Une méthode pour l'étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer les effets de mutations génétiques spécifiques sur le développement et la structure vasculaires. Cela est réalisé en dissociant ensemble l'embryon et les tissus extra-embryonnaires afin d'obtenir un échantillon approprié pour l'injection. Ensuite, la veine faciale est injectée avec un colorant fluorescent afin de marquer la vascularisation intacte.

Ensuite, l'embryon est préparé pour l'analyse. Enfin, des montages entiers ou des sections de vaisseaux marqués sont imagés afin de révéler la structure tridimensionnelle de la vascularisation normale, basée sur la microscopie d'immunofluorescence de montages entiers ou de sections tissulaires. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque je souhaitais déterminer le stade développemental auquel la vascularisation périphérique se connecte au thymus par angiogenèse.

Pour commencer, préparez du dextran FXI ou du GS L un I sélectine B quatre dans du PBS dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre, ajoutez 100 microlitres de solution mère de vert rapide 1,25 millimolaire dans du PBS au dextran FTSE, ou 180 microlitres au GS L un. I sélectionnez B quatre de sorte que les solutions soient visiblement bleues. Ensuite, réchauffez le tube à 37 degrés Celsius.

Disséquez les embryons de E 14,5 à E 18,5 ainsi que les sacs vitellins ensemble, en laissant le pédoncule allantoïque intact. Transférez les embryons dans une nouvelle boîte de Pétri et immergez-les dans du PBS à température ambiante. Ensuite, positionnez un embryon afin d'obtenir une vue sagittale du visage.

Ensuite, à l’aide de pinces de dissection microchirurgicales, saisissez délicatement l’embryon par la tête. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez 50 microlitres de dextran FXI ou de GS L un I selectine B quatre dans la veine faciale, en orientant l’aiguille vers l’arrière de la tête. Lorsque le colorant est visible dans la veine ombilicale, retirez l’aiguille et séparez l’embryon du lan.

Laisser l'embryon dans le PBS à température ambiante pendant deux à trois minutes afin que le colorant circule dans tout l'embryon. Après avoir permis au colorant de circuler dans tout l'embryon, prélever des échantillons de peau à partir des régions des membres, du dos et de l'abdomen.

Lavez les échantillons de peau dans du PBS froid et fixez-les dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant deux heures. Rincez-les ensuite trois fois pendant 10 minutes chacune dans des vials transparents de quatre millilitres avec deux millilitres de PBS froid. Placez les échantillons de peau sur des lames de microscope et ajoutez 100 microlitres de milieu de montage ainsi qu'une lame couvre-objet à chaque lame.

Laisser sécher les lames à l’obscurité avant l’imagerie. Un éclaircissage dans le BABB et une imagerie confocale ultérieure peuvent être effectués pour obtenir des images de plus haute résolution du réseau vasculaire cutané. Pour préparer les tissus en vue de coupes en cryostat, congeler rapidement les embryons entiers dans l’azote liquide. Étaler du OCT sur un bloc de coupe et monter l’embryon.

Découper le tissu congelé en sections de 10 microns d'épaisseur et les déposer sur des lames. Fixer les sections dans de l'acétone pendant cinq à dix minutes, puis les laver trois fois dans du tampon TBS froid contenant 10 % de sérum de baudet dans du TBS, dans une chambre humide. À température ambiante, ajouter 100 microlitres d'anticorps primaire sur chaque section.

Dans cet exemple, nous utilisons un anticorps de rat anti-CD 31 humain pour marquer l'endothélium et un anticorps de chèvre anti-P-D-G-F-R bêta humain pour marquer les cellules péri-vasculaires afin de s'assurer que l'anticorps est uniformément réparti sur la section. Recouvrir les lames de bandes de parafilm découpées individuellement. Incuber les lames pendant une heure à toute la nuit dans une chambre humide à quatre degrés Celsius.

Ensuite, laver les sections trois fois dans du TBS froid. Incuber avec 100 microlitres des anticorps secondaires appropriés pendant un minimum de 30 minutes. Enfin, laver trois fois dans du TBS froid. Ajouter 100 microlitres de milieu de montage et une lame couvre-objet à chaque lame.

Laisser sécher les lames à l'obscurité. Pour la coupe en vibram, disséquer les lobes du thymus à partir d'embryons et rincer dans du PBS froid. Fixer le tissu dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant deux heures à température ambiante.

Après avoir lavé les échantillons dans du PBS Triton X, remplissez une petite cartouche en plastique avec 4 % d'agarose à bas point de fusion. Immergez les échantillons dans l'agarose liquide, en veillant à ce que le tissu soit en contact avec le fond de la cartouche. Laissez l'agarose durcir sur de la glace.

Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper l'excès d'agarose. Appliquez de la colle sur le bloc VIBRAM et fixez l'échantillon sur le bloc. Versez du PBS froid dans le bain d'eau Vibram jusqu'à ce que l'échantillon et la lame soient immergés.

Régler la vitesse et l'amplitude. L'amplitude doit être réduite. Si les sections se fragmentent en raison d'une agitation excessive, découper 50 sections de tissu.

Ensuite, à l’aide de pinces, transférez les sections dans du PBS froid dans une plaque microtitration 24 puits. Bloquez les sections dans 500 microlitres de sérum de baudet à 10 % dans du PBS Triton X pendant 30 minutes. Après ajout des anticorps primaires tels que l’anti-CD31 et l’anti-P-D-G-F-R bêta, incubez de huit heures à toute la nuit dans une plaque microtitration couverte à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez trois fois dans du PBS Triton X sur un total de huit heures à quatre degrés Celsius.

Après avoir de nouveau bloqué les sections et les avoir incubées dans les anticorps secondaires, laver les échantillons trois fois dans du PBS Triton X pendant une durée totale de huit heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, recaractériser les échantillons dans du PBS contenant 4 % de paraldéhyde pendant 30 minutes sur de la glace et les laver trois fois supplémentaires dans du PBS Triton X pendant 30 minutes sur de la glace. Déshydrater les échantillons à l’aide d’une série progressive de méthanol dans du PBS Triton X pendant 10 minutes à chaque étape.

Ensuite, remplacez le méthanol à 100 % par du méthanol frais et incubez pendant une heure à température ambiante. Placez l'échantillon dans une lame creuse en verre et recouvrez-le d'une solution à un pour un de BABB et de méthanol. Incubez les échantillons de 10 à 15 minutes.

Ensuite, remplacez la solution par du BABB à 100 % et incubez à température ambiante pendant 10 à 15 minutes ou jusqu'à clarification. Ajoutez une lamelle et scellez avec deux à trois couches de vernis à ongles. Laissez durcir le vernis à ongles à l'abri de la lumière et à température ambiante.

L'échantillon peut être conservé à quatre degrés Celsius, mais vous devez acquérir les images dans un délai de 12 à 24 heures. Imager des sections congelées de 10 micromètres au microscope confocal en utilisant l'objectif plan Aper chromat 20 fois 0,8 avec des lignes laser à 633, 488 et 543 nanomètres ; acquérir des sections Z confocales d'un micron sur des sections incluses dans de l'aros de 50 micromètres en utilisant l'objectif plan Aper chromat 10 x 0,4 avec des lignes laser à 488, 543 et 633 nanomètres ; reconstruire les sections Z en série à l'aide du logiciel d'analyse d'image Zeiss AIA Vision 4.6 ou tout autre logiciel d'analyse d'image. Un marquage efficace de la vasculature embryonnaire est essentiel pour évaluer les défauts des vaisseaux sanguins chez les souris embryonnaires. Ces figures montrent un marquage spécifique des vaisseaux sanguins du thymus à E16,5 et un double marquage de GSL1 et de la sélectine I.

B quatre embryons injectés avec le CD 31 ainsi que coloration des ventricules droit et gauche. Le protocole GSL un I-sélectine B quatre pour coupes cryostatiques a été utilisé dans ces expériences. L'étiquetage en montage complet du réseau vasculaire cutané chez des souris E 16,5 est montré ici à la suite de cette procédure.

D'autres méthodes, comme l'étiquetage simultané des cellules stromales et des cellules sanguines avec le réseau vasculaire, peuvent être utilisées afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que : Comment les cellules sanguines et les cellules stromales interagissent-elles avec le réseau vasculaire dans l'embryon de souris dans des conditions normales et pathologiques ?