraformaldéhyde à 4% (PFA) / PBS pendant 2 heures. Lavez 3 fois pendant 10 minutes dans du PBS froid, placez thymidine dans les PTOM, et de geler et de stocker jusqu'à utilisation à -80 ° C. </li><li> Pour cryosectioning, répartis dans les PTOM sur «bloquer» une section et monter l'embryon ou les organes disséqués / tissus pour la coupe. </li><li> Couper les tissus congelés en 10 um d'épaisseur et de recueillir des sections sur des lames. </li><li> Fixer des sections dans l'acétone pendant 5-10 minutes. Lavez 3 fois dans le froid du SCT. </li><li> Bloc de 10% de sérum d'âne / SCT dans une chambre humide à température ambiante. </li><li> Incuber pendant 1 heure sections-nuit avec 100 pi d'anticorps primaires dans une chambre humide à 4 ° C: dans cet exemple, nous utilisons rat anti-souris CD31 (1:100) à l'endothélium étiquette, et de chèvre anti-souris PDGFR-β (1:100) pour marquer les cellules périvasculaires. Il est utile pour couvrir les diapositives avec des bandes de Parafilm couper individuellement afin de s'assurer que l'anticorps est réparti uniformément sur toute la section. </li><li> Après incubation avec l'anticorps primaire, se laver les sections 3 fois dans le froid du SCT. Incuber avec 100 pi d'anticorps appropriés secondaire pendant 30 minutes minimum. </li><li> Lavez 3 fois dans le froid du SCT. Ajouter 100 ul de montage des médias à chaque diapositive et un couvercle en verre. </li><li> Autoriser diapositives à sécher dans un espace de rangement sombre. </li><li> Passez à la section «Acquisition d'image». </li></ol> 4. Multi-couleur étiquetage du thymus et de la vascularisation des cellules périvasculaires pour les sections vibratome (Continuer à partir de la section 1, l'étape 7) <ol><li> Disséquer les lobes du thymus de l'embryon et les rincer dans du PBS froid. </li><li> Fix thymus dans 4% PFA / PBS à température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Laver dans du PBS-Triton X (0,15%) 3 fois, 10 minutes et thymidine place dans une cartouche en plastique petit et plongez dans 4% à faible fondre agarose / PBS (~ 4 ° C). Le thymus doit être en contact avec le fond de la cartouche. </li><li> Autoriser agarose à solidifier sur la glace (3-5 minutes). Utilisez une lame de rasoir pour couper l'excès d'agarose. Ajoutez de la colle sur le bloc vibratome et adhérer au bloc de l'échantillon. </li><li> Ajouter PBS froid à bain d'eau jusqu'à ce vibratome l'échantillon et la lame sont immergés. </li><li> Réglez la vitesse et l'amplitude (amplitude élevée et à faible vitesse modérée est idéal pour les mous sections du thymus). L'amplitude doit être réduite si les articles rupture due à une agitation excessive. </li><li> Coupez 50 sections um. </li><li> Utiliser un pinceau, de recueillir des sections dans une microplaque de 24 puits dans du PBS froid. </li><li> Bloc sections dans 500 pl de sérum d'âne de 10% dans du PBS-Triton X (0,15%) pendant 30 minutes. </li><li> Sections Incuber pendant 8 heures à une nuit avec l'anticorps primaire, comme les anti-CD31 et anti-PDGFR-β, Dans un endroit couvert de 24 puits de microplaques. </li><li> Lavez 3 fois en PBS-Triton X (0,15%) sur un total de 8 heures à 4 ° C. </li><li> Sections de bloc dans le sérum d'âne de 10% dans du PBS-Triton X (0,15%) pendant 30 minutes. </li><li> Incuber sections pendant 8 heures pour une nuit à 4 ° C avec les anticorps appropriés secondaire. </li><li> Lavez 3 fois en PBS-Triton X (0,15%) sur un total de 8 heures à 4 ° C. </li><li> Re-fixer les échantillons dans 4% des PFA / PBS pendant 30 minutes sur la glace. </li><li> Lavez 3 fois en PBS-Triton X (0,15%) de plus de 30 minutes sur la glace. </li><li> Déshydrater les échantillons à travers un gradué MeOH / PBS-Triton série X: 25% de MeOH, MeOH 50%, 75% MeOH, et 100% de MeOH à 10 minutes pour chaque étape. Remplacer MeOH 100% avec MeOH frais après 10 minutes et incuber pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Dans un récipient en verre, mélanger Babb (Benzyl Alcool: Benzyl Benzoate) dans un rapport 1:2. Combinez BABB avec MeOH pour une concentration finale de 50% et BABB MeOH 50%. Incuber l'échantillon à Babb: MeOH pendant 10-15 minutes. </li><li> Transférer l'échantillon dans un récipient en verre à 100% et BABB incuber pendant 10-15 minutes ou jusqu'à ce que dégagé, à température ambiante. </li><li> Remplissez glisser la dépression (0,7 mm de profondeur) avec BABB 100% frais et déguster le transfert vers le côté. Ajouter couvercle en verre (n ° 1.5) et sceller avec 2-3 couches de vernis à ongles. Laisser durcir le vernis à ongles dans le noir à température ambiante, puis stocker l'échantillon à 4 ° C. Remarque: Les diapositives doivent être complètement scellé avant l'acquisition de l'image confocale. Les images doivent être acquises dans les 12-24 heures, comme des colorants fluorescents peuvent s'estomper à Babb. </li><li> Passez à la section «Acquisition d'image». </li></ol> 5. L'acquisition des images <ol><li> Image 10 um coupes congelées avec un microscope confocal à l'aide du Plan-Apochromat 20X/0.8 objectif (512 x 512 pixels) avec 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectine B 4), 543 -, et des lignes laser 633-nm. </li><li> Acquérir confocale z-sections de la peau monter l'ensemble et 50 um d'agarose-embedded sections en utilisant le Plan-Apochromat 10X/0.4 objectif (512 x 512 pixels) avec 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectine B 4), 543 -, et 633 nm lignes laser. Serial Z-sections doivent être prélevés de manière séquentielle au 1-micron pour chaque canal respectif. </li><li> Reconstruire série Z-sections à l'aide Zeiss AxioVision 4.6 ou d'autres logiciels d'analyse d'image. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Marquage efficace de la vascularisation embryonnaire, est essentielle pour évaluer les défauts des vaisseaux sanguins chez des souris embryonnaire. La figure 1 montre un marquage spécifique des vaisseaux sanguins E16.5 thymus (1A-B) et co-marquage avec CD31 (1B), en plus de la coloration des ventricules droit et gauche (1E-F), respectivement. Le GSL I-B 4 isolectine protocole pour cryocoupes comme décrit dans les sections 1, 3 et 5 a été utilisée dans ces expériences. Whole-Mont étiquetage du réseau vaisseau sanguin cutané sur la souris E16.5, en utilisant les protocoles décrits dans les sections 1, 2 et 5 est représentée à la figure 1C-D. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3267/3267fig1.jpg"> Figure 1 Légende. FITC GSL I - isolectine B 4 injections veine faciale dans E16.5 embryons de souris. a. Cryosection du thymus embryonnaire suivant l'injection. b. Fusion de CD31 co-marquage avec isolectine B 4. C. et D. entiers de montage de l'injection de la peau vascularisation embryonnaire suivant. e. et f. Cryosection d'embryon coeur e. (à droite ventricule) f. (ventricule gauche) après l'injection.

<ol><li>Cuddihy, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+cross-talk+within+the+neonatal+murine+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus.</a> Blood. 113, 2723-2731 (2009).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+of+VEGF-A+in+thymus+epithelium+disrupts+thymus+blood+vessel+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).</li>
<li>Muller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+origin+of+perivascular+mesenchyme+in+the+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).</li>
<li>Foster, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neural+crest-derived+cells+in+the+embryonic+and+adult+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus.</a> J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+CCR7-+and+CCR9-mediated+chemokine+signals+in+prevascular+fetal+thymus+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization.</a> Blood. 108, 2531-2539 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+signals+regulate+a+wave+of+Hedgehog+activation+that+is+essential+for+coronary+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development.</a> Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).</li>
<li>Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+critical+for+maintenance+of+the+adult+coronary+vasculature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice.</a> J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Murphy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Notch4+signaling+induces+hallmarks+of+brain+arteriovenous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).</li>
</ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Whole-monter et PECAM-1 (CD31) sur la coloration des sections sont les méthodes classiques pour l&#39;étiquetage de la vascularisation de souris embryonnaires. Ces méthodes nécessitent l&#39;utilisation d&#39;immunofluorescence directe et / ou indirects, et des détergents pour perméabiliser les tissus de la souris. Cela s&#39;avère un processus plutôt rapide. Ici, nous avons employé FITC-dextran ou isolectine B 4 injections veine faciale pour marquer directement la vascularisation embryonnaire, éliminant ains...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> FITC-dextran </td><td> Sigma </td><td> FD150S-1G </td></tr><tr><td> Marqué à la fluorescéine GSL 1 - isolectine B 4 </td><td> Vector Laboratories </td><td> FL-1201 </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> MP Biomédical </td><td> 195178 </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Fluka </td><td> 76240 </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Optimal composé température de coupe (PTOM </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> L&#39;acétone </td><td> JT Baker </td><td> 9006-33 </td></tr><tr><td> Sérum âne </td><td> Jackson </td><td> 017-000-121 </td></tr><tr><td> rat anti-souris CD31, </td><td> BD Pharmingen </td><td> 558736 </td></tr><tr><td> chèvre anti-souris PDGFR-β </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF1042 </td></tr><tr><td> d&#39;âne anti-CD31 de rat Alexa 647 (Invitrogen) </td><td> Biolegend </td><td> 102516 </td></tr><tr><td> d&#39;âne anti-chèvre Alexa 594 (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> A11058 </td></tr><tr><td> Triton X -100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td></tr><tr><td> Low Melt agarose / PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9414-25G </td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A413-4 </td></tr><tr><td> Alcool benzylique </td><td> Acros scientifique </td><td> 148390010 </td></tr><tr><td> Benzoate de benzyle </td><td> Acros scientifique </td><td> 105860010 </td></tr><tr><td> Dépression diapositives </td><td> Fisher Scientific </td><td> S175201 </td></tr><tr><td> Fluorogel </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 17985-10 </td></tr><tr><td> Couverture en verre (22x22) -1,5 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 152222 </td></tr><tr><td> Zeiss LSM 510 Meta microscope confocal </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Micro pince à disséquer </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td></tr><tr><td> Parafilm n ° OM992 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-16 </td></tr><tr><td> 12 et 24 ainsi microplaques </td><td> Evergreen Scientific </td><td> 222-8044-01F </td></tr><tr><td> Lames de microscope Superfrost / Plus </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 4mL flacons clairs </td><td> Scientifique national </td><td> B7800-2 </td></tr></tbody></table>

une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

La mise en place d&#39;un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnelle est une partie essentielle de l&#39;organogenèse, et est requis pour la fonction des organes optimale. Par exemple, dans la formation adéquate vascularisation du thymus et de structuration est indispensable pour l&#39;entrée dans l&#39;organe thymocytes matures et les cellules T de sortie vers la périphérie. La disposition spatiale des vaisseaux sanguins dans le thymus est dépendante des signaux du micro-environnement local, à savoir les cellules épithéliales thymiques (TEC). Plusieurs rapports récents suggèrent que la perturbation de ces résultats signaux dans la cuve 1,2 thymus défauts sang. Des études précédentes ont décrit les techniques utilisées pour étiqueter les 1,2 vascularisation néonatale et adulte du thymus. Nous démontrons ici une technique de marquage des vaisseaux sanguins dans le thymus embryonnaire. Cette méthode combine l&#39;utilisation de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) lectine Simplicifolia I (GSL 1 - isolectine B 4) injections veine faciale et CD31 coloration des anticorps pour identifier les structures vasculaires du thymus et PDGFR-β à l&#39;étiquette du thymus périvasculaire mésenchyme 3-5. L&#39;option d&#39;utiliser cryocoupes ou sections vibratome est également fourni. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les défauts du thymus vasculaire, ce qui est essentiel pour définir les rôles des molécules dérivées de TCE dans la formation des vaisseaux sanguins du thymus. Comme la méthode des étiquettes de la vascularisation entier, il peut aussi être utilisée pour analyser les réseaux vasculaires dans de multiples organes et de tissus dans l&#39;embryon, y compris la peau et le cœur 6-10.

Cet article décrit une méthode pour l&#39;étiquetage de peau embryonnaire et les vaisseaux sanguins du thymus.

Une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

L'établissement d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnels est une étape essentielle de l'organogenèse et est indispensable au fonctionnement optimal des organes. Par exemple, dans...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les effets de mutations génétiques spécifiques sur le développement et la structure vasculaires. Cela est réalisé en dissociant ensemble l'embryon et les tissus extra-embryonnaires afin d'obtenir un échantillon approprié pour l'injection. Ensuite, la veine faciale est injectée avec un colorant fluorescent afin de marquer la vascularisation intacte.Ensuite, l'embryon est préparé pour l'analyse. Enfin, des montages entiers ou des sections de vaisseaux marqués sont imagés afin de révéler la structure tridimensionnelle de la vascularisation normale, basée sur la microscopie d'immunofluorescence de montages entiers ou de sections tissulaires. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque je souhaitais déterminer le stade développemental auquel la vascularisation périphérique se connecte au thymus par angiogenèse.Pour commencer, préparez du dextran FXI ou du GS L un I sélectine B quatre dans du PBS dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre, ajoutez 100 microlitres de solution mère de vert rapide 1,25 millimolaire dans du PBS au dextran FTSE, ou 180 microlitres au GS L un. I sélectionnez B quatre de sorte que les solutions soient visiblement bleues. Ensuite, réchauffez le tube à 37 degrés Celsius.Disséquez les embryons de E 14,5 à E 18,5 ainsi que les sacs vitellins ensemble, en laissant le pédoncule allantoïque intact. Transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri et immergez-les dans du PBS à température ambiante. Ensuite, positionnez un embryon afin d'obtenir une vue sagittale du visage.Ensuite, à l’aide de pinces de dissection microchirurgicales, saisissez délicatement l’embryon par la tête. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez 50 microlitres de dextran FXI ou de GS L un I selectine B quatre dans la veine faciale, en orientant l’aiguille vers l’arrière de la tête. Lorsque le colorant est visible dans la veine ombilicale, retirez l’aiguille et séparez l’embryon du lan.Laisser l'embryon dans le PBS à température ambiante pendant deux à trois minutes afin que le colorant circule dans tout l'embryon. Après avoir permis au colorant de circuler dans tout l'embryon, prélever des échantillons de peau à partir des régions des membres, du dos et de l'abdomen.Lavez les échantillons de peau dans du PBS froid et fixez-les dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant deux heures. Rincez-les ensuite trois fois pendant 10 minutes chacune dans des vials transparents de quatre millilitres avec deux millilitres de PBS froid. Placez les échantillons de peau sur des lames de microscope et ajoutez 100 microlitres de milieu de montage ainsi qu'une lame couvre-objet à chaque lame.Laisser sécher les lames à l’obscurité avant l’imagerie. Un éclaircissage dans le BABB et une imagerie confocale ultérieure peuvent être effectués pour obtenir des images de plus haute résolution du réseau vasculaire cutané. Pour préparer les tissus en vue de coupes en cryostat, congeler rapidement les embryons entiers dans l’azote liquide. Étaler du OCT sur un bloc de coupe et monter l’embryon.Découper le tissu congelé en sections de 10 microns d'épaisseur et les déposer sur des lames. Fixer les sections dans de l'acétone pendant cinq à dix minutes, puis les laver trois fois dans du tampon TBS froid contenant 10 % de sérum de baudet dans du TBS, dans une chambre humide. À température ambiante, ajouter 100 microlitres d'anticorps primaire sur chaque section.Dans cet exemple, nous utilisons un anticorps de rat anti-CD 31 humain pour marquer l'endothélium et un anticorps de chèvre anti-P-D-G-F-R bêta humain pour marquer les cellules péri-vasculaires afin de s'assurer que l'anticorps est uniformément réparti sur la section. Recouvrir les lames de bandes de parafilm découpées individuellement. Incuber les lames pendant une heure à toute la nuit dans une chambre humide à quatre degrés Celsius.Ensuite, laver les sections trois fois dans du TBS froid. Incuber avec 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés pendant un minimum de 30 minutes. Enfin, laver trois fois dans du TBS froid. Ajouter 100 microlitres de milieu de montage et une lame couvre-objet à chaque lame.Laisser sécher les lames à l'obscurité. Pour la coupe en vibram, disséquer les lobes du thymus à partir d'embryons et rincer dans du PBS froid. Fixer le tissu dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant deux heures à température ambiante.Après avoir lavé les échantillons dans du PBS Triton X, remplissez une petite cartouche en plastique avec 4 % d'agarose à bas point de fusion. Immergez les échantillons dans l'agarose liquide, en veillant à ce que le tissu soit en contact avec le fond de la cartouche. Laissez l'agarose durcir sur de la glace.Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper l'excès d'agarose. Appliquez de la colle sur le bloc VIBRAM et fixez l'échantillon sur le bloc. Versez du PBS froid dans le bain d'eau Vibram jusqu'à ce que l'échantillon et la lame soient immergés.Régler la vitesse et l'amplitude. L'amplitude doit être réduite. Si les sections se fragmentent en raison d'une agitation excessive, découper 50 sections de tissu.Ensuite, à l’aide de pinces, transférez les sections dans du PBS froid dans une plaque microtitration 24 puits. Bloquez les sections dans 500 microlitres de sérum de baudet à 10 % dans du PBS Triton X pendant 30 minutes. Après ajout des anticorps primaires tels que l’anti-CD31 et l’anti-P-D-G-F-R bêta, incubez de huit heures à toute la nuit dans une plaque microtitration couverte à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez trois fois dans du PBS Triton X sur un total de huit heures à quatre degrés Celsius.Après avoir de nouveau bloqué les sections et les avoir incubées dans les anticorps secondaires, laver les échantillons trois fois dans du PBS Triton X pendant une durée totale de huit heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, recaractériser les échantillons dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant 30 minutes sur de la glace et les laver trois fois supplémentaires dans du PBS Triton X pendant 30 minutes sur de la glace. Déshydrater les échantillons à l’aide d’une série progressive de méthanol dans du PBS Triton X pendant 10 minutes à chaque étape.Ensuite, remplacez le méthanol à 100 % par du méthanol frais et incubez pendant une heure à température ambiante. Placez l'échantillon dans une lame creuse en verre et recouvrez-le d'une solution à un pour un de BABB et de méthanol. Incubez les échantillons de 10 à 15 minutes.Ensuite, remplacez la solution par du BABB à 100 % et incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes ou jusqu'à clarification. Ajoutez une lamelle et scellez avec deux à trois couches de vernis à ongles. Laissez durcir le vernis à ongles à l'abri de la lumière et à température ambiante.L'échantillon peut être conservé à quatre degrés Celsius, mais vous devez acquérir les images dans un délai de 12 à 24 heures. Imager des sections congelées de 10 micromètres au microscope confocal en utilisant l'objectif plan Aper chromat 20 fois 0,8 avec des lignes laser à 633, 488 et 543 nanomètres ; acquérir des sections Z confocales d'un micron sur des sections incluses dans de l'aros de 50 micromètres en utilisant l'objectif plan Aper chromat 10 x 0,4 avec des lignes laser à 488, 543 et 633 nanomètres ; reconstruire les sections Z en série à l'aide du logiciel d'analyse d'image Zeiss AIA Vision 4.6 ou tout autre logiciel d'analyse d'image. Un marquage efficace de la vasculature embryonnaire est essentiel pour évaluer les défauts des vaisseaux sanguins chez les souris embryonnaires. Ces figures montrent un marquage spécifique des vaisseaux sanguins du thymus à E16,5 et un double marquage de GSL1 et de la sélectine I.B quatre embryons injectés avec le CD 31 ainsi que coloration des ventricules droit et gauche. Le protocole GSL un I-sélectine B quatre pour coupes cryostatiques a été utilisé dans ces expériences. L'étiquetage en montage complet du réseau vasculaire cutané chez des souris E 16,5 est montré ici à la suite de cette procédure.D'autres méthodes, comme l'étiquetage simultané des cellules stromales et des cellules sanguines avec le réseau vasculaire, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : Comment les cellules sanguines et les cellules stromales interagissent-elles avec le réseau vasculaire dans l'embryon de souris dans des conditions normales et pathologiques ?

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l'embryon.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans...

Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Cellule étiquetage et l&#39;injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Ce protocole décrit une technique permettant d’évaluer les modifications du système vasculaire maternel pendant la grossesse chez la souris. À l’aide de méthodes stéréologiques, le remodelage des artères spirales déciduales est évalué quantitativement et les résultats confirmés qualitativement à l’aide de l’immunohistochimie.

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Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .

Visualisation et analyse quantitative de l&#39;angiogenèse embryonnaire dans<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

L’examen échocardiographique est fréquemment utilisée chez les souris. Appareils à ultrasons à haute résolution coûteux ont été développés à cet effet. Ce protocole décrit une procédure échocardiographique abordable combinée avec histologique morphométrique des analyses pour déterminer la morphologie cardiaque.

Examen échocardiographique et histologique de morphologie cardiaque chez la souris

Nous présentons les protocoles afin d’examiner le développement de coeur de souris au microscope de toute monture épifluorescente sur des embryons de souris disséqués de ventriculaire spécifiques MLC-2v-tdTomato journaliste souris knock-in. Cette méthode nous permet de directement visualiser chaque étape de la formation ventriculaire au cours du développement de coeur de souris sans fastidieuses méthodes histochimiques.

Analyse du développement de la chambre cardiaque durant l’embryogenèse de souris à l’aide de toute monture épifluorescence

L’article décrit un protocole rapide pour l’étiquetage des vaisseaux sanguins dans un poisson téléostéen par perfusion cardiaque de DiI dilué dans fixatif, en utilisant Medaka (Oryzias latipes) comme un modèle et en se concentrant sur le cerveau et le tissu hypophysaire.

Étiquetage des vaisseaux sanguins dans le cerveau de Teleost et l’hypophyse utilisant la perfusion cardiaque avec un DiI-fixatif

Nous démontrons l’induction chimique de la dilatation des gros vaisseaux sanguins chez la souris comme modèle pour l’étude de la dysfonction cérébrovasculaire, qui peut être utilisé pour la modélisation de la démence vasculaire et de la maladie d’Alzheimer. Nous démontrons également la visualisation du système vasculaire en injectant un composé de caoutchouc de silicone et en fournissant un guidage visuel clair pour mesurer les changements dans la taille des vaisseaux sanguins.

Une approche visuelle pour induire la dolichoectasie chez la souris afin de modéliser le dysfonctionnement cérébrovasculaire médié par les grands vaisseaux

Ce protocole introduit une méthode rapide pour l’imagerie vasculaire tridimensionnelle quantitative à montage entier à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière. L’efficacité de la méthode est démontrée à l’aide du système d’artère de l’arc pharyngé du modèle d’embryon de poulet, avec des forces hémodynamiques quantifiées par la dynamique des fluides numérique.

Imagerie rapide à haute résolution de l’ensemble du système vasculaire de petits animaux pour des études quantitatives

Découvrez une méthode d'étiquetage vasculaire chez la souris embryonnaire par injection de colorant fluorescent dans la veine faciale. Cette technique permet de visualiser la structure tridimensionnelle des vaisseaux sanguins.

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